CN115552215A - 用于热辅助酶消化的方法 - Google Patents

用于热辅助酶消化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115552215A
CN115552215A CN202180033902.3A CN202180033902A CN115552215A CN 115552215 A CN115552215 A CN 115552215A CN 202180033902 A CN202180033902 A CN 202180033902A CN 115552215 A CN115552215 A CN 115552215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
digestion
protein
solid support
coating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180033902.3A
Other languages
English (en)
Inventor
李文静
B·穆里蒂
A·博德曼
M·A·劳伯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Waters Technologies Corp
Original Assignee
Waters Technologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Waters Technologies Corp filed Critical Waters Technologies Corp
Publication of CN115552215A publication Critical patent/CN115552215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4044—Concentrating samples by chemical techniques; Digestion; Chemical decomposition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本公开涉及一种消化包含蛋白质的样本的方法，该方法包括：将样本添加到装置中，该装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中表面涂层使酶固定化，同时减少样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在表面涂层上以用于消化样本的蛋白质；以及加热样本以完成蛋白质的热辅助消化。

Description

用于热辅助酶消化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月8日提交的名称为“Methods for Heat-Assisted EnzymeDigestion”的美国临时专利申请第63/022,056号的优先权和权益。该专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于热辅助生物分子样本处理(例如，消化和亲和配体纯化)的方法。更具体地，本公开涉及涂层(诸如异官能涂层)结合用于进行生物分析的样本处理(例如，清理、样本释放)的热量将生物分子缀合在固体载体表面上的用途。
背景技术
生物分子是复杂的分子，其需要复杂的工作流进行分析。这些复杂的工作流涉及多个步骤，包括各种样本制备步骤，诸如样本清理和蛋白质消化。在不影响样本质量(例如，不引入需要附加清理的副产品)的情况下，获得基本上完全消化具有挑战性。例如，一些用于消化的酶当在溶液中使用时可能变得不稳定，从而导致副产品。在升高的温度下进行消化可改善工作流的吞吐量。然而，由于因热诱导的变性或其它构象变化，酶通常在特定温度范围内最有效。但是在酶的特定温度范围内，蛋白质的自溶可显著增多。另外，热源的硬件可能难以对可再现性进行基准测试和评估。
发明内容
生物分子是复杂的分子，其需要复杂的工作流进行分析。这些复杂的工作流涉及多个步骤，包括各种样本制备步骤，诸如样本清理和蛋白质消化。在不影响样本质量(例如，不引入需要附加清理的副产品)的情况下，获得基本上完全消化具有挑战性。例如，一些用于消化的酶当在溶液中使用时可能变得不稳定，从而导致副产品。
然而，由于因热诱导的变性或其它构象变化，酶通常在特定温度范围内最有效。但是在酶的特定温度范围内，蛋白质的自溶可显著增多。另外，热源的硬件可能难以对可再现性进行基准测试和评估。
这些酶的固定化有助于使酶稳定。然而，用于使酶固定化的常规技术导致与载体的表面发生次级相互作用，从而影响消化效率和样本回收率。
利用固定化酶，可提高消化温度。并且可减少与升高的温度相关联的缺点。结果是在不牺牲消化质量的情况下增加了工作流。
