CN115554475B - 一种骨软骨支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种骨软骨支架及其制备方法，所述骨软骨支架包括软骨层；和与所述软骨层紧密结合以支撑所述软骨层的骨层，其中，所述软骨层包含多条大致沿所述软骨层与所述骨层之间的结合面的法向的孔道，所述骨层包含多条与所述结合面大致平行的孔道。本申请提供的骨软骨支架软骨层和骨层的取向结构可以引导细胞定向的粘附和增殖，加速组织再生；其中软骨层的孔道，仿生了天然软骨结构；骨层的孔道抑制新生骨组织和血管侵入软骨层，从而达到促进软骨修复的效果。本申请提供的一种骨软骨支架的制备方法步骤简单，成本较低，且不需要使用复杂的技术和仪器，适合于工业化生产。

Description

一种骨软骨支架及其制备方法
技术领域
本申请涉及组织工程生物材料领域，具体涉及一种骨软骨支架及其制备方法。
背景技术
创伤、衰老和疾病所导致关节软骨缺损通常同时伴有软骨下骨缺损。在损伤后，骨可以在一定程度上进行自我修复，而关节软骨的自我修复能力非常有限，主要因为软骨内源性祖细胞数量有限，以及软骨的致密、无血管、无神经和淋巴组织的特性不利于外源性祖细胞侵袭和分化。骨软骨缺损由于其复杂的层次结构而缺乏自我修复的能力。解决方法之一是利用恰当的组织工程生物材料取代受损区域并促进组织再生。
目前已经有多种骨软骨支架用于骨软骨再生修复，但现有技术中骨软骨支架没有仿生天然软骨结构，导致修复效果较差，同时没有阻挡骨层血管对软骨侵扰的明确的结构。
发明内容
本申请提供了一种骨软骨支架及其制备方法，该骨软骨支架具有骨层以及软骨层，软骨层具有仿生天然软骨结构，且骨层能引导新生血管径向生长，减少向上对软骨层的侵扰。
第一方面，本申请提供了一种骨软骨支架，包括：
软骨层；和
与所述软骨层紧密结合以支撑所述软骨层的骨层，其中，所述软骨层包含多条大致沿所述软骨层与所述骨层之间的结合面的法向的孔道，所述骨层包含多条与所述结合面大致平行的孔道。
本申请的技术方案中，本申请提供的骨软骨支架具有软骨层和骨层，且具有不同取向的孔道，软骨层和骨层孔道的取向结构可以引导细胞定向的粘附和增殖，加速组织再生；其中软骨层与结合面垂直的孔道，仿生了天然软骨结构；骨层与结合面平行的孔道抑制新生骨组织和血管侵入软骨层。
在本申请的一些实施例中，所述软骨层和所述骨层的组成材料为亲水胶体。
在本申请的一些实施例中，所述亲水胶体为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钠、细菌纤维素其中一种或多种。
在本申请的一些实施例中，所述软骨层中含有促间充质干细胞成软骨分化因子；所述促间充质干细胞成软骨分化因子为血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸其中一种或几种；
可选的，所述骨层中含有促间充质干细胞成骨分化因子；所述促间充质干细胞成骨分化因子为羟基磷灰石，碳酸盐磷灰石，β-磷酸三钙其中一种或几种。
在本申请的一些实施例中，所述骨软骨支架形状为圆柱体或长方体。
第二方面，本申请提供了一种骨软骨支架的制备方法，包括以下步骤：
S10：将骨层浆料注入第一管状模具中，并以使所述骨层浆料具有沿管状模具径向的温度梯度的方式进行冷冻，得到具有结合面的固态骨层型坯；
S20：将第二管状模具与所述第一管状模具连接，以使所述固态骨层型坯的所述结合面暴露于所述第二管状模具的型腔，并且所述结合面的法向大致沿所述第二管状模具的轴向；
S30：将软骨层浆料注入所述第二管状模具中，并以使所述软骨层浆料具有沿所述第二管状模具轴向的温度梯度的方式进行冷冻，得到与所述固态骨层型坯的结合面紧密结合的固态软骨层型坯；
S40：将所述固态骨层型坯和所述固态软骨层型坯冷冻干燥，得到所述骨软骨支架。
