CN115558685A - 一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及丙烯酰胺生产技术领域,具体公开了一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,包括菌种培养、菌种固定化、催化水合及后处理步骤,生产得到质量百分含量为40~50%的丙烯酰胺液体成品。且菌种固定化步骤中所用的固定化载体为聚乳酸和含疏基微孔聚合物构成。本申请通过提高菌种固定化的机械强度,降低载体对菌种的毒性,在便于连续催化反应的同时保障菌种及腈水合酶的活性,优化生产得到的丙烯酰胺质量。
Description
技术领域
本申请涉及丙烯酰胺生产技术领域,更具体地说,它涉及一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺。
背景技术
丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工材料,主要用于生产其衍生物的共聚物或均聚物。其中丙烯酰胺共聚生产得到的聚丙烯酰胺用途较为广泛,可用作润滑剂、悬浮剂、粘土稳定剂、降失水剂和增稠剂,被广泛应用在采油、地质、冶金、土建等领域中。
丙烯酰胺的生产方法主要包括硫酸水合法、铜系催化剂水合法和微生物法,其中微生物法操作简单、转化率高、副反应少,相较于硫酸水合法和铜系催化剂水合法优势较大,目前微生物法生产丙烯酰胺已经被广泛应用,微生物法生产的丙烯酰胺占有丙烯酰胺国内总产量的90%以上。
微生物法生产丙烯酰胺的过程中,为了在保持菌种催化活性的同时,便于连续催化反应,且在催化反应结束后回收和重复使用,通常会采用高分子聚合物作为载体实现菌种固定化。通常是以海藻酸钠或聚丙烯酰胺作为载体,但是海藻酸钠作为载体的机械强度较低,聚丙烯酰胺对菌种的毒性较大,容易影响菌种及腈水合酶的活性。
发明内容
为了提高菌种固定化的机械强度,同时降低载体对菌种的毒性,保障菌种及腈水合酶的活性,进而优化生产得到的丙烯酰胺质量,本申请提供一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺。
本申请提供一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,采用如下的技术方案:
一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,包括以下步骤:
菌种培养:初步培养菌种后大量发酵繁殖,发酵液经微滤膜过滤洗涤后得到菌溶液备用;菌种固定化:混合菌溶液与固定化载体后静置,过滤后得到固定化菌种;
催化水合:将固定化菌种加入纯水中,然后持续滴加丙烯腈,始终保持水合体系中的丙烯腈质量浓度小于1%,催化发生水合反应,得到水合液;
后处理:水合液经超滤膜过滤后得到丙烯酰胺粗品液,再依次经过离子交换和提浓操作后得到质量百分含量为40~50%的丙烯酰胺液体成品;
所述菌种固定化步骤中,所述固定化载体为聚乳酸和含疏基微孔聚合物构成,所述含疏基微孔聚合物的结构式如下:
通过采用上述技术方案,以聚乳酸和上述结构式的含疏基微孔聚合物作为固定化载体的原料,其中聚乳酸具有良好的机械性能和生物相容性,且对菌种基本不显毒性;上述结构式的含疏基微孔聚合物由于具有刚性扭曲的分子链,分子链堆积时空间不能有效地被占据,未被有效占据的空间形成微孔结构,从而使得上述结构式的含疏基微孔聚合物在具有较好的机械性能的同时具有独特的微孔结构。并且上述结构式的含疏基微孔聚合物含有疏基,菌种的主要成分之一是蛋白质,蛋白质中也含有丰富的疏基,根据相似相容原理,上述结构式的含疏基微孔聚合物对于菌种有较好的生物相容性和较低的生物毒性。另外,由于聚乳酸显疏水,而含疏基微孔聚合物在疏基的影响下显亲水,两者所构成的固定化载体表现出两亲性;并且在上述结构式的含疏基微孔聚合物独特的微孔结构的影响下,固定化载体也具有较为丰富的微孔结构,即通透性较好,对于提高固定化载体负载菌种的负载量和稳定性均具有积极意义,并且便于菌种产生的腈水合酶与丙烯腈的接触反应。同时聚乳酸还具有良好的生物降解性,对于后续固定化载体的废弃处理具有一定的积极意义。
