CN115583991A - B细胞表位肽及其应用和含有该b细胞表位肽的疫苗、药物组合物和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种B细胞表位肽及其应用和含有该B细胞表位肽的疫苗、药物组合物和检测试剂盒,属于生物技术领域。所述B细胞表位肽包括选自下述a)至c)的至少一种:a)、氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条;b)、对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽进行一个或多个氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽,所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽相同或基本相同的功能;c)、由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。本发明提供的B细胞表位肽具有强的免疫原性和免疫持久性,作为疫苗具有优异的抗SARS‑CoV‑2病毒能力,医用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种B细胞表位肽,还涉及使用所述B细胞表位肽的应用,以及由此得到的含有该B细胞表位肽的疫苗和含有该B细胞表位肽的药物组合物以及含有该B细胞表位肽的抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
背景技术
目前在研的新型冠状病毒的疫苗种类主要有:灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、蛋白亚单位疫苗及重组病毒载体疫苗。其中,减毒活疫苗和灭活疫苗虽然效果较好,且制备工艺简单,但存在免疫时间短、保存条件高等缺点。亚单位疫苗和重组基因疫苗虽然生产简单、免疫效果良好,但也存在免疫时间短的问题,且其开发周期较长,不能适应病毒的快速变异。核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗,由于是外源性的,持续表达外源性抗原可能产生一些不良后果,而且核酸疫苗容易被血浆和组织种核糖核酸酶降解,通常需要很高的剂量才能达到一定的免疫效果,一方面导致生产成本高,病人用药费用高,负担重;另一方面高剂量用药引入的杂质更多,可能会导致毒副作用增大,从而增加了临床风险。重组病毒载体疫苗如腺病毒疫苗在运输存贮上有着严格的条件限制,且部分人接种后存在严重不良反应,限制了其应用。因此,进一步开发免疫原性好、安全、有效且易运输存贮的针对新型冠状病毒的疫苗,对于保护人民健康与国家安全具有重要意义。
发明内容
针对以上现有技术中的问题,本发明提供了一种B细胞表位肽及其应用,同时提供了含有该B细胞表位肽的疫苗和含有该B细胞表位肽的药物组合物以及含有该B细胞表位肽的抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
为实现上述目的,本发明具体通过以下技术实现:
一种B细胞表位肽,所述B细胞表位肽包括选自下述a)至c)的至少一种:
a)、氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条;
b)、对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽进行一个或多个氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽,所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽相同或基本相同的功能;
c)、由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
进一步地,所述B细胞表位肽包括氨基酸序列为SEQ ID NO.4或所示的多肽。更进一步地,所述B细胞表位肽还包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的多肽中的一条或多条。
进一步地,所述B细胞表位肽包括由氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的多肽形成的多聚体多肽。所述多聚体多肽为4条氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的多肽通过3个赖氨酸连接形成的同源四聚体。更进一步地,所述B细胞表位肽还包括由氨基酸序列为SEQ IDNO.2 至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
进一步地,所述B细胞表位肽采用FmoC固相多肽合成法合成得到。
另外,本发明提供了一种核酸序列,所述核酸序列系列用于编码如上所述的B细胞表位肽。
另外,本发明提供了一种载体,所述载体含有如上所述的核酸序列。
另外,本发明提供了如上所述的B细胞表位肽在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疫苗或药物以及检测抗新型冠状病毒抗体中的应用。
另外,本发明提供了一种疫苗,所述疫苗包含如上所述的B细胞表位肽作为活性成分。
进一步地,所述疫苗还包含药学上可接受的辅剂。
另外,本发明提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含由如上所述的B细胞表位肽免疫动物得到的抗体和药学上可接受的辅剂。
进一步地,所述抗体为中和抗体。
另外,本发明提供了一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒,所述抗体检测试剂盒包含如上所述的B细胞表位肽。
有益效果:
