CN115572745A - 一种两步酶法制备结构脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两步酶法制备结构脂的方法，属于油脂深加工领域。本发明第一步利用对低级醇具有一定耐受的脂肪酶，通过利用脂肪酶催化油‑低级醇体系发生酯交换反应生成偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的醇解产物，第二步为提高甘油二酯的含量，在不除去低级醇酯的条件下加入甘油在酶催化下发生甘油解反应。本发明与化学法相比，反应条件温和，环境友好。本发明所采用的方法不产生游离脂肪酸，产物易分离，同时制备得到更高得率的甘油二酯。

Description

一种两步酶法制备结构脂的方法

技术领域

本发明涉及油脂深加工领域，具体涉及一种两步酶法制备结构脂的方法。

背景技术

甘油二酯(Diacylglycerol，DAG，简称甘二酯)是一类甘油三酯中的一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，具有特殊的生理功能。DAG从其结构上可分为1，3-DAG和1，2-DAG两种形式，即羟基在sn-2和sn-3位置上。动物和人体试验表明，1，3-DAG被人体消化后生成甘油和游离脂肪酸，二者在人体内转化成能量，与甘油三酯相比，1，3-DAG具有控制高血脂症、肥胖症等作用，并且甘油二酯可经小肠外其它途径吸收，可减轻肠道负担。另外，由于甘二酯是一种亲油性较强的乳化剂，可应用于食品添加剂、医药、化妆品等领域。在食品中添加甘二酯取代普通食用油脂，在不降低口感的基础上还可以减少肥胖症等的风险。

目前工业上制备DAG主要有化学法和酶法，化学法催化剂多为强碱，虽然催化效率高，但是常会用到有机溶剂，且会生成副产物，因此工业上尝试采用生物酶法取代化学法制备DAG。酶法具有反应条件温和、产品质量高、环境污染小、副产物少、产品后处理简单、可用于制备结构酯等优点，虽生物酶价格较高，但是固定化酶可以重复利用，因此生物酶法具有一定的可行性。

合成甘二酯的方法包括酯化法、水解法和酯交换法，酯化法是指甘油和脂肪酸直接酯化合成甘油二酯，该方法得率高，但是原料昂贵，底物脂肪酸难以完全除去，产物酸价高；水解法是通过酶催化甘油三酯水解来生成甘油二酯的方法，同样存在脂肪酸难以除去，同时水解法的产物取决于反应进行的程度，局部水解时产物为甘油一酯、甘油二酯和游离脂肪酸，完全水解时产物为游离脂肪酸和甘油，水解法反应不易控制、副产物多，不适合工业化生产。酯交换法时通过催化甘油三酯与甘油进行酰基转移从而生成甘油二酯的一种方法，该方法不产生游离脂肪酸，但是反应底物粘度大，反应速度慢，产物中还含有大量的甘油三酯。

因此，本领域亟需有一种不产生游离脂肪酸、反应速度快、甘油二酯含量高的酶法来制备甘油二酯的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种两步酶法制备结构脂的方法，第一步利用非特异性脂肪酶催化油脂-低级醇体系发生酯交换反应，生成偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物，第二步是在上述制得的油脂混合物中加入甘油在酶催化下发生甘油解反应，以提高甘油二酯的含量。

本发明的技术方案为：一种两步酶法制备结构脂的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、取油脂、低级醇、非特异性脂肪酶于反应器中，在一定的温度和时间下进行醇解反应，反应结束后回收非特异性脂肪酶和低级醇，获得含有偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物；

S2、在步骤S1得到的油脂混合物中加入甘油、脂肪酶，在0～500Pa的真空度下进行甘油解反应，反应结束后回收脂肪酶，并将反应产物分离、纯化得到甘油二酯。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述油脂包括天然植物油脂、动物油脂、微生物油脂中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述低级醇包括甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S1中的非特异性脂肪酶包括来源于南极洲假丝酵母(Candida antarctica)、嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)的脂肪酶中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S1中的非特异性脂肪酶包括来源于Candida antarctica的Lipozyme 435、Novozym 435、lipase A(CAL-A)和Lipase CL“Amano”IM；来源于Thermomyces lanuginosus的Lipozyme TL 100L和Lipozyme TL IM；来源于Aspergillus oryzae的Eversa Transform 2.0中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的脂肪酶包括具有酯交换活性的特异性酶和非特异性酶。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的具有酯交换活性的特异性酶和非特异性酶包括南极洲假丝酵母(Candida antarctica)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米根霉菌(Rhizopus oryzae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkaholderia cepacia)的脂肪酶中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的脂肪酶包括来源于Candidaantarctica的Lipozyme 435和Novozym 435；来源于Rhizomucor miehei的Lipozyme RMIM、Lipozyme RM；来源于Rhizopus oryzae的Lipase DF-15；来源于Burkaholderiacepacia的Lipase PS和Lipase AK中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S1中，所述低级醇与油脂的质量比为0.1∶1～4∶1，优选为0.1∶1～1∶1；所述非特异性脂肪酶的用量为低级醇与油脂总质量的0.01％～10％。