一般来讲，本公开涉及一种快速消化方法，该快速消化方法由热辅助，以在数分钟内有效地完成消化，同时提供高保真肽谱，该快速消化方法是可靠的，并且适用于在受控环境中进行生物学研究或蛋白质治疗剂表征。高保真被定义为与常规溶液中消化工作流相比，提供治疗性蛋白质的＞95％序列覆盖率、＜10％漏切、可比改性(在25℃至100℃下进行消化之后，热诱导改性为大约＜5％，并且在一些示例中小于1％)的消化工作流结果。
高保真消化工作流用于肽图、二硫键图、中间向上、中间向下、自下而上的蛋白质组学、蛋白质鉴定、蛋白质定量、生物分析、其他消化相关应用或其他应用(例如，使用亲和配体的应用)。该方法包括热稳定酶、消化缓冲液(或其它类型的缓冲液)、热源以及通过清理或反应淬灭获得样本以备进行下游分析(荧光、UV、LC-MS检测)的步骤。
本公开提供用于在热辅助的情况下进行快速酶消化的方法。快速消化方法可用于蛋白质/肽分析。一般来讲，该方法包括以下中的一者或多者：热稳定酶、消化缓冲液、热源以及通过清理或反应淬灭设定样本以备进行下游分析(荧光、UV、LC-MS检测)的步骤。例如，一些方法包括以下组分：在固体载体上的具有优异的热稳定性和亲水性特性(使非特异性结合最小化)的固定化酶；在升高的温度下支持酶(诸如胰蛋白酶)活性的动力学，同时还使肽上的热诱导改性最小化的消化缓冲液；确保最大热传递效率，并且尽可能减少非特异性结合的装置(例如，小瓶、板或柱)。
本公开提供了一种处理包含蛋白质的样本的方法，该方法包括：将样本添加到装置中，该装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中表面涂层使酶和亲和配体固定化，同时减少样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在表面涂层上以用于消化样本中的蛋白质；将亲和配体固定化在表面涂层上以用于靶向捕获样本中的蛋白质；用表面涂层上的固定化酶消化样本中的蛋白质；用表面涂层上的固定化亲和配体靶向捕获样本的一部分；以及加热样本以激活蛋白质的消化。在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在蛋白质的消化之前。在某些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在消化期间。在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在消化之后。并且在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在蛋白质的消化之前、期间和/或之后。在一些实施方案中，缓冲液选自由以下项组成的组：Tris、BIS-Tris、2-乙磺酸(MES)、HEPES、三乙醇胺和三甲胺。缓冲液可含有二价离子，诸如CaCl2。溶液中的缓冲液可含有多元醇，该多元醇选自由以下项组成的组但不限于以下项：甘油、木糖醇、丙二醇、丁二醇或赤藓糖醇。在一些实施方案中，溶液中的缓冲液包含木糖醇和CaCl2。在一些实施方案中，将甲硫氨酸添加到溶液中的缓冲液中。在一些实施方案中，溶液中的缓冲液进一步包含一种或多种添加剂，诸如例如木糖醇、甲硫氨酸和/或CaCl2。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1是根据本公开的热谱曲线图。
图2是根据本公开的热谱曲线图。
图3A是示出将精氨酸添加到消化缓冲液中对疏水性肽回收率的影响的图。图3B是示出将精氨酸添加到消化缓冲液中对消化效率的影响的图。图3C是示出将二甲基-精氨酸添加到消化缓冲液中对疏水性肽回收率的影响的图。图3D是示出将二甲基-精氨酸添加到消化缓冲液中对消化效率的影响的图。
图4是根据本公开的在用固定化酶培养之后的疏水性肽的混合物的回收率的图。
图5是在70℃下在消化缓冲液中培养之后的释放的胰蛋白酶的图。
图6A、图6B和图6C是显示NIST mAb在变化的条件下被消化之后生成的LC-MS色谱的图。
图7是显示根据本公开的比较示例的漏切％和序列覆盖率％的图。
图8A、图8B和图8C是在不同温度下比较消化示例的图。
图9A和图9B是比较Ca2+浓度对消化效率和非特异性结合的影响的图。
图10A和图10B是比较pH对消化效率和脱酰胺％的影响的图。
图11A和图11B是比较Tris浓度对消化效率和非特异性结合的影响的图。
图12A和图12B是比较多元醇对消化效率和非特异性结合的影响的图。图12C是显示使用甘油和木糖醇的消化结果的比较的图。
图13是显示甲硫氨酸对防止人工氧化的影响的图。
图14是显示乙腈对减少人工脱酰胺的影响的图。
图15是显示示例之间的消化效率比较的图。
图16显示了200μL PCR管中的典型反应装置。
图17显示了来自图15中使用的管的PCR管的尺寸。
图18是胰蛋白酶消化当前工作流的示例的流程图。
具体实施方式