1、本发明提供的B细胞表位肽(Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252)具有强的免疫原性和免疫持久性,可诱导机体产生相应的免疫保护反应,显著提高针对S蛋白的中和抗体的滴度,有效阻断新型冠状病毒S蛋白与宿主细胞受体ACE2结合,作为疫苗具有很强的抗SARS-CoV-2病毒的能力,医用前景良好。
2、本发明的B细胞表位肽使用多肽序列作为免疫原,并未使用灭活病毒或弱毒病毒,不存在使宿主感染病毒的副作用,具有更高的安全性。
3、本发明的B细胞表位肽的制备方法非常成熟和完善,制成相应的生物医药制品也非常容易,因此,本发明具有很好的实际应用与推广意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2的B细胞表位肽Pep-916的质谱鉴定结果图;
图2为本发明实施例2的B细胞表位肽Pep-1510的质谱鉴定结果图;
图3为本发明实施例2的B细胞表位肽Pep-233的质谱鉴定结果图;
图4为本发明实施例2的B细胞表位肽Pep-252的质谱鉴定结果图;
图5为本发明实施例3的阳性马血清和阴性马血清中B细胞表位肽Pep-252的特异性抗体滴度;
图6为本发明实施例3的阳性马血清中B细胞表位肽Pep-252和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图7为本发明实施例3的阳性马血清和阴性马血清中B细胞表位肽Pep-233的特异性抗体滴度;
图8为本发明实施例3的阳性马血清中B细胞表位肽Pep-233和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图9为本发明实施例3的阳性马血清和阴性马血清中B细胞表位肽Pep-1510的特异性抗体滴度;
图10为本发明实施例3的阳性马血清中B细胞表位肽Pep-1510和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图11为本发明实施例3的阳性鼠血清和阴性鼠血清中B细胞表位肽Pep-1510的特异性抗体滴度;
图12为本发明实施例3的阳性鼠血清中B细胞表位肽Pep-1510和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图13为本发明实施例3的阳性鼠血清和阴性鼠血清中B细胞表位肽Pep-916的特异性抗体滴度;
图14为本发明实施例3的阳性鼠血清中B细胞表位肽Pep-916和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图15为本发明实施例3的阳性猴血清和阴性猴血清中B细胞表位肽Pep-916的特异性抗体滴度;
图16为本发明实施例3的阳性猴血清中B细胞表位肽Pep-916和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图17为本发明实施例3的阳性猴血清和阴性猴血清中B细胞表位肽Pep-233的特异性抗体滴度;
图18为本发明实施例3的阳性猴血清中B细胞表位肽Pep-233和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图19为本发明实施例3的恢复期患者阳性血清和正常人阴性血清中B细胞表位肽Pep-916的特异性抗体滴度;
图20为本发明实施例3的恢复期患者阳性血清中B细胞表位肽Pep-916和Pep-对照的特异性抗体滴度;
图21为本发明实施例5的SARS-CoV-2假病毒中和实验结果图;
图22为本发明实施例6的SARS-CoV-2病毒微量中和实验结果图;
图23为本发明实施例7的多聚体多肽BH1的结构式;
图24为本发明实施例7的多聚体多肽BH2的结构式;
图25为本发明实施例7的多聚体多肽的SARS-CoV-2真病毒中和实验结果图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外,术语“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的,即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的,材料、设备、试剂均为市售。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围,在本发明中所用的表示用量、体积分数的所有数字、以及其他数值,在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此,除非特别说明,否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值,其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂,下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
提供一种有效引起机体免疫应答的针对新型冠状病毒的疫苗,阻断病毒在人群中的传播,防止病毒在机体内的逃逸,对防御新型冠状病毒具有重大意义。目前已有多种类型的新型冠状病毒疫苗处于临床前和临床试验中,包括灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、蛋白亚单位疫苗及重组病毒载体疫苗等。然而,前述目前开发的疫苗所产生的免疫保护作用有限,存在免疫原性低、安全性风险、人群响应率低、病毒免疫逃逸和/或运输存储条件苛刻等问题。
表位肽疫苗是近年发展起来的一种新型疫苗,又称为多肽疫苗,其是按照病原体抗原基因种已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列,通过化学多肽合成技术制备的疫苗。表位又称抗原决定簇,是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团,是能够与T细胞抗原受体或B细胞抗原受体特异性结合的基本单位,最终激起机体的免疫反应,形成对病原微生物的免疫能力。表位肽疫苗不存在毒力回升或灭活不完全的问题,且合成简单,因此,表位肽疫苗符合安全疫苗的发展方向。