综上,由于固定化载体具有丰富的微孔结构和独特的两亲性,并且具有较好的机械性能、生物相容性和较低的生物毒性,在较为充分和稳定地负载菌种的基础上,可以保障较高的菌种及腈水合酶活性,且便于菌种产生的腈水合酶与丙烯腈的接触反应,对于后续菌种所产生的腈水合酶参与连续催化反应的效果具有积极意义,进而使得上述工艺生产得到的丙烯酰胺的质量较好,且转化率较高。
另外,固定化载体在水合体系中的稳定性较好,不会参与反应或影响反应,不存在发生副反应生成杂质,进而影响丙烯酰胺质量的问题。并且固定化载体还具有良好的吸附性能,可以有效吸附丙烯腈原料中的杂质,并且对于菌种消溶后所产生的碎片、蛋白质等物质也具有良好地吸附效果,即可以有效减少体系中所存在的杂质,对于提高生产得到的丙烯酰胺质量具有积极意义。
在一个具体的可实施方案中,所述固定化载体的制备方法如下:
溶解共混:将聚乳酸和含疏基微孔聚合物溶于有机溶剂中,得到混合液;
成型处理:蒸出混合液中的有机溶剂,依次经洗涤、烘干、粉碎操作后得到成品固定化载体。
通过采用上述技术方案,由于上述结构式的含疏基微孔聚合物呈线性结构,可以与聚乳酸一起较好地溶解于有机溶剂中。在两者充分溶解后,蒸出有机溶剂后两者充分融合,经洗涤、烘干和粉碎步骤后即可得到较为合适的固定化载体。操作较为简单,且实际得到的成品固定化载体质量较好。
在一个具体的可实施方案中,所述聚乳酸是以下结构式的环状内酯单体经开环聚合得到,环状内酯单体的合成路线如下:
通过采用上述技术方案,上述合成路线合成得到的环状内酯单体开环聚合得到的聚乳酸结构中的重复单元富含羟基,由于羟基与亚氨基、疏基可以以氢键、共价键的形式结合,而含疏基微孔聚合物中含有亚氨基和疏基;因此经上述合成路线得到的环状内酯单体开环聚合得到的聚乳酸,可以与含疏基微孔聚合物较为稳定地结合在一起,进而有助于提高所得到的固定化载体的结构稳定性;同时经上述结构式的环状内酯单体开环聚合得到的聚乳酸生物相容性更佳,使得固定化载体对于菌种的负载效果更佳,进而对于进一步改善固定化载体负载菌种的稳定性具有积极意义。
另外,菌种及其产生的腈水合酶中也含有较多的亚氨基、氨基及疏基,其中亚氨基和疏基均倾向于与聚乳酸中的羟基相结合,并且亚氨基和氨基属于碱性基团,聚乳酸中的羟基可以进一步和碱性基团结合,从而使得菌种及腈水合酶与固定化载体的结合稳定性更佳;在基团的相互影响下,菌种倾向于与聚乳酸相结合,可以进一步弱化含疏基微孔聚合物对于菌种可能存在的毒性,且可以有效提高固定化载体对于菌种的负载量。
综上,预先采用上述合成路线合成得到的环状内酯单体开环聚合得到的聚乳酸,应用至固定化载体的制备中具有明显的积极意义。
在一个具体的可实施方案中,所述溶解共混步骤中,在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入纳米氧化铝,超声分散后得到混合液。
通过采用上述技术方案,由于在催化水合步骤中,随着水合反应的进行丙烯酰胺逐渐生成,使得体系中丙烯酰胺的浓度逐渐上升。而当体系中的丙烯酰胺浓度达到一定值后,会对菌种产生较大的毒害作用,使得菌种活性下降甚至死亡,腈水合酶的活性随之下降。上述情况对于生产得到的丙烯酰胺质量具有一定程度的消极影响。
因此为了解决上述问题,在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入纳米氧化铝。由于纳米氧化铝具有比表面较大、孔隙率高和性质稳定的特点,同时对于菌种基本不具有毒害性。添加纳米氧化铝的固定化载体可以获得更为丰富的孔隙结构及更为优异的机械性能,对于提高固定化载体对于菌种的负载效果以及参与连续催化反应的稳定性均具有较好的积极意义。同时纳米氧化铝整体显正电荷,丙烯腈整体显负电荷,而丙烯酰胺整体显正电荷;在正负电荷的影响下,体系中的丙烯腈会趋向于与固定化载体接触反应,有助于进一步提高菌种所产生的腈水合酶与丙烯腈接触反应效果;而体系中逐渐生成的丙烯酰胺会趋向于远离固定化载体,即可以有效减少丙烯酰胺对于菌种及腈水合酶的毒害,对于保障菌种及腈水合酶的活性具有积极意义,从而进一步提高生产得到的丙烯酰胺质量。