在本申请的技术方案中，通过控制对软骨层浆料和骨层浆料的冷冻方式，从而得到具有不同孔道取向的骨层和软骨层的骨软骨支架，本申请提供的骨软骨支架的制备方法步骤简单，成本较低，且不需要使用复杂的技术和仪器，适合于工业化生产。
在本申请的一些实施例中，所述步骤S10、S30中，所述软骨层浆料和所述骨层浆料为亲水胶体水溶液；所述亲水胶体水溶液中亲水胶体质量分数为1～10％。
在本申请的一些实施例中，所述步骤S10中，所述骨层浆料还含有促间充质干细胞成骨分化因子；所述促间充质干细胞成骨分化因子在骨层浆料的质量分数为0.1～5％；
可选的，所述步骤S30中，所述软骨层浆料还含有促间充质干细胞成软骨分化因子；所述促间充质干细胞成软骨分化因子在软骨层浆料的质量分数为0.1～5％。
在本申请的一些实施例中，所述第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状为圆形、椭圆形、正方形、长方形其中一种；
优选的，所述第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状为圆形。
在本申请的一些实施例中，所述步骤S10包括：将第一管状模具温度预冷至-15～-25℃，将0～5℃的骨层浆料注入预冷后的第一管状模具中，保持第一管状模具温度为-15～-25℃对所述骨层浆料冷冻10～30min得到固态骨层型坯；
其中，所述第一管状模具的导热系数≥10W/(m·K)；
所述步骤S20包括：以使所述固态骨层型坯的所述结合面向上暴露的方式将所述第一管状模具置于温度为-15～-25℃的平板上；
将第二管状模具与所述第一管状模具连接使所述第一管状模具与所述第二管状模具管状通道对齐，以使所述固态骨层型坯的所述结合面暴露于所述第二管状模具的型腔；
所述步骤S30包括：将所述固态骨层型坯的所述结合面加热熔化，再将软骨层浆料注入所述第二管状模具中，保持第一管状模具与平板的温度为-15～-25℃对所述软骨层浆料冷冻10～60min得到固态软骨层型坯；
其中，所述第二管状模具的导热系数≤0.5W/(m·K)；
所述步骤S40包括：将所述固态骨层型坯和所述固态软骨层型坯冷冻干燥，得到所述骨软骨支架。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1为本申请提供的骨软骨支架结构示意图。
图2为实施例1制备的骨软骨支架沿中心轴向截面图。
其中图中标号为：1-软骨层，2-骨层，3-结合面。
通过上述附图，已示出本申请明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本申请构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本申请的概念。
具体实施方式
本说明书中各实施例或实施方案采用递进的方案描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方案结合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
申请人发现，各种由于创伤、疾病和衰老等原因均可能导致关节软骨组织受损，由于成人的软骨组织中没有血管或神经,因此软骨组织受损后自我修复能力较差,当其受损直径较大时将无法自我愈合，而通过软骨移植、软骨细胞移植等手段得到的软骨不含有天然软骨的组织结构，其力学性能往往不能满足正常需要。
人工软骨支架为软骨缺损修复提供了更多的选择和可能性，而现有技术中软骨支架主要的问题在于，目前制备的人工软骨支架一般具有网状的孔隙，这种不定向的孔隙结构，会导致软骨细胞不定向迁移，导致软骨修复效果不佳；另外由于成骨往往较成软骨更快更高效，因此来源于骨侧的细胞、生长刺激因子会诱导细胞向骨组织分化，导致软骨修复效果不好。