与通常在37℃下进行的传统溶液中的消化相比，在升高的温度下进行蛋白质消化因消化不完全性、与树脂非特异性结合以及对肽产生热诱导改性而已经存在问题。通过用特定表面化学物质使固定化酶工程化，本公开有利于生成与溶液中的消化高度相似的特征，但消化仅需要数分钟的工作流。已经对消化缓冲液进行调制，以提高肽回收率和酶活性。
值得注意的是，本公开的消化完全性为90％至95％，与仅为65％至70％的主要竞争产品SMART DigestTM(可从Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA购得)相比要高得多。与Smart DigestTM相比，使用本公开的技术将肽的非特异性结合效果降低10％至30％。本公开也适用于使试剂还原/烷基化，而Smart DigestTM不兼容。
生物化学研究社区广泛采用蛋白质的酶消化，其中所得的肽可明示相关生理环境中的蛋白质的氨基酸改性或丰度。随着生物制药行业中出现抗体治疗剂，该技术在生物过程和质量控制评估中证明了其价值，以支持识别和监测反映特定治疗剂的纯度和安全性特征的关键质量属性。然而，大蛋白质(例如，具有150kDa分子量的抗体)的消化需要数小时才能完成，并且通常需要优化许多实验参数，包括培养时间、温度和蛋白质与酶的比率。这一漫长的过程限制了吞吐量，因为通常需要在发现阶段中或在制造过程中做出及时决策。该过程的另一个注意事项是，漫长的消化过程可能会诱导对蛋白质或肽的人工改性，从而增加了限定这些改性的额外工作。在胰蛋白酶消化的情况下，随着时间的推移，自溶可能会对下游分析造成不利干扰。
提高工作流的吞吐量的尝试已经促进在使工作流自动化方面取得一些最新进展。液体处理器现在可同时一次性处理96个样本或甚至384个样本，然而，消化本身的时间仍然需要数小时。另一方面，最常见的下游肽分析需要60分钟至120分钟的液相色谱梯度才能实现充分分离，因此一天最多可处理24个样本。由于稳定性或吸附问题，排队等待的样本数量过多可能会导致肽的潜在损失。这将进而影响了平台分析的一致性和准确性。
还研究了在升高的温度下进行消化的尝试。背后的基本原理是酶反应，与任何其他化学反应一样，遵循阿伦尼乌斯公式(公式1)的规则：
Figure BDA0003931791990000051
其中k是反应的动力学速率常数，A是阿伦尼乌斯常数，G是标准活化自由能(kJ M-1)，其取决于熵因子和焓因子，R是气体定律常数，并且T是绝对温度。温度每升高10℃，典型的标准活化自由能(15-70kJ M-1)会导致速率增加介于1.2倍和2.5倍之间。但是由于因热诱导的变性或其它构象变化，酶通常在优选的温度范围内将是最有效的。使用测序级胰蛋白酶作为示例，对酪蛋白进行1小时的消化试验的优选温度为50℃至55℃。然而，在此类温度下，随着时间的推移，胰蛋白酶的自溶急剧增加，这导致2小时内活性损失60％。
热源可以是提供均匀性(均匀热传递)和均匀热分布的热源。在固定化酶的示例中，需要确保分散设备的搅拌或与蛋白质相互作用的流通模式，以实现均质接触或均匀接触。热源可提供的斜坡时间也是选择热源时的一个因素。短斜坡时间是有利的。在分散的固定化酶形式中，用5分钟或更短的时间达到已确定的消化温度，以用于进行10分钟的消化。在固定化胰蛋白酶的一个示例中，优选在5分钟或更短的时间达到75℃并且将温度维持在75℃下。
在一些示例中，热源可以是任何支持在50℃至100℃下持续加热5分钟或更长时间的热源。一些示例包括烘箱、培养箱、摇床或热混合器。在一些示例中，为了实现一致且最佳的结果，可使用Eppendorf ThermoMixerC(基于Peltier技术)，优选地使用加热盖的选项。加热盖可有助于花费长时间(例如，超过30分钟)的消化。
耗材与热源之间的高效热传递也是选择热源时的一个因素。在分散的固定化胰蛋白酶的一个示例中，所使用的耗材的厚度与它们的消化性能相关。优选的温度取决于所选的酶或酶的组合。在固定化胰蛋白酶的示例中，Tm和起始温度(Tonset)可有助于确定最适合加热消化的温度。胰蛋白酶的优选温度在Tonset至Tm之间。
微波辅助酶消化和红外辅助酶消化似乎通过将时间缩短至仅仅5分钟而改善了消化动力学，然而，这些研究对中小型蛋白质(小于100kDa)最有帮助，而消化产物的质量尚未得到严格评估。此外，像微波这样的硬件作为热源确实难以对可再现性进行基准测试和评估。
分散形式或柱/筒形式的固定化酶也可商购获得。固定化的优点是通过抑制热的变性作用来改善热稳定性，使得消化可在较短的时间段内在较高的温度下完成。然而，到目前为止，与溶液中的消化相比，所报告的工作流只能在蛋白质中实现有限的消化效率(检测到的所有胰蛋白酶肽与总肽的百分比)，从30％至80％不等。与固定化酶相关联的大多数方案主张消除预处理(变性、还原和烷基化)，声称通过热实现充分变性。然而，这仅适用于较小或易于热变性的蛋白质，因为较大的蛋白质或具有多个二硫键的蛋白质的不完全消化不会被热有效地变性。此外，热诱导改性的程度和这些新方法的可再现性很少得到严格且广泛的评估。