另外,纳米氧化铝对于丙烯腈中的过氧化物杂质具有较为优异的吸附效果,可以进一步减少丙烯腈原料中的过氧化物杂质对于体系反应的不良影响,并且可以使得生产得到的丙烯酰胺质量更佳。
在一个具体的可实施方案中,所述溶解共混步骤中,所述纳米氧化铝预先经含双键的硅烷偶联剂浸渍处理,得到改性后的纳米氧化铝;然后在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入改性后的纳米氧化铝,并调节pH至弱碱性,超声分散后得到混合液。
通过采用上述技术方案,为了使得纳米氧化铝更好地分散在固定化载体中,减少纳米氧化铝发生团聚等不良现象。进一步优化固定化载体的制备,具体是先通过含双键的硅烷偶联剂浸渍纳米氧化铝,在纳米氧化铝表面引入双键基团。由于含疏基微孔聚合物中的疏基与改性后的纳米氧化铝表面引入的双键基团在弱碱环境下可以发生相互作用,使得改性后的纳米氧化铝与含疏基微孔聚合物接枝在一起,进而使得改性后的纳米氧化铝可以较好地分散在固定化载体中,进一步优化固定化载体的综合性能。
在一个具体的可实施方案中,所述溶解共混步骤中,所述纳米氧化铝包括纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3。
通过采用上述技术方案,纳米α-Al2O3·3H2O中含有一定的结晶水,在固定化载体制备过程中,首先纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3会较好地分散在固定化载体体系中;并且在后续烘干操作中结晶水会被除去,而在结晶水转化为水蒸气被除去的过程中,会在固定化载体中的聚合物结构中留下孔隙;进而使得固定化载体具有更为丰富的孔隙结构,对于提高固定化载体对于菌种的负载效果以及与丙烯腈的接触反应效果具有积极意义。
同时纳米γ-Al2O3相较于纳米α-Al2O3·3H2O具有更为优异的比表面积、孔隙结构以及活性,两者复配使用效果更佳。
在一个具体的可实施方案中,所述纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3的质量比为1:(5.6~7.2)。
在一个具体的可实施方案中,所述成型处理步骤中,烘干温度为110~130℃。
通过采用上述技术方案,烘干温度为110~130℃,在能够较好的实现烘干效果的基础上,可以有效促使纳米α-Al2O3·3H2O中的结晶水被转化为水蒸气释放。
在一个具体的可实施方案中,初步培养的菌种是经丙烯腈溶液梯度驯化后得到。
通过采用上述技术方案,由于丙烯腈对于菌种也有较低程度的毒害影响,因此在初步培养并大量发酵繁殖菌种之前,采用丙烯腈溶液对菌种进行梯度驯化,逐步优化菌种对丙烯腈的耐受性,从而可以有效减小固定化载体在正负电荷影响下趋近于丙烯腈所导致的负面影响,进而进一步保障菌体及腈水合酶的活性。
在一个具体的可实施方案中,所述梯度驯化过程中,控制丙烯腈浓度呈3g/L、5g/L、7g/L和9g/L依次变化。
通过采用上述技术方案,控制丙烯腈浓度依次呈3g/L、5g/L、7g/L和9g/L梯度变化,有利于逐步提高菌种对于丙烯腈的耐受性;并且最高浓度保持在9g/L,即在较好地提高菌种对于丙烯腈的耐受性的同时,可以有效减少超过菌种耐受限度而导致菌种死亡的情况。
在一个具体的可实施方案中,所述催化水合步骤中,所述固定化菌种、丙烯腈和纯水的质量比为1:(2.1~2.9):(7.1~8.6)。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1.本申请以聚乳酸和上述结构式的含疏基微孔聚合物作为固定化载体的原料,所得到的固定化载体具有丰富的微孔结构和独特的两亲性,并且具有较好的机械性能、生物相容性和较低的生物毒性,在较为充分和稳定地负载菌种的基础上,可以保障较高的菌种及腈水合酶活性,且便于菌种产生的腈水合酶与丙烯腈的接触反应,对于后续菌种所产生的腈水合酶参与连续催化反应的效果具有积极意义,同时固定化载体可以有效吸附水合体系中的杂质,配合本申请中的工艺可以得到质量较好且转化率较高的丙烯酰胺。
2.本申请进一步在固定化载体中添加纳米氧化铝,在进一步优化固定化载体机械性能以及孔隙结构的同时,纳米氧化铝所形成的正电荷效应,可以有效使得固定化载体与丙烯腈亲近,并与毒性较大的丙烯酰胺疏远,进而保障菌种及腈水合酶的活性,对于提高催化水合效果及生产的丙烯酰胺质量具有积极意义。