由此，为了解决现有技术中存在的问题，申请人提出了以下技术方案。
第一方面，如图1所示，本申请提供了一种骨软骨支架，包括：
软骨层1；和
与软骨层1紧密结合以支撑软骨层1的骨层2，其中，软骨层1包含多条大致沿软骨层1与骨层2之间的结合面3的法向的孔道，骨层2包含多条与结合面3大致平行的孔道。
本申请的技术方案中，本申请提供的骨软骨支架具有软骨层和骨层，且具有不同取向的孔道，软骨层和骨层孔道的取向结构可以引导细胞定向的粘附和增殖，加速组织再生；其中软骨层与结合面垂直的孔道，仿生了天然软骨结构；骨层与结合面平行的孔道抑制新生骨组织和血管侵入软骨层。
由于正常的深层软骨细胞及胶原排列方式均是沿骨轴方向排列，因此本申请提供的骨软骨支架的软骨层具有相同取向的孔道，可以诱导细胞快速沿孔隙定向迁移，最终促进组织再生；与软骨层紧密连接的骨层具有与结合面大致平行的孔道，可以诱导新生血管平行于结合面生长，从而减少骨层的血管对软骨层的侵扰。
需要说明的是，在本申请的技术方案中，软骨层包含多条大致沿软骨层与骨层之间的结合面的法向的孔道，是指软骨层的孔道方向与结合面的法向之间的夹角不超过8°；同样的，骨层包含多条与结合面大致平行的孔道，是指骨层的孔道方向与结合面之间的夹角不超过8°。
在本申请的一些实施例中，软骨层和骨层的组成材料为亲水胶体。
在上述一些实施例中，由于骨软骨支架需要植入体内发挥作用，因此制作支架的材料必须具有良好的生物相容性、合适的降解率以及极小的毒性；亲水胶体是高分子量长链亲水聚合物，在水中可以分散、溶胀，溶胀后的亲水胶体水溶液经过冷冻干燥，可以形成具有高孔隙率的空间网状材料，自然界中存在大量生物相容性好、毒性低的亲水胶体，因此可以利用其作为骨层以及软骨层的组成材料。
进一步的，在本申请的一些实施例中，软骨层和骨层的组成材料为同样的亲水胶体。
在上述一些实施例中，骨层和软骨层使用同样的亲水胶体材料的目的在于，使骨层与软骨层之间紧密连接，不易发生分离现象，由于亲水胶体含有大量的亲水基团，分子之间易形成大量的氢键，当骨层与软骨层使用的材料相同时，相互作用更好，从而使骨层与软骨层紧密结合。
在本申请的一些实施例中，所述亲水胶体为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钠、细菌纤维素其中一种或多种。
在上述一些实施例中，列举的常用于生物医药领域的几种亲水胶体材料，上述亲水胶体材料均具有良好的生物相容性、合适的降解率以及极小的毒性，适用于作为骨软骨支架的材料。
在本申请的一些实施例中，软骨层中含有促间充质干细胞成软骨分化因子；促间充质干细胞成软骨分化因子为血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)其中一种或几种；
可选的，骨层中含有促间充质干细胞成骨分化因子；促间充质干细胞成骨分化因子为羟基磷灰石，碳酸盐磷灰石，β-磷酸三钙其中一种或几种。。
在上述一些实施例中，可以在软骨层中添加促间充质干细胞成软骨分化因子，有利于促间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化形成软骨细胞，从而加速软骨组织的修复。
进一步，同样的在骨层中添加促间充质干细胞成骨分化因子，有利于骨侧的MSCs向骨组织分化，提高骨组织的修复速率。
另外值得一提的是，由于使用亲水胶体材料制备支架，条件温和，同时亲水胶体含有大量的羟基、氨基等亲水性基团，与促间充质干细胞成软骨分化因子、促间充质干细胞成骨分化因子具有良好的亲和作用，部分促间充质干细胞成软骨分化因子还可能具有提高亲水胶体交联强度的效果，因此使用亲水胶体材料制备的骨软骨支架相比现有技术中其他材料更加适合添加促间充质干细胞成软骨分化因子、促间充质干细胞成骨分化因子。