现有研究表明,2019新型冠状病毒(2019-nCoV)由刺突蛋白(Spike,S蛋白)、膜蛋白(Membrance,M蛋白)、胞膜蛋白(Envelope,E蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N蛋白)构成。其中,S蛋白含有两个亚基,S1和S2,病毒侵染时,S1与宿主细胞受体ACE2 结合后,经宿主细胞蛋白酶切后,S1与S2脱离,加速S2与细胞膜的融合,因此,S蛋白介导病毒与宿主细胞表面的病毒受体结合,是病毒进入人体细胞的关键蛋白,含有较多的抗原表位。B细胞表位能够被B细胞识别并能诱导B细胞产生中和抗体的多肽—B细胞表位肽,针对S蛋白的B细胞表位肽(B-cell epitope,BCE)设计预防性或治疗性合成肽疫苗,可以产生抗原特异性免疫反应。B细胞表位肽是短序列氨基酸片段,现有的B细胞表位肽的免疫原性普遍不强,单独诱发特定功能性/保护性抗体的效果较弱,普遍存在不确定性、免疫效果很难达到最佳。作为诊断肽抗原应用时,还经常出现假阳性过高与特异性缺乏的问题,其主要原因包括:病毒自然感染诱发抗体滴度不高,而检测血清样本稀释度通常在1:10-1: 100之间,人体内本来就存在成千上万种抗体的干扰。
基于此,本发明提供了一种新型高特异性、高免疫原性的B细胞表位肽,可高效激发人体产生针对新型冠状病毒的免疫应答的抗体。
本发明实施例提供了一种B细胞表位肽,所述B细胞表位肽包括选自下述a)至c)的至少一种:
a)、氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条;具体地,前述各条多肽的氨基酸序列分别为:
SEQ ID NO.1(以下简称Pep-916):CVNFNFNGL
SEQ ID NO.2(以下简称Pep-1510):YQPYRVVVLSFELLH
SEQ ID NO.3(以下简称Pep-233):GDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP
SEQ ID NO.4(以下简称Pep-252):YNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFT
b)、对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽进行一个或多个氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽,所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.4所示的多肽相同或基本相同的功能;
c)、由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
在本发明的上下文中,术语“衍生多肽”是指具有与“本发明多肽”相同或相似功能,但其氨基酸序列与SEQ ID NO.1-4中任一所示氨基酸序列有少量差异的变异形式,这些变异形式包括但不限于:一个或多个(通常为1-5个,较佳地1-4个,更佳地1-3个,最佳地1-2个) 氨基酸的缺失、插入和/或取代。本领域技术人员熟知,用性能相近或相似的氨基酸进行取代,例如极性氨基酸之间的替换(谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换)、疏水性氨基酸之间的替换(如亮氨酸和异亮氨酸之间的替换)、以及带相同电荷的氨基酸之间的替换(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的替换,或者谷氨酸和天冬氨酸之间的替换),不会改变所得多肽的功能。再例如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸,如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得多肽的功能,也不会对其性能产生任何不利的影响。
在本发明的上下文中,术语“多聚体”是指包含两个或更多个多肽的物质,分为同源多聚体和异源多聚体。“多聚体”多肽所包含的多个多肽彼此之间共价连接或通过连接链连接,共价连接可以是多个多肽之间通过酯键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、二酰亚胺键、碳硫键,或者碳磷键相互连接;连接链连接可以是通过一个或多个氨基酸连接相邻的多个多肽的结构单元,该氨基酸残基的引入不会对多聚体多肽的免疫原性产生损害。例如,在一些实施方式中,2条Pep-252多肽通过1个赖氨酸连接形成同源二聚体多肽,4条Pep-916多肽通过3个赖氨酸连接形成同源四聚体多肽;在另一些实施例中,Pep-916和Pep-252也可以通过其它的氨基酸连接形成异源二聚体多肽,其它情况以此类推,不再赘述。
本发明示例性地提供了几种多聚体多肽,不应作为对本发明保护范围的限制,示例如下:
BH1,其氨基酸序列为:(YNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFT)2-K,该多聚体多肽为 2条Pep-252通过1个赖氨酸连接形成同源二聚体,分子量为5699.12,结构式见图23;
BH2,其氨基酸序列为:[(CVNFNFNGL)2-K]2-K,该多聚体多肽为4条Pep-916通过 3个赖氨酸连接形成同源四聚体,分子量为4440.84,结构式见图24。