3.本申请进一步用含双键的硅烷偶联剂处理纳米氧化铝,然后再弱碱环境下促使纳米氧化铝与含疏基微孔聚合物发生接枝,从而使得纳米氧化铝在固定化载体中的分散效果较好,减少出现团聚等不良现象。
4.本申请进一步选用纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3复配作为纳米氧化铝原料,在保障纳米氧化铝较好的综合性能的同时,通过结晶水以水蒸气的形式释放,赋予固定化载体更为丰富的孔隙结构,进一步优化固定化载体的综合性能。
5.本申请预先采用丙烯腈溶液梯度驯化的方式,提高菌种对于丙烯腈的耐受性,进一步保障体系中菌种及腈水合酶的活性。
具体实施方式
本实施方式中的菌种为红球菌。
本实施方式中培养菌种的筛选培养基包括以下质量浓度的组分:葡萄糖15g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠1g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.3g/L和尿素2.5g/L,pH为7.0~7.5;用于菌种发酵的发酵培养基包括以下质量浓度的组分:葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁1g/L、氯化钴0.15g/L,pH为6.5~7.5。
本实施方式中培养菌种的具体操作如下:在消毒后的容器中加入筛选培养基及菌种,菌种与筛选培养基的质量比控制在1:(7~10),在28℃下在旋转式摇床中振荡培养70~100h,振荡速率保持在200~400rpm,得到菌种液;然后再将菌种液和发酵培养基加入消毒后的发酵罐内,控制菌种液与发酵培养基的质量比为1:(10~14),通入压缩空气,在28℃下发酵50~140h,发酵液经微滤膜过滤洗涤后2~5h,得到菌溶液。
本实施方式中的菌种优选在预先经丙烯腈溶液梯度驯化后再进行初步培养和大量发酵繁殖,梯度驯化过程中控制丙烯腈浓度呈3g/L、5g/L、7g/L和9g/L变化。
本实施方式中的固定化载体由聚乳酸和含疏基微孔聚合物构成,制备固定化载体的过程中两者的质量比优选1:(1.5~2.1),且优选数均分子量为10000~30000的聚乳酸,优选数均分子量为30000~50000的含疏基微孔聚合物。
以下结合制备例、实施例和对比例对本申请作进一步详细说明,本申请涉及的原料均可通过市售获得。
固定化载体制备例
制备例1-11和对比制备例2、对比制备例4中所用到的聚乳酸均为以下合成路线得到的环状内酯单体经开环聚合制得;
制备例1
一种固定化载体,包括以下质量的原料:10kg聚乳酸、18kg含疏基微孔聚合物;
含疏基微孔聚合物的结构式如下:
上述固定化载体的制备方法包括以下步骤:
A1溶解共混:在室温下将聚乳酸和含疏基微孔聚合物溶于氯仿中,得到混合液;
A2成型处理:在50~60℃的温度下减压蒸出混合液中的氯仿,得到初产物;初产物再依次经洗涤、烘干、粉碎操作后得到粒径为2~10mm的成品固定化载体,其中洗涤操作为分三次用乙醇溶液冲洗初产物,烘干温度为110℃。
制备例2
本制备例与制备例1的区别之处在于,固定化载体的原料还包括0.8kg纳米氧化铝,且纳米氧化铝由纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3按照质量比为1:6.4组成,且粒径为30~70nm;
在A1溶解共混步骤中,当聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后,加入纳米氧化铝,超声分散30min后得到混合液。
制备例3
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝由纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3按照质量比为1:5.6组成。
制备例4