在本申请的一些实施例中，骨软骨支架形状为柱状，软骨层具有多条大致沿轴向取向的孔道，骨层具有多条大致沿径向取向的孔道。
在上述一些实施例中，具体限定了骨软骨支架的形状，柱状支架是实际中常用的形状，支架植入于骨组织与软骨组织之间，支架的骨层与骨组织结合，软骨层与软骨结合，从而充分发挥促进软骨组织修复的作用。
同样需要说明的是，在上述一些实施例中，软骨层具有多条大致沿轴向取向的孔道，是指软骨层的孔道方向与柱状骨软骨支架轴向线的夹角不超过8°；骨层具有多条大致沿径向取向的孔道，是指骨层具有多条径向取向的孔道径向线的不超过8°。
第二方面，本申请提供了一种骨软骨支架的制备方法，包括以下步骤：
S10：将骨层浆料注入第一管状模具中，并以使骨层浆料具有沿管状模具径向的温度梯度的方式进行冷冻，得到具有结合面的固态骨层型坯；
S20：将第二管状模具与第一管状模具连接，以使固态骨层型坯的结合面暴露于第二管状模具的型腔，并且结合面的法向大致沿第二管状模具的轴向；
S30：将软骨层浆料注入第二管状模具中，并以使软骨层浆料具有沿第二管状模具轴向的温度梯度的方式进行冷冻，得到与固态骨层型坯的结合面紧密结合的固态软骨层型坯；
S40：将固态骨层型坯和固态软骨层型坯冷冻干燥，得到骨软骨支架。
在本申请的技术方案中，通过控制对软骨层浆料和骨层浆料的冷冻方式，从而得到具有不同孔道取向的骨层和软骨层的骨软骨支架，本申请提供的骨软骨支架的制备方法步骤简单，成本较低，且不需要使用复杂的技术和仪器，适合于工业化生产。
在本申请的技术方案中，步骤S10中，对骨层浆料的冷冻方式是使骨层浆料具有沿管状模具径向的温度梯度，由于在冷冻过程中，冰晶形成的方向是沿温度梯度的方向，因此得到的固态骨层型坯中冰晶的方向是径向的，由此冻干后得到具有径向取向的孔道。
步骤S20中，将第二管状模具与第一管状模具连接，以使固态骨层型坯的结合面暴露于第二管状模具的型腔，并且结合面的法向大致沿第二管状模具的轴向，是为了使冷冻后，固态软骨层型坯与固态骨层型坯紧密连接；
步骤S30中，对软骨层浆料的冷冻方式是使骨层浆料具有沿管状模具轴向的温度梯度，同样由于在冷冻过程中，冰晶形成的方向是沿温度梯度的方向，因此得到的固态骨层型坯中冰晶的方向是轴向的，由此冻干后得到具有轴向取向的孔道。
步骤S40中，通过冷冻干燥，去除骨层与软骨层的冰晶，即得到了具有径向取向孔道骨层、具有轴向取向孔道软骨层的骨软骨支架。
在本申请的一些实施例中，步骤S10、S30中，软骨层浆料和骨层浆料为亲水胶体水溶液；亲水胶体水溶液中亲水胶体质量分数为1～10％。
在上述一些实施例中，使用亲水胶体水溶液作为软骨层浆料和骨层浆料，具有成本低、制备方法简单、生物相容性好等优点，同时将亲水胶体质量分数控制在1～10％范围内，浓度过低会导致制备的支架机械强度过低，浓度过高则会导致支架的孔隙率过低，因此需要将亲水胶体质量分数控制在合适范围内。
在本申请的一些实施例中，步骤S10中，骨层浆料还含有促间充质干细胞成骨分化因子；促间充质干细胞成骨分化因子在骨层浆料的质量分数为0.1～5％；
可选的，步骤S30中，软骨层浆料还含有促间充质干细胞成软骨分化因子；促间充质干细胞成软骨分化因子在软骨层浆料的质量分数为0.1～5％。
在上述一些实施例中，在浆料预冷前即加入促间充质干细胞成软骨分化因子以及促间充质干细胞成骨分化因子，在预冷过程中，亲水胶体水溶液充分溶胀，同时促间充质干细胞成软骨分化因子以及促间充质干细胞成骨分化因子通过分子间作用力或氢键与亲水胶体分子紧密结合，同时还能提高亲水胶体在水中的交联程度。
另外，将促间充质干细胞成软骨分化因子以及促间充质干细胞成骨分化因子的质量分数均控制在0.1～5％，过低会导致促分化效果不明显，过高会影响亲水胶体水溶液的交联程度，或导致支架的孔隙率降低，因此需要将促间充质干细胞成软骨分化因子以及促间充质干细胞成骨分化因子的质量分数控制在合适范围内。