在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S1中，所述醇解反应的条件为：于20～50℃反应0.5～10h；优选25～45℃反应1～5h。

在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S2中，所述油脂混合物与甘油的质量比为15∶1～50∶1，优选为20∶1～25∶1；所述脂肪酶的用量为油脂混合物和甘油总质量的0.01％～10％。

在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S2中，所述甘油解反应的条件为：反应体系压力0～500Pa，40～70℃反应3～20h；优选50～65℃反应8～12h。

本发明相较于现有技术的优势和有益效果在于：

(1)本发明提供一种两步酶法制备结构脂的方法，与化学法相比，本发明反应条件温和，对环境友好，和酯化法与水解法相比，本发明的制备方法不产生游离脂肪酸；

(2)本发明第一步利用对低级醇具有一定耐受的非特异性脂肪酶，通过催化油脂-低级醇体系发生酯交换反应生成偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯，一步醇解后得到的油脂混合物粘度降低，相比于一步甘油解的方法，第二步法反应速度快，可以制备得到更高含量的甘油二酯；

(3)本发明中第一步酶促反应得到的副产物脂肪酸低级醇酯不仅不会抑制产物的生成，反而能够促进DAG的合成，提高产物中DAG的得率。

附图说明

图1为本发明实施例4的葵花籽油反应前后的液相色谱(示差检测器)图，其中，a为葵花籽油反应前的液相色谱图，b为醇解反应后甘油解之前的液相色谱图，c为甘油解之后的液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。

本发明的一种两步酶法制备结构脂的方法，包括如下步骤：

(1)按照比例向反应器中加入油样、低级醇和非特异性脂肪酶，进行醇解反应，反应结束后回收脂肪酶，反应产物经减压蒸馏脱除残留低级醇，得到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)在步骤(1)制得的油脂混合物中加入适量甘油和脂肪酶，于0～500Pa的真空度下进行甘油解反应，反应结束后回收脂肪酶，反应产物进分离纯化得到DAG的甘油解产物。

本发明实施例所用原料如下表1所示：

表1

实施例1

(1)准确称取玉米油样品20.0g，乙醇4.0g，和1.2g非特异性脂肪酶Novozym 435一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应3h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Novozym 435，反应产物经减压蒸馏脱除残留乙醇，得到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)取15.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加0.6g非特异性脂肪酶Lipozyme435催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应7h，控制反应体系的压力为200Pa，反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

实施例2

(1)准确称取玉米油样品30.0g，乙醇5g，和2.0g非特异性脂肪酶Lipase CL“Amano”IM一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为40℃，在磁力搅拌下反应5h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipase CL“Amano”IM。反应产物经减压蒸馏脱除残留乙醇，得到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)取24.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.5g脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为60℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为50Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

实施例3

(1)准确称取玉米油样品20.0g，甲醇20.0g，和2.0g非特异性脂肪酶EversaTransform2.0一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应0.5h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Eversa Transform 2.0。反应产物经减压蒸馏脱除残留甲醇，到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)取18.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.0g非特异性脂肪酶Novozym 435催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应10h，控制反应体系的压力为180Pa，反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Novozym 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

实施例4

(1)准确称取葵花籽油样品30.0g，甲醇12.0g，和1.5g非特异性脂肪酶CAL-A一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为40℃，在磁力搅拌下反应6h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶CAL-A。反应产物经减压蒸馏脱除残留甲醇，到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)取28.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加2.0g脂肪酶Lipase DF-15催化其反应，控制反应温度为60℃，在磁力搅拌下反应11h，控制反应体系的压力为80Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipase DF-15，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

实施例5

(1)将玉米油和鱼油按质量比1∶1混合得到混合油样，准确称取混合油样30.0g，乙醇3.0g，和2.0g非特异性脂肪酶Lipozyme TL IM一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应6h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme TL IM。反应产物经减压蒸馏脱除残留乙醇，到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。

(2)取22.0g油脂混合物，加入0.5g甘油，并添加1.98g非特异性脂肪酶Lipase PS催化其反应，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应11h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipase PS，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

对比例1

采用一步醇解法制备DAG，包括如下步骤：

准确称取玉米油样品20.0g，乙醇4.0g，和1.2g非特异性脂肪酶Novozym 435一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应3h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Novozym 435，反应产物经减压蒸馏脱除残留乙醇，得到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物。在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到含有DAG的醇解产物。

对比例2

采用一步甘油解法制备DAG，包括如下步骤：

取24.0g玉米油，加入1.0g甘油，并添加1.5g脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为50℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为200Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