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝由纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3按照质量比为1:7.2组成。
制备例5
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝由纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3按照质量比为1:1组成。
制备例6
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝由纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3按照质量比为1:10组成。
制备例7
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝为纳米α-Al2O3·3H2O。
制备例8
本制备例与制备例2的区别之处在于,纳米氧化铝为纳米γ-Al2O3。
制备例9
本制备例与制备例2的区别之处在于,用等量的纳米二氧化硅替换纳米氧化铝。
制备例10
本制备例与制备例2的区别之处在于,A1溶解共混步骤中,在35℃的温度下,将纳米氧化铝浸渍在含双键的硅烷偶联剂中2h,得到改性后的纳米氧化铝;然后在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入改性后的纳米氧化铝,并加入三乙胺调节pH至7.5~8,超声分散1h后得到混合液;其中含双键的硅烷偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷。
制备例11
本制备例与制备例10的区别之处在于,用等量的硅烷偶联剂KH-550替换乙烯基三乙氧基硅烷。
制备例12
本制备例与制备例1的区别之处在于,聚乳酸为常规市购聚乳酸,重复单元不富含羟基结构。
对比制备例1
本对比制备例与制备例1的区别之处在于,不添加聚乳酸。
对比制备例2
本对比制备例与制备例1的区别之处在于,不添加含疏基微孔聚合物。
对比制备例3
本对比制备例与制备例2的区别之处在于,不添加聚乳酸,余量用含疏基微孔聚合物补足。
对比制备例4
本对比制备例与制备例2的区别之处在于,不添加含疏基微孔聚合物,余量用聚乳酸补足。
实施例
实施例1
一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,包括以下步骤:
S1菌种培养:在消毒后的容器中加入筛选培养基及菌种,菌种与筛选培养基的质量比控制在1:8,28℃下在旋转式摇床中振荡培养80h,振荡速率保持在200rpm,得到菌种液;然后再将菌种液和发酵培养基加入消毒后的发酵罐内,控制菌种液与发酵培养基的质量比为1:10,通入压缩空气,在28℃下发酵70h,发酵液经微滤膜过滤洗涤3h,得到菌溶液;
S2菌种固定化:按照质量比2:1充分混合菌溶液与固定化载体后,静置2h,过滤后得到固定化菌种;
S3催化水合:按照固定化菌种、丙烯腈和纯水的质量比为1:2.8:7.2,将固定化菌种加入纯水中,然后持续滴加丙烯腈,始终保持水合体系中的丙烯腈质量浓度小于1%,室温下催化发生水合反应4h,得到水合液;
S4后处理:水合液经超滤膜过滤后得到丙烯酰胺粗品液,且过滤后的固定化菌种继续回用,每批次的固定化菌种回用3~5次,再依次经过连续离子交换和提浓3~4h后得到质量百分含量为40~50%的丙烯酰胺液体成品;
其中菌种为红球菌;
培养菌种的筛选培养基包括以下质量浓度的组分:葡萄糖15g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠1g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.3g/L和尿素2.5g/L,pH为7.0~7.5;
用于菌种发酵的发酵培养基包括以下质量浓度的组分:葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁1g/L、氯化钴0.15g/L,pH为6.5~7.5;
固定化菌种为制备例1中制备得到。