在本申请的一些实施例中，第一管状模具和第二管状模具的截面形状为圆形、椭圆形、正方形、长方形其中一种；
优选的，第一管状模具和第二管状模具的截面形状为圆形。
在上述一些实施例中，更具体限定了第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状，其中圆形是更优选的，在第二管状模具形成的是轴向的温度差，因此截面形状对冰晶形成方向影响不大，因此截面形状主要影响的是在第一管状模具中形成的径向的温度差，由于椭圆形、正方形、长方形的四周离几何中心的距离不等，对冰晶形成方向可能有一定的影响，而圆形的四周与几何中心的距离相等，因此得到的径向孔道更加规整。
由此，若实际需要其他不规整的骨软骨支架，可以制作面积更大的圆柱形骨软骨支架后沿轴向进行切割，得到不同形状的骨软骨支架进行使用。
在本申请的一些实施例中，
步骤S10包括：将第一管状模具温度预冷至-15～-25℃，将0～5℃的骨层浆料注入预冷后的第一管状模具中，保持第一管状模具温度为-15～-25℃对骨层浆料冷冻10～30min得到固态骨层型坯；
其中，第一管状模具的导热系数≥10W/(m·K)；
步骤S20包括：以使固态骨层型坯的结合面向上暴露的方式将第一管状模具置于温度为-15～-25℃的平板上；
将第二管状模具与第一管状模具连接使第一管状模具与第二管状模具管状通道对齐，以使固态骨层型坯的结合面暴露于第二管状模具的型腔；
步骤S30包括：将固态骨层型坯的结合面加热熔化，再将软骨层浆料注入所述第二管状模具中，保持第一管状模具与平板的温度为-15～-25℃对所述软骨层浆料冷冻10～60min得到固态软骨层型坯；
其中，第二管状模具的导热系数≤0.5W/(m·K)；
步骤S40包括：将固态骨层型坯和固态软骨层型坯冷冻干燥，得到骨软骨支架。
在上述一些实施例中，提供了一种更具体的骨软骨支架的制备方法，步骤S10中，0～5℃的骨层浆料有利于节约后续冷冻浆料所需时间，提高制备效率；先将第一管状模具预冷至-15～-25℃后再向其中注入预冷好的骨层浆料，并通过将第一管状模具控制在-15～-25℃对管内骨层浆料进行冷冻，这是为了使靠近管状模具的骨层浆料与管中心的骨层浆料形成径向的温度差，由于冰晶形成的方向是沿温度差的方向，因此冷冻后骨层浆料中冰晶的方向为径向，并且以管中心呈放射状分布，由此冻干后得到具有径向取向的孔道；另外，第一管状模具温度不宜过低，过低会导致冰晶的粒径较小，不能形成连续的孔道；且第一管状模具的导热系数应≥10W/(m·K)，保证在冷冻过程中靠近管状模具的骨层浆料与管中心的骨层浆料一直保持径向的温度差；
步骤S20中，以使固态骨层型坯的结合面向上暴露的方式将第一管状模具置于温度为-15～-25℃的平板上，平板温度较低也是为了在步骤S30中软骨层浆料形成轴向的温度差；将第二管状模具与第一管状模具连接使第一管状模具与第二管状模具管状通道对齐，以使固态骨层型坯的结合面暴露于第二管状模具的型腔，是为了骨层与软骨层的结合面更加平整，从而使骨层与软骨层结合更加紧密。
步骤S30中，将固态骨层型坯的结合面加热熔化，再向第二管状模具中注入软骨层浆料，保持第一管状模具与平板的温度为-15～-25℃对所述软骨层浆料冷冻10～60min，且第二管状模具的导热系数应≤0.5W/(m·K)，将结合面加热熔化后再注入软骨层将较可以使骨层与软骨层结合的更加紧密，后续的冷却方式是为了保证在第二管状模具中软骨层浆料在冷冻过程中具有轴向的温度差，软骨层浆料下表面温度为-15～-25℃，在软骨层浆料中形成自上而下温度差，因此冷冻后软骨层浆料的冰晶方向为轴向，由此冻干后得到具有轴向取向的孔道；同样的，冷冻环境温度不宜过低，过低会导致冰晶的粒径较小，不能形成连续的孔道，过高则会影响冷冻效率；第二管状模具的导热系数较小，为不易导热材料制成，是为了防止环境通过模具影响软骨料中间层的温度，从而防止破坏形成的轴向温度差。