本发明的Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252多肽可以单独使用,也可以任意组合使用。其中,对于a)共包含15种情况的B细胞表位肽,具体而言,单独使用Pep-916、Pep-1510、Pep-233或Pep-252多肽存在4种情况,组合使用Pep-916、Pep-1510、Pep-233 和Pep-252多肽存在11种情况,包括:2种多肽组合共计6种情形,3种多肽组合共计4 种情形,4种多肽组合为1种情形。对于b)和c),同样包含单独使用和组合使用的不同种情况的B细胞表位肽,且a)、b)和c)中所含多肽也可以组合使用。
本发明提供的B细胞表位肽(Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252)是通过首先利用免疫信息学的方法深度挖掘2019新型冠状病毒的S蛋白序列、S蛋白3D晶体结构以及S蛋白RBD区与人受体ACE-2相互作用的3D晶体结构之后筛选出的候选线性B细胞表位肽,然后使用马抗、鼠抗、猴抗和病患恢复期抗进一步筛选所获得的,并进一步通过动物实验验证了本发明筛选得到的B细胞表位肽的免疫原性和功能性。本发明筛选得到的 B细胞表位肽(Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252)具有强的免疫原性和免疫持久性,可诱导机体产生相应的免疫保护反应,显著提高针对S蛋白的总抗体和中和抗体的滴度,有效阻断新型冠状病毒S蛋白与宿主细胞受体ACE2结合,因此,有望被开发为 SARS-CoV-2疫苗。此外,本发明的B细胞表位肽使用多肽序列作为免疫原,并未使用灭活病毒或弱毒病毒,不存在使宿主感染病毒的副作用,具有更高的安全性。
经过大量实验发现,Pep-252多肽在四种多肽中免疫原性最高,能够产生更强的保护性中和抗体,更好的保护基体免受新型冠状病毒的攻击。因此,优选地,所述抗原表位包括氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的多肽。更优选地,还包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的多肽中的一条或多条。通常单一表位的免疫原性较弱,而联合多个表位可增强免疫原性,诱导更强的免疫应答,刺激机体产生强烈的具有病毒中和活性的抗体免疫反应。
Pep-916的多聚体多肽相比于Pep-252多肽的免疫原性更高,优选地,所述B细胞表位肽包括由氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的多肽形成的多聚体多肽,更优选地,还包括由氨基酸序列为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
上述所述的B细胞表位肽采用FmoC固相多肽合成法合成得到,包括以下步骤:
S1、将待合成的B细胞表位肽的C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基通过共价键形式连接到Rink树脂上,之后去除第一个Fmoc-氨基酸N端的保护基;以第一个Fmoc-氨基酸的N 端作为该条B细胞表位肽的合成起点,与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应,从而形成肽键;
S2、加入第二个Fmoc-氨基酸,使第二个Fmoc-氨基酸与N端去除保护基的第一个Fmoc- 氨基酸发生脱水缩合反应,以将第二个Fmoc-氨基酸结合到Rink树脂上,之后去除第二个 Fmoc-氨基酸N端的保护基;让第二个氨基酸的N端与后续的Fmoc-氨基酸的羧基进行反应。
S3、重复步骤S2,直至B细胞表位肽合成完成;
S4、将合成的所述B细胞表位肽从Rink树脂上切割下来,使用乙醚沉淀和洗涤,得到初肽;
S5、分离纯化所述初肽,得到纯度大于95%的本发明的B细胞表位肽。
本发明另一实施例提供了一种核酸序列,所述核酸序列系列用于编码如上所述的B细胞表位肽。
本发明进一步还提供了一种含有如上所述的核酸序列的载体。
所述核酸序列或所述载体经基因工程手段在受体细胞内表达以后能够产生上述所述的B细胞表位肽,其相对于现有技术所具有的优势与如上所述的B细胞表位肽相同,在此不再赘述。
前述的基因工程手段为本领域常规技术,包含核酸制备、限制性内切核酸酶酶切、表达载体构建、外源基因导入受体细胞、外源基因表达等步骤,本发明不再赘述。
本发明再一实施例提供了如上所述的B细胞表位肽的应用,具体为在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疫苗或药物以及检测抗新型冠状病毒抗体中的应用。
在本发明的上下文中,术语“疫苗”指可用于引起、刺激或增强细胞或动物或人体抵抗病原体的免疫系统的试剂。术语“药物”是指可以通过抑制病毒入侵或中和病毒而起到治疗新冠病毒感染引起的相关疾病的作用的物质。具体地,所述药物为抗体,所述抗体通过如上所述的B细胞表位肽免疫动物得到,所述抗体可以是单克隆抗体、也可以是多克隆抗体。
本发明又一实施例提供了一种疫苗,所述疫苗包含如上所述的B细胞表位肽作为活性成分。所述疫苗可高效激发人体产生针对SARS-CoV-2的免疫应答,能够在接种者中产生中和新型冠状病毒的抗体,从而提供有力的免疫保护作用。
可选地,所述疫苗还包含药学上可接受的辅剂。
本发明的疫苗可以通过任何已知给药途径给药,例如皮下、口服、肌内、或其他非肠道或肠道途径给药。在一些具体的实施方式中,所述疫苗经皮下或肌内注射给药。本领域技术人员熟知,疫苗的用量依活性成分的活性、给药个体的年龄、体重等因素的不同而变化。
本发明又一实施例提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含由如上所述的B细胞表位肽免疫动物得到的抗体和药学上可接受的辅剂。所述药物组合物含有治疗性的抗体,优选为中和抗体,该抗体可被导入给药个体中可调节该给药个体的免疫应答,能够与新型冠状病毒表面的抗原结合,从而阻止该病毒黏附靶细胞受体,防止侵入细胞。所述药物组合物相对于现有技术所具有的优势与如上所述的B细胞表位肽相同,在此不再赘述。