实施例2~12与实施例1的区别之处在于固定化菌种为不同制备例制备得到,具体的对应关系如下表所示。
表1实施例中固定化菌种与制备例的对照关系表
实施例2 | 制备例2 |
实施例3 | 制备例3 |
实施例4 | 制备例4 |
实施例5 | 制备例5 |
实施例6 | 制备例6 |
实施例7 | 制备例7 |
实施例8 | 制备例8 |
实施例9 | 制备例9 |
实施例10 | 制备例10 |
实施例11 | 制备例11 |
实施例12 | 制备例12 |
实施例13
本实施例与实施例2的区别之处在于,S1菌种培养步骤中,在消毒后的容器中加入的菌种是经丙烯腈溶液梯度驯化后得到,具体的驯化过程如下:
向菌株发酵液中加入丙烯腈,丙烯腈的初始浓度为3g/L,继续振荡培养,通过间歇加入丙烯腈,控制丙烯腈浓度依次呈3g/L、5g/L、7g/L和9g/L变化,筛选出丙烯腈浓度达到9g/L后生长的菌种备用。
实施例14
本实施例与实施例13的区别之处在于,梯度驯化过程中,丙烯腈溶液浓度依次呈2g/L、4g/L、6g/L和8g/L变化,最后筛选出丙烯腈浓度达到8g/L后生长的菌种备用。
实施例15
本实施例与实施例13的区别之处在于,梯度驯化过程中,丙烯腈溶液浓度依次呈4g/L、6g/L、8g/L和10g/L变化,最后筛选出丙烯腈浓度达到10g/L后生长的菌种备用。
对比例
对比例1
本对比例与实施例1的区别之处在于,固定化载体为对比制备例1中制备得到。
对比例2
本对比例与实施例1的区别之处在于,固定化载体为对比制备例2中制备得到。
对比例3
本对比例与实施例1的区别之处在于,固定化载体为对比制备例3中制备得到。
对比例4
本对比例与实施例1的区别之处在于,固定化载体为对比制备例4中制备得到。
对比例5
本对比例与实施例1的区别之处在于,S2菌种固定化步骤中采用海藻酸钠作为固定化载体,具体操作如下:将海藻酸钠溶于水,再加入菌溶液混合均匀,得到混合液,并保持混合液中海藻酸钠质量浓度为2%;将混合液逐滴滴入5%氯化钙溶液中,固定2h后,依次经过滤、洗涤操作后得到固定化菌种。
性能检测试验方法
腈水合酶活性:在实施例1~15和对比例1~5中S3水合催化步骤中水合液的丙烯酰胺质量百分含量分别为5%、15%和30%时,取出适量固定化菌种作为试验样品,并将水合液的丙烯酰胺质量百分含量分别为5%、15%和30%的试验样品分别标号类别-5%、类别-15%、类别-30%;分别测定固定化菌种中腈水合酶的活性。
固定化菌种结合稳定性:分别检测实施例1和实施例12,S2菌种固定化步骤中得到的固定化菌种的稳定性,具体检测方法如下:分别将等量的实施例1和实施例12中的固定化菌种置于盛有培养基的容器中振荡5min,然后将振荡处理后的培养基,定量涂布在平皿培养基表面,无菌条件下28℃培养48H后观察菌落数量。菌落数量多,说明结合不牢靠,菌种易脱落;菌落数量少,说明结合牢靠,菌种不易脱落。培养基具体组成:见葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁1g/L、氯化钴0.15g/L,pH为6.5~7.5。试验过程中用到的器具均经过灭菌处理。
表2.1检测数据表
表2.2检测数据表
检测项目 | 实施例1 | 实施例12 |
菌落情况 | 菌落数量较少 | 菌落数量较多 |
通过表2.2的检测数据表,实施例1中的固定化菌种在经振荡处理后定量涂布在平皿培养基表面,培养48h所产生的菌落数量较少,而实施例12中的固定化菌种在经振荡处理后定量涂布在平皿培养基表面,培养48h所产生的菌落数量较多。分析可知,富含羟基结构的聚乳酸作为原料之一得到的固定化载体,由于羟基与菌种中的亚氨基、氨基和疏基均具有较好的结合效果,从而可以使得菌种与固定化载体之间的结合稳定性更佳,稳定性更佳的固定化菌种应用至催化水合反应中的效果也更佳。
通过分析表2.1的检测数据表,并结合实施例1和对比例5的检测数据来看,在丙烯酰胺质量百分含量分别为5%、15%和30%时,实施例1中的腈水合酶活性均显著优于对比例5。分析可知,以聚乳酸和含疏基微孔聚合物构成的固定化载体负载菌种的方式,相较于用海藻酸钠包覆菌种的方式,明显可以更大程度地保障腈水合酶的活性;且从丙烯酰胺含量增大对腈水合酶活性的负面影响来看,实施例1中丙烯酰胺的负面影响程度也明显小于对比例5,说明实施例1中的固定化菌种的方式明显优于对比例5。