步骤S40中，通过冷冻干燥，去除骨层与软骨层的冰晶，即得到了具有径向取向孔道骨层、具有轴向取向孔道软骨层的骨软骨支架。
在本申请的一些实施例中，第一管状模具为黄铜管状模具或不锈钢管状模具；
可选的，第二管状模具为聚乙烯管状模具、聚丙烯管状模具、聚碳酸酯管状模具、聚二甲基硅氧烷管状模具其中一种。
在上述一些实施例中，列举了一些导热性能较好的管状模具以及隔热性能较好的管状模具，可以根据实际情况以及成分方面的考虑选择合适的第一管状模具和第二管状模具。
在本申请的一些实施例中，步骤S30、S40之间还包括：
S41：将固态骨层型坯与固态软骨层型坯在-15～-25℃下冷冻6～24h。
在上述一些实施例中，将固态骨层型坯与固态软骨层型坯继续冷冻6～24h，可以继续促进固态骨层型坯与固态软骨层型坯中不同取向的冰晶进行生长，使后续冷冻干燥得到的孔道更加完整。
在本申请的一些实施例中，更具体的，步骤S10、S30中，骨层浆料与软骨层浆料为壳聚糖水溶液，由于壳聚糖不溶于水，易溶于酸性溶液，因此步骤S40冷冻干燥脱模得到的支架中可能还含有酸性成分，需要对其进行碱洗、PBS缓冲液洗后再次冷冻干燥得到骨软骨支架。由此，骨软骨支架的制备方法还应包括：
S50：将冷冻干燥后的支架经过碱洗、PBS缓冲液洗后冷冻干燥得到骨软骨支架。
而使用其他易溶于水的亲水胶体制备骨软骨支架则无需使用上述步骤。
以下，通过实施例更详细地说明本申请的一种骨软骨支架及其制备方法，但本申请丝毫不限于这些实施例。
实施例1
将壳聚糖粉末通过磁力搅拌溶于溶解在1％乙酸水溶液中制备软骨层浆料，骨层浆料中壳聚糖质量分数为3％；
壳聚糖粉末和羟基磷灰石粉末通过磁力搅拌溶于溶解在1％乙酸水溶液中制备骨层浆料，软骨层浆料中壳聚糖粉末质量分数为3％，羟基磷灰石粉末质量分数为3％；
将骨层浆料于4℃预冷24h；软骨层浆料保持在常温中。
将圆形不锈钢管状模具预冷至-20℃，同时使用液氮将圆形不锈钢管状模具保持在-15～-25℃，将骨层浆料注入圆形不锈钢管状模具中冷冻20min得到固态骨层型坯；
将圆形不锈钢管状模具置于温度为-20℃的钢板上；
在圆形不锈钢管状模具上方连接圆形PDMS(聚二甲基硅氧烷)管状模具，使其通道对齐，圆形不锈钢管状模具与圆形PDMS管状模具为同一内径，以使固态骨层型坯的结合面暴露于圆形PDMS管状模具的型腔中；
将固态骨层型坯的结合面加热至刚好熔化后，迅速将软骨层浆料注入圆形PDMS管状模具中，使用液氮将圆形不锈钢管状模具、钢板保持在-15～-25℃，对软骨层浆料进行冷冻；
冷冻后装有浆料的模具放置于-20℃的冰箱中冷冻24h，再进行冷冻干燥、脱模得到冻干支架；
将冻干支架置于0.1mol/L氢氧化钠乙醇溶液中浸泡20min，再将其放入PBS缓冲液中冲洗3次，每次15min，再将支架冷冻干燥得到骨软骨支架。
制备得到的骨软骨支架沿中心轴向截面如图2所示，可以看出上层的软骨层具有轴向取向的孔道，下层的骨层具有径向取向的孔道，且上层的软骨层与下层的骨层之间紧密连接。因此通过本申请提供的技术方案制备得到的骨软骨支架可以引导细胞定向的粘附和增殖，加速组织再生；其中软骨层轴向取向孔道，仿生了天然软骨结构；骨层径向取向孔道抑制新生骨组织和血管侵入软骨层。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种骨软骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：将骨层浆料注入第一管状模具中，并以使所述骨层浆料具有沿管状模具径向的温度梯度的方式进行冷冻，得到具有结合面的固态骨层型坯；