图18是示出肽图工作流700的流程图。在一些示例中，肽图工作流700包括四个部分。第一部分702包括展开具有感兴趣分析物(诸如蛋白质)的样本。第二部分704包括使样本脱盐，该样本包含展开的感兴趣分析物。第三部分706包括消化样本中的感兴趣分析物。在这里，用于消化感兴趣分析物的设备包括本公开的异官能涂层。在消化了感兴趣分析物之后，第四部分708包括收集具有消化的感兴趣分析物的样本。
在一些示例中，第一部分702和第二部分704可取决于感兴趣分析物。例如，第一部分702和第二部分704可被视为预处理步骤，并且基于感兴趣分析物(诸如蛋白质)，可能不需要该第一部分和第二部分。
一种期望的由热辅助的快速消化方法将在数分钟内有效地完成消化，同时提供高保真肽谱，该快速消化方法将是可靠的，并且适用于在受控环境中进行生物学研究或蛋白质治疗剂表征。在这种情况下，高保真被解释为与常规溶液中的消化工作流相比，提供治疗性蛋白质的＞95％序列覆盖率、＜10％漏切、可比改性％(通常＜5％)的消化工作流的结果。本公开提供用于在热辅助的情况下进行快速酶消化的方法。该方法基本上包括以下组分：在固体载体上的具有优异的热稳定性和亲水性特性(使非特异性结合最小化)的固定化酶；在升高的温度下支持胰蛋白酶活性的动力学，同时还使肽上的热诱导改性最小化的消化缓冲液；确保最大热传递效率，并且尽可能减少非特异性结合的装置(小瓶、板或柱)。
本公开提供用于在热辅助的情况下进行快速酶消化的增强方法。该方法基本上包括以下组分：在固体载体上的具有优异的热稳定性和亲水性特性(使非特异性结合最小化)的固定化酶；在升高的温度下支持胰蛋白酶活性的动力学，同时还使肽上的热诱导改性最小化的消化缓冲液；确保最大热传递效率，并且尽可能减少非特异性结合的装置(小瓶、板或柱)。完全消化工作流开始于在8M胍或6M脲中使蛋白质去饱和。在还原和烷基化之后，对蛋白质进行脱盐并且使其经受消化。消化混合物由有利浓度的消化缓冲液中的固定化酶、蛋白质构成。消化缓冲液的相关因素可以是温度、pH、金属浓度和添加剂。
本公开的缓冲液可包含用于控制pH的缓冲剂、蛋白质样本分散剂和金属离子。金属离子可以是二价金属离子，优选地Ca2+。缓冲剂可包括Tris、BIS-Tris、MES、HEPES、三乙醇胺和三甲胺。蛋白质样本分散剂可选自多元醇，诸如甘油、木糖醇、丙二醇、丁二醇或赤藓糖醇的组。金属离子和蛋白质样本分散剂可以是缓冲液中的添加剂。例如，CaCl2、甲硫氨酸、木糖醇和/或甘油可以是缓冲液中的添加剂。
在消化之后，通过离心或过滤去除固定化酶。回收肽作为上清液并且将其提交到下游分析：LC-UV或LC-MS。
如附录A中更详细所述的涂层上的固定化酶(或在一些示例中亲和配体)提供热稳定性。至于消化，通过共价相互作用方法的化学固定化方法脱颖而出，因为这将会确保最少的酶泄漏，并且更重要的是，热稳定性更好。这些固定化酶中的许多固定化酶以柱的形式提供，其通常需要多维LC系统进行操作。工作温度从37℃至60℃不等，并且缺乏关于它们的寿命和可再现性的信息。Smart DigestTM是一款著名的分散形式的可商购获得的产品，其采用的工作温度为70℃。
图1是根据本公开的各方面的热谱曲线图。具体地，图1显示了游离胰蛋白酶、Smart DigestTM胰蛋白酶和一种优选的固定化酶(例如，胰蛋白酶)原型(例如，根据本发明技术的具有涂层的基于二氧化硅的固体载体)的NanoDSC热谱曲线，其中Tm-展开一半的蛋白质的温度，并且Tonset-开始展开蛋白质的温度。例如，与Smart DigestTM(图1)相比，具有固定化胰蛋白酶的原型(即，具有涂层的基于二氧化硅的固体载体)甚至示出更好的热稳定性。
图2是根据本公开的各方面的热谱曲线图。图2显示了进行不同改性的固定化酶原型的NanoDSC热谱曲线。未经改性的胰蛋白酶具有约65℃的Tm。经点改性的胰蛋白酶(丙烯酸丁酯、s-甲基异硫脲和苯基乙二醛)已经稍微改善了Tm 1℃至2℃，而经交联剂改性的胰蛋白酶(甘油1，3-二甘油醇酸二丙烯酸酯和三甘醇二丙烯酸酯)已经显著改善了Tm5℃至7℃。为了进一步提高胰蛋白酶的热稳定性，与胺非特异性反应的交联剂可抑制在加热的情况下发生的结构变化(图2)。类似地，与不在活性位点处的特定氨基酸共价结合的改性剂也可在热变性期间形成空间位阻(图2)。
载体上的固定化酶赋予增强的表面特性，诸如非特异性结合、缀合化学和消化效率。固体载体可由具有多孔结构的亲水性表面构成，该多孔结构可使非特异性结合最小化，这进而将会确保消化效率和肽的回收率。重要的物理参数包括固体载体的粒度和孔径，这会影响蛋白质扩散到孔中以及它们与酶的接触程度。对于所选择的材料，优化亲水性改性，使得可将非特异性结合调节到优选水平。图4是根据本公开的在用固定化酶培养之后的疏水性肽的混合物的回收率的图。图4展示了疏水性肽与所选择的固定化载体仅混合5分钟之后的回收率％。
在一些示例中，固体载体是多孔的，并且孔径在约
Figure BDA0003931791990000091
至约
Figure BDA0003931791990000092
的范围内。孔径可能影响蛋白质扩散到孔中以及蛋白质与酶的接触程度。