对比例3

相较于实施例3的区别仅在于反应在常压下进行，其余均同实施例3。

对比例4

(1)准确称取玉米油样品20.0g，乙醇4.0g，和1.2g非特异性脂肪酶Novozym 435一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应3h。反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Novozym 435，反应产物经减压蒸馏脱除残留乙醇，得到偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物，在0.5Pa、150℃进行分子蒸馏以除去脂肪酸低级醇酯，得到偏甘油酯。

(2)取15.0g偏甘油酯，加入1.0g甘油，并添加0.6g非特异性脂肪酶Lipozyme 435催化其反应，控制反应温度为40℃，在磁力搅拌下反应7h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到DAG的甘油解产物。

产品表征分析

上述步骤(1)的油脂混合物和和步骤(2)的甘油二酯的表征方法如下：

取反应后的混合产物30mg，加入1mL流动相(正己烷∶异丙醇∶甲酸体积比＝15∶1∶0.003)溶解，过膜，液相色谱检测，液相色谱操作参数为：HPLC，Sepax HP硅胶柱(孔径5μm，4.6mm×250mm)示差检测器；以1.0mL/min的速率用己烷、异丙醇和甲酸(15∶1∶0.003，v/v/v)洗脱，得到产物的脂质组成。

本发明以实施例4的产物为例进行脂质组成分析，如图1所示为本发明实施例4的葵花籽油反应前后的液相色谱图，其中，a为葵花籽油反应前的液相色谱图，b为醇解反应后甘油解之前的液相色谱图，c为甘油解之后的液相色谱图，图a只有一个甘三酯的峰，说明葵花籽油在反应前的成分为甘三酯(TAG)，图b中出现了脂肪酸乙酯(FAEE)的峰，说明葵花籽油发生了醇解反应，甘三酯的含量下降，主要生成了脂肪酸乙酯(FAEE)和甘二酯(DAG)，从图c可以看出甘三酯的含量进一步下降，甘二酯的含量进一步上升，说明发生了甘油解反应，产物的主要成分为甘二酯。

DAG的得率分析

DAG得率的计算公式如下式(1)所示：

通过式(1)的公式计算得到实施例1～5与对比例1～4所制备的产物中DAG的得率，具体数据如下表2所示：

表2

从表2可以看出，实施例1～4所制备产物中DAG的得率都在60％以上，远远高于对比例1的一步醇解法和对比例2的一步甘油解法的产物中的DAG的得率，表明本发明的技术方案相比于一步法在DAG得率上具有明显的优势。

从实施例1和对比例4可以看出，本发明中第二步酶促反应在脂肪酸低级醇酯存在的条件下反应时，产物中DAG得率高于除去低级醇酯下反应的技术效果，说明本发明中第一步酶促反应得到的脂肪酸低级醇酯能够促进反应发生，一般来说，副产物会抑制产物的生成，为了提高产物的含量，会将副产物除去，但是在本发明采用的技术方案中，副产物的保留却对DAG的合成产生了促进作用。

从对比例3和实施例3可以看出，本发明中第二步酶促反应在一定的真空度条件下反应时，产物中DAG得率高于在常压下反应的技术效果，说明真空条件能够促进反应发生。

综上，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取油脂、低级醇、非特异性脂肪酶于反应器中进行醇解反应后，反应结束后回收非特异性脂肪酶和低级醇，获得含有偏甘油酯和脂肪酸低级醇酯的油脂混合物；

S2、在步骤S1得到的油脂混合物中加入甘油、脂肪酶，在0～500Pa的真空度下进行甘油解反应，反应结束后回收脂肪酶，并将反应产物分离、纯化得到甘油二酯。

2.根据权利要求1所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述低级醇与油脂的质量比为0.1∶1～4∶1；步骤S2中，所述油脂混合物与甘油的质量比为15∶1～50∶1。

3.根据权利要求2所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述低级醇与油脂的质量比为0.1∶1～1∶1；步骤S2中，所述油脂混合物与甘油的质量比为20∶1～25∶1。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，所述油脂包括天然植物油脂、动物油脂、微生物油脂中的至少一种。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，所述低级醇包括甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，所述非特异性脂肪酶包括来源于Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Aspergillus oryzae的脂肪酶中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，所述脂肪酶包括具有酯交换活性的特异性酶和非特异性酶。

8.根据权利要求7所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，所述脂肪酶包括来源于Candida antarctica、Rhizomucor miehei、Rhizopus oryzae、Burkaholderiacepacia的脂肪酶中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述醇解反应的条件为：于20～50℃反应0.5～10h；步骤S2中，所述甘油解反应的条件为：于40～70℃反应3～20h。

10.根据权利要求1或9所述的一种两步酶法制备结构脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述醇解反应的条件为：于25～45℃反应1～5h；步骤S2中，所述甘油解反应的条件为：于50～65℃反应8～12h。

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