S20：将第二管状模具与所述第一管状模具连接，以使所述固态骨层型坯的所述结合面暴露于所述第二管状模具的型腔，并且所述结合面的法向大致沿所述第二管状模具的轴向；
S30：将软骨层浆料注入所述第二管状模具中，并以使所述软骨层浆料具有沿所述第二管状模具轴向的温度梯度的方式进行冷冻，得到与所述固态骨层型坯的结合面紧密结合的固态软骨层型坯；
S40：将所述固态骨层型坯和所述固态软骨层型坯冷冻干燥，得到所述骨软骨支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S10、S30中，所述软骨层浆料和所述骨层浆料为亲水胶体水溶液；所述亲水胶体水溶液中亲水胶体质量分数为1～10％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲水胶体为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钠、细菌纤维素其中一种或多种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S10中，所述骨层浆料还含有促间充质干细胞成骨分化因子；所述促间充质干细胞成骨分化因子在骨层浆料的质量分数为0.1～5％。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述促间充质干细胞成骨分化因子为羟基磷灰石，碳酸盐磷灰石，β-磷酸三钙其中一种或几种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S30中，所述软骨层浆料还含有促间充质干细胞成软骨分化因子；所述促间充质干细胞成软骨分化因子在软骨层浆料的质量分数为0.1～5％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述促间充质干细胞成软骨分化因子为血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸其中一种或几种。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状为圆形、椭圆形、正方形、长方形其中一种。
9.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状为圆形。
10.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤S10包括：将第一管状模具温度预冷至-15～-25℃，将0～5℃的骨层浆料注入预冷后的第一管状模具中，保持第一管状模具温度为-15～-25℃对所述骨层浆料冷冻10～30min得到固态骨层型坯；
其中，所述第一管状模具的导热系数≥10W/(m·K)；
所述步骤S20包括：以使所述固态骨层型坯的所述结合面向上暴露的方式将所述第一管状模具置于温度为-15～-25℃的平板上；
将第二管状模具与所述第一管状模具连接使所述第一管状模具与所述第二管状模具管状通道对齐，以使所述固态骨层型坯的所述结合面暴露于所述第二管状模具的型腔；
所述步骤S30包括：将所述固态骨层型坯的所述结合面加热熔化，再将软骨层浆料注入所述第二管状模具中，保持第一管状模具与平板的温度为-15～-25℃对所述软骨层浆料冷冻10～60min得到固态软骨层型坯；
其中，所述第二管状模具的导热系数≤0.5W/(m·K)；
所述步骤S40包括：将所述固态骨层型坯和所述固态软骨层型坯冷冻干燥，得到所述骨软骨支架。
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