固体载体表面可以是多个粒子，每个粒子具有在约1微米至约200微米范围内的粒度。粒度可能影响蛋白质的扩散以及蛋白质与酶的接触程度。固体载体是用于使酶固定化的材料。在一些示例中，用于含有反应组分的耗材包括多孔板、小瓶或柱。对耗材进行涂布，以降低非特异性结合。
固定化的另一个考虑因素是酶在载体上缀合的稳定性程度。释放的酶通常在升高的温度下的热稳定性显著降低，并且随着固定化在载体上的酶减少，消化效率将会随着时间的推移而降低。更糟糕的是，如果采用UV分析进行下游分析，则就胰蛋白酶而言，它可能会对自溶产物的下游分析产生显著的噪音。图5是在70℃下在消化缓冲液中培养之后的释放的胰蛋白酶的图。优选产物在消化期间的酶泄漏最小(图5)。
在一些示例中，固定化胰蛋白酶在低温(25℃至45℃)下不示出自溶，在大于7的pH下在高于65℃的温度下示出极低的自溶(小于1％)，并且在较低的pH下不示出自溶。
固定化酶可包括一种酶或酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Lys-C、Glu-C、Arg-C、Asp N、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、IdeS、链霉蛋白酶和PNGase)的组合，其可固定化在能够维持25℃至110℃内的特定升高的温度，并且不会对酶活性产生负面影响的粒子、芯片、表面上。在一些示例中，为了在高于45℃，优选地65℃至75℃且不高于85℃范围内的升高的温度下进行加热，可进一步缩小升高的温度范围。酶可通过固定化过程拥有热稳定性。在胰蛋白酶的示例中，在固定化之后，熔融温度(Tm)可提高30℃至50℃。通过点改性以及交联和缀合小聚合物或配体对胰蛋白酶进行改性可进一步提高Tm。在一些示例中，具有固定化酶的固体载体对消化期间存在的所有蛋白质/肽的非特异性结合小于30％，并且固定化酶在消化规程期间可保持稳定，并且浸出小于20％。
在一些示例中，经改性的酶是溶液中的。酶可包括一种酶或酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Lys-C、Glu-C、Arg-C、Asp N、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、IdeS、链霉蛋白酶和PNGase)的组合。
固定化酶的消化效率是表面特性的组合结果。使用NIST mAb作为模型蛋白，通过称量消化之后检测到的总肽中的胰蛋白酶肽(无漏切)的比率，漏切％可反映消化效率。在推荐的工作流下使用Smart DigestTM的报告的序列覆盖率只能达到IgG1的50％至76％。图6A、图6B和图6C是显示NIST mAb在变化的条件下被消化之后生成的LC-MS色谱的图。具体地，图6A、图6B和图6C是显示NIST mAb在(图6A)两小时的溶液中的消化；(图6B)10分钟的Smart DigestTM消化；(图6C)10分钟的原型消化下被消化之后生成的LC-MS色谱的图。图7是显示根据本公开的比较示例的漏切％和序列覆盖率％的图。具体地，图7显示了在亲水性改性水平增加的原型与Smart DigestTM之间比较的漏切％和序列覆盖率％。热稳定性得到改善的期望原型应该能够在优化条件下提供稳健的消化(漏切％＜10％，序列覆盖率＞90％)(图6和图7)。通过调节表面上的亲水性改性，消化效率可找到平衡了消化效率和肽的质量回收率的“最佳点”(图7)。
在消化之前，本公开可包括预处理。在蛋白质消化之前，可存在预处理步骤。在一些示例中，可通过热容易地变性并且在消化期间引入的蛋白质不需要预处理。对于需要预处理的蛋白质，变性之后进行还原和烷基化是完全展开蛋白质的常见步骤。
消化条件对在升高的温度下消化固定化酶起到重要作用。基于固定化载体的选择，与溶液中的游离酶发挥最佳作用的消化参数(如pH、温度和消化时间)将在加热环境中表现出独特的特征。添加剂可有助于应对改善的动力学、对肽的热诱导改性、肽吸附到固定化载体上以及浆液或蛋白质的聚集。利用热辅助变性，可在没有预处理(包括用胍或脲进行变性、还原和烷基化)的情况下实现完全消化，而无需确定漏切的程度。在本公开中，作为漏切％的结果，完全消化不大于10％，这意味着蛋白质已经完全消化，超过90％的所得的肽没有漏切位点。这是严格的标准，并且也是区分本公开和本公开的利用与其它公开的质量。
在本公开中，根据感兴趣分析物(例如，根据蛋白质)，预处理是任选的。进行脱盐以去除预处理是任选的，因为树脂是相容的。可在消化之前对样本进行预处理(包括变性、还原和烷基化)，以实现高保真肽谱。虽然包括预处理的整个过程不超过2小时，但是包括消化在内。
在固定化之后，酶表现出改善的热稳定性，并且需要针对所选择的酶确定优选的温度，因为为了实现最大活性，在Tm与温度之间，它们可能表现出独特的相关性或没有相关性。根据经验，就胰蛋白酶而言，优选的是在接近其Tm的70℃至75℃下进行消化达10分钟。图8A、图8B和图8C是在不同温度下比较消化示例的图。具体地，图8A、图8B和图8C显示了比较Smart DigestTM和固定化胰蛋白酶在(图8A)60℃；(图8B)70℃；(图8C)80℃下对NIST mAb消化10分钟之后的LC-MS色谱图。