本发明的药物组合物可以通过任何已知给药途径给药,例如皮下、口服、肌内、静脉内或其他非肠道或肠道途径给药。在一些具体的实施方式中,所述药物组合物经静脉内注射给药。本领域技术人员熟知,药物组合物的用量依活性成分的活性、给药个体的年龄、体重等因素的不同而变化。
在本发明的上下文中,术语“药学上可接受的辅剂”是指不干扰活性成分的生物活性的效力并在其施用的浓度下对主体不具有明显毒性的组分,包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂等中的任意一种或至少两种的组合。将这些组分用于药学活性物质是本领域所熟知的。
本发明又一实施例提供了一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒,所述抗体检测试剂盒包含如上所述的B细胞表位肽。
将如上所述的B细胞表位肽固定在固相载体上,作为包被抗原捕获待检测的抗体,进行IgM和IgG联检,IgM和IgG是人体对病原微生物(含病毒)感染产生的两种不同抗体。通过检测抗体含量多寡,可初步确定新型冠状病毒存在与否。若离体样本中IgM和/或IgG 表达量E1与正常样本(健康人)中表达量E0进行比较,E1大于等于2倍的E0,可初步说明该样本中含有2019新型冠状病毒。本发明的B细胞表位肽对抗体的亲和力好,检测精度高。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1B细胞表位肽的筛选
本实施例通过对2019新型冠状病毒S蛋白序列进行免疫信息学分析,预测具有强免疫原性的线性B细胞表位肽,统计氨基酸位点的变异频率,选择无变异、变异极少的多肽;同时结合S蛋白的3D晶体结构和S蛋白与人受体ACE-2蛋白结合时的3D晶体结构定位出位于S蛋白RBD区上且与ACE-2互作面上的多肽,对可能的具有强免疫原性的线性B 细胞表位肽进行化学合成。然后,通过体外实验对这些多肽进行筛选,得到能够与马抗、鼠抗、猴抗、和病患恢复期抗结合的多肽。最后,通过对其进一步的动物实验验证了免疫原性,功能性测免疫鼠后的中和抗体效价,得到本发明的B细胞表位肽,其作为合成肽抗原,具有较强的免疫原性,有很好的免疫效果。
本实施例提供了一组用于制备预防和/或治疗2019新型冠状病毒疫苗的B细胞表位肽,本发明的B细胞表位肽来源于2019新型冠状病毒S蛋白序列,其氨基酸序列分别为:
Pep-916:CVNFNFNGL(见SEQ ID NO.1),其三字母缩写形式: Cys-Val-Asn-Phe-Asn-Phe-Asn-Gly-Leu;
Pep-1510:YQPYRVVVLSFELLH(见SEQ ID NO.2),其三字母缩写形式: Tyr-Gln-Pro-Tyr-Arg-Val-Val-Val-Leu-Ser-Phe-Glu-Leu-Leu-His;
Pep-233:GDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP(见SEQ ID NO.3),其三字母缩写形式:Gly-Asp-Glu-Val-Arg-Gln-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-Thr-Gly-Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu -Pro;
Pep-252:YNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFT(见SEQ ID NO.4),其三字母缩写形式:Tyr-Asn-Ser-Ala-Ser-Phe-Ser-Thr-Phe-Lys-Cys-Tyr-Gly-Val-Ser-Pro-Thr-Lys-Leu-Asn-Asp- Leu-Cys-Phe-Thr。
实施例2采用FmoC固相多肽合成法合成B细胞表位肽
实施例1的B细胞表位肽Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252采用FmoC固相多肽合成法合成得到,包括以下步骤:
S1、将待合成的B细胞表位肽的C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基通过共价键形式连接到 Rink树脂上,之后将Rink树脂放入体积百分比为15-30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮 (NMP)溶液中,在20-28℃条件下反应25-40分钟,从而去除第一个Fmoc-氨基酸N端的保护基,然后将Rink树脂使用氮气吹干,并使用NMP洗涤Rink树脂;
S2、加入第二个Fmoc-氨基酸和1-羟基苯并三唑(HOBT)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC),在20-28℃条件下缩合反应30-90分钟,使第二个Fmoc-氨基酸与N端去除保护基的第一个Fmoc-氨基酸发生脱水缩合反应,以将第二个Fmoc-氨基酸结合到Rink树脂上,之后将Rink树脂放入体积百分比为15-30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中,在20-28℃条件下反应25-40分钟,从而去除第二个Fmoc-氨基酸N端的保护基,然后将Rink 树脂使用氮气吹干,并使用NMP洗涤Rink树脂;
S3、重复步骤S2,直至B细胞表位肽合成完成,使用100%甲醇洗涤带有B细胞表位肽的Rink树脂3次,再在通风橱内吹干,然后将Rink树脂转移到棕色瓶内,放入-20℃冰箱备用;
S4、按照三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、苯酚和水的体积比例为85:8:6: 1的方式配制裂解液,在通风橱内将带有B细胞表位肽的Rink树脂与配制好的裂解液混合,在室温下,通过磁力搅拌器搅拌60分钟直至反应完全,将合成的所述B细胞表位肽从Rink 树脂上切割下来,然后使用冷阱旋转蒸发仪持续蒸发30-120分钟,去除粗肽中的TFA,之后使用乙醚沉淀和洗涤,得到初肽;