结合实施例1和对比例1~2的检测数据来看,固定化载体中聚乳酸和含疏基微孔聚合物之间存在明显的配合协同关系。即两者配合后可以赋予固定化载体独特的双亲性及微孔结构,对于提高腈水合酶活性具有较为显著的积极意义。
结合实施例1和实施例2的检测数据来看,在固定化载体制备过程中进一步添加纳米氧化铝,不仅能够优化固定化载体的微孔结构,并且在电荷作用的影响下,可以赋予固定化载体亲丙烯腈疏丙烯酰胺的特性,可以在提高腈水合酶与丙烯腈接触反应的基础上,通过疏远丙烯酰胺减少其产生的负面影响,对于提高腈水合酶活性具有显著的积极意义。
结合实施例2和对比例3~4的检测数据来看,在进一步添加纳米氧化铝的基础上,缺少了聚乳酸和含疏基微孔聚合物中的任意一种也明显会影响到腈水合酶的活性。
结合实施例2和实施例10的检测数据来看,采用含双建的硅烷偶联剂预先处理纳米氧化铝,并通过后续反应实现纳米氧化铝以接枝的形式与含疏基微孔聚合物结合,从而优化纳米氧化铝在固定化载体中的分散效果,具有明显的积极意义。
结合实施例2和实施例13的检测数据来看,预先利用丙烯腈溶液对菌种进行梯度驯化,由于丙烯腈对于菌种具有较低程度的毒害效果,会在一定程度上影响催化水合过程中腈水合酶的活性。而经梯度驯化后的菌种对于丙烯腈的耐受性得到改善,可以进一步保障腈水合酶的活性;并且对于本申请中进一步通过纳米氧化铝所形成的电荷效应实现固定化载体亲丙烯腈的技术方案,也具有一定的支撑作用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述固定化载体的制备方法如下:
溶解共混:将聚乳酸和含疏基微孔聚合物溶于有机溶剂中,得到混合液;
成型处理:蒸出混合液中的有机溶剂,依次经洗涤、烘干、粉碎操作后得到成品固定化载体。
3.根据权利要求2所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述溶解共混步骤中,在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入纳米氧化铝,超声分散后得到混合液。
4.根据权利要求3所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述溶解共混步骤中,所述纳米氧化铝预先经含双键的硅烷偶联剂浸渍处理,得到改性后的纳米氧化铝;然后在聚乳酸和含疏基微孔聚合物充分溶解后加入改性后的纳米氧化铝,并调节pH至弱碱性,超声分散后得到混合液。
5.根据权利要求3所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述溶解共混步骤中,所述纳米氧化铝包括纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3。
6.根据权利要求5所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述纳米α-Al2O3·3H2O和纳米γ-Al2O3的质量比为1:(5.6~7.2)。
7.根据权利要求3所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述成型处理步骤中,烘干温度为110~130℃。
8.根据权利要求3所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述菌种培养步骤中,初步培养的菌种是经丙烯腈溶液梯度驯化后得到。
9.根据权利要求8所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述梯度驯化过程中,控制丙烯腈浓度呈3g/L、5g/L、7g/L和9g/L依次变化。
10.根据权利要求1所述的一种微生物法生产丙烯酰胺的工艺,其特征在于,所述催化水合步骤中,所述固定化菌种、丙烯腈和纯水的质量比为1:(2.1~2.9):(7.1~8.6)。
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