低于该温度将会出现显著的不完全消化(图8A至8C)。在不希望受到理论限制的情况下，消化效率将在高于70℃的温度下达到较高的值，并且预期缩短消化时间会实现类似的消化完全性。但是，这也可能需要稍微更长的反应混合物平衡时间，这可能导致热诱导降解或吸附，或其它不利的改性。
在一些示例中，缓冲液组成包含钙离子(Ca2+)。可通过溶液中的1mM至10mM Ca2+来改善游离形式的胰蛋白酶的活性。由于离子强度对胰蛋白酶的影响，虽然不受理论约束，但是，均可能存在“最佳点”浓度，而无论无机盐如何。一旦固定化，就可在高得多的温度下进行酶促反应。例如，利用胰蛋白酶，酶促反应可在70℃下进行。在一些动力学得到显著改善的示例中，可能需要重新评估催化剂Ca2+的浓度。图9A和图9B是显示Ca2+浓度(1mM至50mM)对消化效率和非特异性结合的影响的图。在一个示例中，当Ca2+的浓度从1mM增加到50mM时，消化效率已经显著提高(图9A)。然而，Ca2+在50mM下也在疏水性肽(m/z 934)上示出最严重的损失(图9B)。对于大多数蛋白质，尤其是肽谱非常复杂的抗体治疗剂，10mM至20mM的Ca2+可实现酶活性和非特异性结合的平衡。
大多数酶表现出pH偏好。例如，溶液中的胰蛋白酶在pH 8.0下具有最大化的活性。用于形成此类环境的缓冲液大多是两性离子化合物，其pKa值会发生变化，这影响了缓冲能力。在升高的温度下，pKa值通常降低，这可能会诱导消化缓冲液的pH发生转变。例如，从25℃到75℃，50mM的Tris溶液的pH下降了0.6(表2，如下所示)。
图10A和图10B是比较pH对消化效率和脱酰胺％的影响的图。在图10A的示例中，固定化胰蛋白酶的pH从25℃下的7.6转变为75℃下的7.0(图10A)。存在优选较低pH的情况。例如，已知加热的消化会加速脱酰胺，但可通过将pH调整到稍低的值(图10B)或仅缩短消化时间来避免。
在一些示例中，酶的优选pH可以是相同的，而不管消化发生的温度如何。但是在跨很宽的温度范围内，缓冲液具有不同的保持相同pH的能力。在固定化胰蛋白酶的示例中，缓冲液的pH在室温下为7.6。在75℃下，缓冲液pH下降到7.0。但是，在加热的作用下，消化可以更快的速度发生，因此，即使胰蛋白酶不处于优选的状态，消化仍然在10分钟内实现高质量的消化结果。
离子强度是另一种缓冲液组成条件。每种特定浓度的缓冲盐均提供使酶促反应发生的离子强度。Tris缓冲液通常用于消化，但需要针对为消化所选择的酶调制Tris的浓度。图11A和图11B是比较Tris浓度对消化效率和非特异性结合的影响的图。在固定化胰蛋白酶的示例中，100mM的Tris为平衡的消化效率和增强的肽回收率提供最佳结果(图11)。
一旦选择了固定化酶进行消化，就需要热混合器，以避免树脂出现物理沉降，从而确保在过程期间实现均匀且有效的热分布。然而，粒子和蛋白质之间可能会发生加速聚集，例如，变性蛋白质可能比在溶液中聚集得更快，疏水部分更容易地暴露在热量下。极性添加剂在防止粒子或蛋白质之间的不利相互作用和培育类似水的环境方面可能起到重要作用。事实上，由于其亲水性特性，小的多元醇(包括但不限于甘油、木糖醇、赤藓糖醇、丙二醇和丁二醇)可在高温和高盐浓度下使聚集稳定，并且提供高肽回收率％。图12A和图12B是比较多元醇对消化效率和非特异性结合的影响的图。图12C是显示使用甘油和木糖醇的消化结果的比较的图。在一些示例中，亲水性越高，消化效率越高(图12)。
在本公开中，酶活性对照物包括辅因子/稳定剂、离子强度。在固定化胰蛋白酶的示例中，可调制钙浓度以确保酶的活性。在固定化胰蛋白酶的示例中，也可根据活性调制Tris浓度。
在本公开中，非特异性结合对照物适用于固定化酶。在固定化胰蛋白酶的示例中，5％甘油和其它物质具有减轻疏水性肽吸附到树脂的表面上的效果。在固定化胰蛋白酶的示例中，可调制钙和Tris浓度以实现最小的非特异性结合。
由于与升高的温度相关联的过程诱导型改性始终是一个问题，因此存在可避免这种问题影响的添加剂。图13是显示甲硫氨酸对防止人工氧化的影响的图。例如，添加足够量的氧化清除剂(诸如甲硫氨酸)可充分降低人工氧化(图13)。就脱酰胺而言，添加有机溶剂(例如10％的乙腈)可调节介电强度并且减轻方法诱导型脱酰胺(图14)。
试剂盒可包括消化缓冲液，以支持升高的温度下的酶活性并且最大限度地减少蛋白质发生热诱导型改性。在一些示例中，含有甲硫氨酸的肽以小于1％的相对转化率转化为氧化变体。在一些示例中，在试剂盒规程的过程期间，天冬酰胺残基以小于5％(优选地小于2％)的相对转化率被脱酰胺成异天冬氨酸或天冬氨酸。在一些示例中，在pH 7.5下加热消化的10分钟内，甲硫氨酸的人工氧化不超过1％，并且脱酰胺不超过5％。
可将氧化清除剂(如甲硫氨酸)添加到消化缓冲液中。在固定化胰蛋白酶的一个示例中，与溶液中的消化相比，50mM的甲硫氨酸能够消除热诱导型改性。
脱酰胺是pH驱动的过程。降低pH或调节缓冲液的组成可防止热诱导型脱酰胺。在固定化胰蛋白酶的示例中，10％的乙腈可显著减少人工脱酰胺。