S5、使用二甲基甲酰胺(DMF)清洗初肽多次,得到纯度大于95%的本发明的B细胞表位肽。
将本实施例制备得到的B细胞表位肽冷冻干燥得到固体状态的粉末,方便运输和长期保存。
对合成的合成B细胞表位肽进行定性定量分析。使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。
制备得到的B细胞表位肽Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252的质谱鉴定结果分别如图1(Pep-916)、图2(Pep-1510)、图3(Pep-233)和图4所示(Pep-252),图1-4 中,横坐标表示离子的质荷比(m/z)值,从左到右质荷比的值增大,纵坐标表示离子流的强度(intensity)。由图1-4可知,合成的B细胞表位肽的分子量符合理论值,说明采用上述方法成功得到的预期的B细胞表位肽。
实施例3间接ELISA法测定免疫动物的血清中B细胞表位肽的特异性IgG滴度
本实施例中,SARS-CoV-2病毒S1抗原(即本发明的B细胞表位肽)从义翘神州生物科技有限公司购得,预包被SARS-CoV-2病毒S1抗原的96孔酶标板及洗涤缓冲液从东方海洋北京医学研究院有限公司购得,预包被时,S1抗原浓度为2μg/mL,包被量为50μl/ 孔。HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG抗体(羊抗鼠IgG抗体)从Southern Biotech购得,按照说明书的建议使用浓度为1:5000配制;HRP标记的Goat Anti-monkey IgG抗体(羊抗猴IgG抗体)从北京索莱宝生物科技有限公司购置,按照说明书的建议,使用浓度为1: 3000进行配置,现配现用。样本稀释缓冲液:牛血清白蛋白与PBS溶液从北京索莱宝生物科技有限公司购得,配置成3%牛血清白蛋白的PBS溶液,现配现用。TMB单组分显色液从北京索莱宝生物科技有限公司购得。ELISA终止液从北京索莱宝生物科技有限公司购得。
间接ELISA法测定免疫动物的血清中B细胞表位肽的特异性IgG滴度,包括以下步骤:
S31、动物免疫及样本采集:基于马、鼠、猴的新型冠状病毒免疫方案,在规定的时间点由尾静脉采血,分离血清备用;
S32、恢复期病患样本采集:从恢复期病患的静脉中抽取血样,分离血清备用;
S33、进行ELISA实验:
(1)在预包被SARS-CoV-2病毒S1抗原的96孔酶标板的各反应孔中以50μL/孔的量加入倍比稀释的马、鼠、猴或人的血清样本,同时设置不加血清的阴性对照;
(2)将96孔酶标板放置于37℃温箱中孵育45分钟,然后使用洗板机洗涤酶标板3次,拍净残余水分;
(3)在各反应孔中以50μL/孔的量加入新鲜稀释的酶标抗体,37℃条件下孵育30分钟,然后使用洗板机洗涤酶标板3次,拍净残余水分;
(4)在各反应孔中以50μL/孔的量加入TMB单组分显色液,37℃条件下孵育10分钟;
(5)在各反应孔中以50μL/孔的量加入ELISA终止液;
(6)使用酶标仪读取OD450处吸光度值。
抗体效价的判定标注为:以免疫前各血清样本平均OD450值为本底值,如果本底低于 0.05,则按0.05计算,本底值的2.1倍为效价判定值。采用统计软件Graphpad Prism 8分析数据,每组重复3次,测定结果见图5-20,图5-20分别为新型冠状病毒免疫马、鼠、猴后的血清以及恢复期患者的血清中B细胞表位肽的特异性IgG滴度。
图5-6分别为新型冠状病毒免疫马血清后,阳性马血清中Pep-252的特异性抗体滴度以及马血清抗体与Pep-252和Pep-对照(氨基酸序列为RRRRRRRRRRRRRRRR,其氨基酸序列见SEQ ID NO.5)结合力的对比结果,由图5-6可知,B细胞表位肽Pep-252能够与马抗特异性结合。
图7-8分别为新型冠状病毒免疫马血清后,阳性马血清中Pep-233的特异性抗体滴度以及马血清抗体与Pep-233和Pep-对照结合力的对比结果,由图7-8可知,B细胞表位肽Pep-233能够与马抗特异性结合。
图9-10分别为新型冠状病毒免疫马血清后,阳性马血清中Pep-1510的特异性抗体滴度以及马血清抗体与Pep-1510和Pep-对照结合力的对比结果,由图9-10可知,B细胞表位肽Pep-1510能够与马抗特异性结合。
图11-12分别为新型冠状病毒免疫鼠血清后,阳性鼠血清中Pep-1510的特异性抗体滴度以及鼠血清抗体与Pep-1510和Pep-对照结合力的对比结果,由图11-12可知,B细胞表位肽Pep-1510能够与鼠抗特异性结合。
图13-14分别为新型冠状病毒免疫鼠血清后,阳性鼠血清中Pep-916的特异性抗体滴度以及鼠血清抗体与Pep-916和Pep-对照结合力的对比结果,由图13-14可知,B细胞表位肽Pep-916能够与鼠抗特异性结合。
图15-16分别为新型冠状病毒免疫猴血清后,阳性猴血清中Pep-916的特异性抗体滴度以及猴血清抗体与Pep-916和Pep-对照结合力的对比结果,由图15-16可知,B细胞表位肽Pep-916能够与猴抗特异性结合。
图17-18分别为新型冠状病毒免疫猴血清后,阳性猴血清中Pep-233的特异性抗体滴度以及猴血清抗体与Pep-233和Pep-对照结合力的对比结果,由图17-18可知,B细胞表位肽Pep-233能够与猴抗特异性结合。
图19-20分别为恢复期病患血清中Pep-916的特异性抗体滴度以及恢复期病患血清抗体与Pep-916和Pep-对照结合力的对比结果,由图19-20可知,B细胞表位肽Pep-916能够与恢复期病患抗特异性结合。
综上,Pep-916能够与鼠抗、猴抗、恢复期病患抗特异性结合,且Pep-916与恢复期病患抗特异性结合力远大于其余抗体。Pep-233能够与马抗、猴抗特异性结合,且与马抗的结合力大于猴抗。Pep-1510能够与马抗、鼠抗特异性结合,且与马抗的结合力大于鼠抗。上述结果说明本发明所筛选的B细胞表位肽Pep-916、Pep-1510、Pep-233、Pep-252具有与2019新型冠状病毒抗体特异性结合的能力,不同多肽对不同抗体的亲和力有所差异,证明本发明的B细胞表位肽可用于特异性检测IgG。