为了实现完全消化，需要对消化蛋白质的每种酶进行时间依赖性研究。在固定化胰蛋白酶的示例中，可在1分钟至10分钟内完成消化。
根据本公开，热辅助消化可在数分钟内完成，并且因此它在分散柱和在线柱形式中均相容。对于反应体积为200μL的小瓶中的反应，上升时间可能有问题，因为混合物需要数分钟才能达到设定温度。根据所使用的管和热混合器，上升时间可能有所不同。为了实现这种过程的高度可再现性，稳健的热传递效率是重要的。主要由聚丙烯制成的可商购获得的PCR管示出不同的壁厚。图15是显示示例之间的消化效率比较的图。具体地，图15是显示Smart DigestTM与5个不同供应商的在PCR管中的固定化原型(即，具有本发明技术的涂层的基于二氧化硅的固体载体)之间的消化效率比较的图。图16显示了200μL PCR管中的典型反应装置。横截面A、横截面B和横截面C对应于图17的横截面尺寸。图17显示了来自图15中使用的管的PCR管的尺寸。管的底部处的厚度(尺寸C)对消化的影响似乎最小。例如，AXYGEN具有最厚的A尺寸和B尺寸，这可能导致热传递不良，从而导致最差的消化性能，如图15所示。
壁厚度的变化可能显著影响消化性能(图15)。此外，需要考虑管的材料。例如，使用QuanRecovery小瓶和QuanRecovery板(可从WaterTechnologies Corporation，Milford，MA购得)，聚丙烯可能会导致非特异性结合问题。通过引入等离子体处理，可解决非特异性结合问题。在有牛血清白蛋白、表面活性剂、有机溶剂和洗涤剂的情况下，阻断试剂虽然有时有用，但是可能会对下游分析引起严重的噪音或肽损失。如果需要一次处理更多样本，可容易地将200μL PCR管转换为PCR板，或甚至转换为384孔板。
本公开还包括消化之后的步骤。对于经改性的酶，需要进行淬灭，以使反应终止。通过冷冻或通过添加甲酸、乙酸或三氟乙酸将反应的pH降低到pH 4以下，可使胰蛋白酶消化停止。
如果固定化酶呈分散形式，则需要通过离心、过滤或磁珠去除来去除固体载体。可选择所使用的过滤膜或过滤设备以使肽或其他感兴趣分析物的非特异性结合最小。
具有液体处理功能的采用板形式进行消化的自动化系统可包括变性、还原、烷基化、脱盐设备以及在加热器上完成的消化。如果使用固定化酶，酶可通过正压歧管或真空辅助过滤去除。如果使用经改性的溶液中的酶，则可淬灭反应，以进行下游分析。
自动化系统可包括流穿消化模式，即在有预处理或没有预处理的情况下，蛋白质在经过柱、芯片或任何表面时被消化。
可以不同的方式(包括离心和过滤)从反应混合物中去除树脂。过滤过程可能引入样本损失，因为已知由醋酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜吸收肽。应考虑惰性材料或经改性的膜，以实现最大回收率。
在一些示例中，添加低浓度(约5mM至100mM)的精氨酸、二甲基-精氨酸、胍或向消化缓冲液呈现离液特性的其它衍生物可显著降低样本的损失。这些相对较低浓度的离液试剂可减少过滤期间的非特异性结合，同时不会显著影响酶反应。另选地，这些试剂可在过滤步骤期间添加以对过滤器进行预处理或与消化物同时进行过滤以最大限度地减少非特异性结合。这些措施可确保良好的疏水性肽回收率。例如，图3A和图3B示出了引入低浓度(20mM和50mM)的精氨酸添加物对疏水性肽回收率(图3A)和消化效率(图3B)的影响。图3C提供了引入5mM和20mM的二甲基精氨酸对疏水性肽回收率的影响。并且图3D提供了引入5mM和20mM的二甲基精氨酸对消化效率的影响。
在一些示例中，该技术提供一种处理包含蛋白质的样本的方法。该方法可包括以下步骤：将样本添加到装置中，该装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中表面涂层使酶和亲和配体固定化，同时减少样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用；使酶固定化在表面涂层上以用于消化样本中的蛋白质；使亲和配体固定化在表面涂层上以用于靶向捕获样本的一部分；用表面涂层上的固定化酶消化样本中的蛋白质；用表面涂层上的固定化亲和配体靶向捕获样本的该部分；以及加热样本以激活蛋白质的消化。
靶向捕获样本的该部分的步骤可发生在消化样本中的蛋白质的步骤之前、期间或之后。在一些实施方案中，靶向捕获样本的一部分的步骤发生在消化蛋白质(例如，所指示的3个消化时间段中的2个或所有3个)的步骤之前、期间和/或之后。该方法还可包括调节反应条件以确定靶向捕获样本的该部分的步骤是否发生在消化样本中的蛋白质的步骤之前、期间或之后。
反应条件可包括缓冲液组成、反应温度或反应pH。固体载体表面可以是粒子。在一些示例中，酶和亲和配体固定化在相同的粒子上。加热样本以激活样本中的蛋白质的纯化或消化可包括在升高的温度下用固定化酶消化样本中的蛋白质。当处理样本时，可能存在多于一种缓冲液。例如，可存在靶向捕获洗脱缓冲液和消化缓冲液。