实施例4B细胞表位肽免疫小鼠
使用BALB/c品系的小鼠20只,分成4组,每组5只;对每组小鼠分别通过静脉注射本发明的B细胞表位肽(Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252)进行免疫,每次注射 5mg/mL。每周对小鼠免疫一次,总共免疫5次。收集5次免疫后的小鼠外周血,分离血清备用。
为了探索B细胞表位肽的耐受及安全性,持续观察了20只小鼠的活动性、体温等,发现所有小鼠注射本发明的B细胞表位肽后,均摄食性正常,无不良反应,且未出现死亡,提示了本发明的B细胞表位肽作为疫苗具有高的耐受和生物安全性。
实施例5SARS-CoV-2假病毒中和实验
S51、从Wuhan-Hu-1毒株(GenBank:MN908947)中克隆S蛋白基因到质粒pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1.S2,重组质粒pcDNA3.1.S2在宿主表达可形成S蛋白;
S52、采用293T细胞转染pcDNA3.1.S2质粒(30μg/T75烧瓶);
S53、293T细胞转染pcDNA3.1.S2质粒之后,在24小时之内,四次感染G*ΔG-VSV 病毒,每感染2小时,使用PBS溶液清洗细胞,然后加入新的细胞培养液;
S54、G*ΔG-VSV病毒感染24小时之后,将包含细胞上清液的SARS-CoV-2假病毒收集起来,SARS-CoV-2假病毒系统的主构架由G*ΔG-VSV构成,使用0.45μm孔径(Millipore,SLHP033RB)过滤除去细胞碎片,冻存于-70℃的冰箱中备用;
S55、对实施例4收集到的免疫小鼠血清以每次3倍的方式进行稀释,总共稀释6次,然后与制备好的SARS-CoV-2假病毒混合,在37℃条件下孵育60分钟;
S56、将胰蛋白酶处理后的细胞加入到反应液中,在CO2含量5%、温度37℃的条件下孵育24小时;
S57、使用Reed-Muench法计算每份小鼠血清的EC50值中和滴度。
实验结果如图21所示,从图中可以看出,接受B细胞表位肽Pep-916、Pep-1510、Pep-233 和Pep-252免疫的小鼠产生的抗体具有很高的中和滴度,能够快速识别S蛋白并与其结合,进而中和假病毒,证实本发明所筛选得到的B细胞表位肽具有很好的免疫效果,经其免疫得到的抗体能够很好地中和SARS-CoV-2假病毒。
实施例6SARS-CoV-2病毒微量中和实验
本实施例中,SARS-CoV-2新型冠状病毒来自由军事医学研究院微生物流行病所病毒学研究室分离并保存于病毒库的病毒株,BetaCov/Beijing/IMEBJ01/2020(缩写为131,CPE/PFU、交叉中和滴度测定用),其基因组序列号分别是GWHACAX01000000,病毒原液滴度为5×105PFU/mL。
主要实验材料和设备包括:DMEM培养基,购买自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS),购买自美国Hyclone公司;抗生素Penicillin-Streptomycin溶液购买自美国Hyclone公司;Vero细胞购买自美国ATCC公司,存贮于微生物流行病研究所细胞库。细胞培养液为含10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素;细胞维持液为2%胎牛血清及100U/mL 青霉素、100ug/mL链霉素;96孔细胞培养板,购自康宁生物科技有限公司(美国 Corning-Costar)。
血清样品及对照品:样品为实施例4采集的免疫小鼠血清,标准阳性血清为以亚单位疫苗(购自义翘神州,货号:40592-V05H)皮下注射作为阳性血清,亚单位疫苗给药量为 5μg。标准阴性血清为以佐剂皮下注射作为阴性血清,即空白对照。
通过微量中和实验来评价使用B细胞表位肽(Pep-916、Pep-1510、Pep-233和Pep-252) 免疫小鼠后、血清抗SARS-CoV-2中和抗体效价。实验原理是SARS-CoV-2病毒可以引起敏感靶细胞(Vero)发生特异性病变,而特异性中和抗体可以阻止病毒引起的特异性细胞病变,从而通过测定中和抗体对细胞病变的抑制率来计算中和抗体效价。实验步骤包括:
S61、用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基常规培养和传代Vero细胞,Vero细胞的传代次数为145-155次。临用前,用细胞生长液稀释细胞浓度至1×105个/mL,细胞培养板中按100uL/孔的量加入细胞悬液并混匀,在CO2培养箱培养18-24小时;
S62、临测定前4-8小时,血清样本先用细胞维持液稀释(不同样本原始稀释浓度不同) 至起始浓度,然后以2倍比稀释,每份样本稀释4-6个稀释度,每个稀释度2-4复孔;
S63、临测定前1-2小时,将病毒库(Stock)保存的分装病毒株131用细胞维持液稀释至100CCID50/0.05mL,得到病毒液;
S64、在系列稀释好的样品孔中,垂直悬滴加入100CCID50/0.05mL的病毒液50μL(样品毒性试验对照、正常细胞对照除外),在CO2培养箱孵育1-1.5小时,同时,每块细胞培养板在培养有Vero细胞的孔中分别加入病毒对照(50uL含100TCID50),以及不加病毒的正常细胞对照;每批中和效价(NT)实验设置标准阳性血清、标准阴性血清、病毒回滴作为批间差内参。
S65、接种好的细胞培养板于37℃、5%CO2培养箱中培养,使用倒置显微镜观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并记录细胞病变结果,以抑制50%细胞病变的血清最高稀释度为终点效价,72-96小时判定最终结果,计算中和抗体效价(NT50)使用Karber法或Reed-Muench法。
实验结果如图22所示,从图中可以看出,接受B细胞表位肽Pep-916、Pep-1510、Pep-233 和Pep-252免疫的小鼠产生的抗体具有很高的中和效价(NT50);Pep-252有最高的中和效价;NT50平均值高达78.2;Pep-1510的NT50平均值达到47.4;Pep-233和Pep-916也具有较高的中和效价,NT50分别是18.6和15.2。证明本发明所筛选得到的B细胞表位肽具有很好的免疫效果,对SARS-CoV-2病毒有很强的中和能力。
以上结果说明,本发明的B细胞表位肽作为疫苗具有很强的抗SARS-CoV-2病毒的能力,具有非常好的推广前景和市场价值。
实施例7多聚体多肽的SARS-CoV-2真病毒中和实验
本实施例提供了用于制备预防和/或治疗2019新型冠状病毒疫苗的2种多聚体多肽形式的B细胞表位肽,其氨基酸序列分别为:
BH1:(YNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFT)2-K,其三字母缩写形式: (Tyr-Asn-Ser-Ala-Ser-Phe-Ser-Thr-Phe-Lys-Cys-Tyr-Gly-Val-Ser-Prp-Thr-Lys-Leu-Asn-Asp-Leu-Cys-Phe-Thr)2-Lys,该多聚体多肽为2条Pep-252通过1个赖氨酸连接形成同源二聚体,分子量为5699.12,结构式见图23;
BH2:氨基酸序列为:[(CVNFNFNGL)2-K]2-K,其三字母缩写形式: [(Cys-Val-Asn-Phe-Asn-Phe-Asn-Gly-Leu)2-Lys]2-Lys,该多聚体多肽为4条Pep-916通过3 个赖氨酸连接形成同源四聚体,分子量为4440.84,结构式见图24。
上述BH1和BH2采用FmoC固相多肽合成法合成,具体合成过程与实施例2类似,在此不再赘述。
使用BALB/c品系的小鼠10只,分成2组,每组5只;对每组小鼠分别通过皮下注射本发明的B细胞表位肽(BH1和BH2)进行免疫,注射剂量5μg/只。每周对小鼠免疫一次,总共免疫5次。收集5次免疫后的小鼠外周血,分离血清备用。血清样品及对照品:样品为实施例4采集的免疫小鼠血清,标准阳性血清为以亚单位疫苗(购自义翘神州,货号:40592-V05H)皮下注射作为阳性血清,亚单位疫苗给药量为5μg。标准阴性血清为以佐剂皮下注射作为阴性血清,即空白对照(空白)。
采用实施例6的微量中和实验来评价使用多聚体多肽BH1和BH2免疫小鼠后、血清抗SARS-CoV-2中和抗体效价,以血清初始稀释倍数(1:16)为本试验的置信限,血清学阳性定义为滴度≥16。测定结果见图25。
由图25可知看出,BH2的NT50值超过200,远高于Pep-916单肽的NT50值,也比阳性对照的NT50值高。BH1的NT50值接近100,与阳性对照的NT50值非常接近;以上结果证明两种聚合物产生的抗体具有较高的病毒中和活性,可以高效诱导抗SARS-CoV-2 的中和抗体。
虽然本发明公开披露如上,但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下,可进行各种变更与修改,这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种B细胞表位肽,其特征在于,所述B细胞表位肽包括选自下述a)至c)的至少一种:
a)、氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条;
b)、对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽进行一个或多个氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽,所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽相同或基本相同的功能;
c)、由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
2.根据权利要求1所述的B细胞表位肽,其特征在于,所述B细胞表位肽包括氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的多肽。
3.根据权利要求1所述的B细胞表位肽,其特征在于,所述B细胞表位肽包括由氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的多肽形成的多聚体多肽。
4.根据权利要求3所述的B细胞表位肽,其特征在于,所述多聚体多肽为4条氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的多肽通过3个赖氨酸连接形成的同源四聚体。
5.一种核酸序列,其特征在于,所述核酸序列系列用于编码如权利要求1-4任一项所述的B细胞表位肽。
6.一种载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求5所述的核酸序列。
7.根据权利要求1-4任一项所述的B细胞表位肽在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疫苗或药物以及检测抗新型冠状病毒抗体中的应用。
8.一种疫苗,其特征在于,所述疫苗包含如权利要求1-4任一项所述的B细胞表位肽作为活性成分。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含由如权利要求1-4任一项所述的B细胞表位肽免疫动物得到的抗体和药学上可接受的辅剂。
10.一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒,其特征在于,所述抗体检测试剂盒包含如权利要求1-4任一项所述的B细胞表位肽。
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