上述方法可利用任何类型的亲和配体。可利用的亲和配体的示例包括但不限于：免疫球蛋白结合蛋白质，例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的混合物。亲和配体还可以是抗原结合物，诸如抗体、纳米抗体或它们的混合物。亲和配体也可以是适体。
亲和配体可固定化在固体载体上，其中涂层覆盖固体载体表面。涂层可提供至少5μmol/m2的表面覆盖率，并且减少蛋白质样本与固体载体表面之间的不期望的相互作用，并且具有共价结合亲和配体的功能。亲和配体固定化在其上的固体载体可以是无孔的或多孔的或磁性的，呈膜、粒子、整料、设备的表面、微芯片的表面的形式。将固定化亲和配体灌装到设备中。设备是板孔、移液管的尖端、微芯片上的沟道或具有一端或两端玻璃料的管。
本领域的技术人员将理解，在不脱离本公开的技术的范围的情况下，可在形式和细节上进行各种更改。例如，另选修改包括：
·反应混合物的形式因素(50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL)
·灌装到柱、尖端和过滤板中的固定化树脂
·胰蛋白酶以外的酶(胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、lysC、IdeS、Glu-C、Arg-C、Asp N、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和PNGase F以及组合)
·用不同的亲水性交联剂、改性剂改性的酶；
·对于一些蛋白质，不需要执行消化工作流的每个步骤。不具有二硫键的蛋白质不需要进行还原和烷基化，并且通常对其本身进行加热可有利于变性。
另选用途(例如，对于生物医药应用)包括：
·生物分析样本制备
·释放的聚糖样本制备
·亚基分析样本制备
·蛋白质组学样本制备
结果
实施例1.通过NanoDSC获得的固定化酶的热稳定性
NanoDSC常规用于研究蛋白质或聚合物的热力学。在NanoDSC实验中，以特定的加热速率(℃/分钟)扫描缓冲溶液中的蛋白质样本，在此期间肽键和相互作用被破坏。继续进行展开过程，直到蛋白质完全变性。展开过程的中点时的温度决定了一半分子何时展开，这表明蛋白质的热稳定性。在本示例中，我们使用胰蛋白酶来研究固定化作用的有益效果。对于所有样本，将NanoDSC运行设置为1℃/分钟的扫描，从10℃到100℃。每个样本含有约1mg/mL的胰蛋白酶，并且使用约330μL进行两次扫描，其中第二次扫描用作参考扫描，以说明不是由胰蛋白酶变性引起的变化。如图1所示，当胰蛋白酶固定化在固体载体上时，Tm从约45℃转变为80℃。基于二氧化硅的原型在Tm上也有显著改善，其中与商业产品Smart DigestTM相比，至少提高了5℃。
实施例2.通过NanoDSC获得的改性的固定化胰蛋白酶的热稳定性
优选地，选择了具有优选长度的两种亲水性交联剂。如图2所示，与未经改性的胰蛋白酶相比，交联的胰蛋白酶的Tm提高了5℃。靶向特定氨基酸的点改性也表现出对Tm的一些改善，尽管没有那么显著，如图2所示。
实施例3.对固定化载体的表面化学物质进行非特异性结合测试
将10μg的NIST mAb标准消化物(Waters)与10μL的树脂混合，并且用含有50mM的Tris、250mM的CaCl2和5％的甘油的消化缓冲液稀释至200μL。将混合物在75℃下在Eppendorf
Figure BDA0003931791990000171
C摇动器(可从Eppendorf，Hamburg，Germany购得)上以1400rpm培养5分钟，并且然后将3，000g离心1分钟，然后提交100μL的上清液进行LC-MS分析。
通过混合具有类似孔径(
Figure BDA0003931791990000172
至
Figure BDA0003931791990000173
)的NIST mAb消化物，对两种不同的表面化学物质的非特异性结合效果进行评估。在培养5分钟之后，收集肽以进行分析。这里示出在所选择的疏水性肽中，经改性的PS-DVB的回收率最低。类似地，在使相同量的胰蛋白酶固定化的不同亲水性涂层中测试非特异性结合效果。如图4所示，对于所有测试的肽，SmartDigestTM均示出较差的回收率。然而，这一基本测试仅反映了肽从蛋白质中消化之后的非特异性结合效果。
表1：在BioAccord上进行的LC-MS分析的参数
Figure BDA0003931791990000174
Figure BDA0003931791990000181
实施例4.释放的胰蛋白酶的定量
用含有50mM的Tris、250mM的CaCl2和5％的甘油的消化缓冲液将10μL的树脂稀释至200μL。将混合物在75℃下在摇动器(Eppendorf thermo mixer C)上以1400rpm培养30分钟和60分钟，并且然后将3，000g离心1分钟，然后提交100μL的上清液进行荧光分析(激发：280nm，发射：370nm)。使用溶解在浓度在0.004mg/mL至0.4mg/mL范围内的消化缓冲液中的游离胰蛋白酶生成校准曲线。
在70℃下培养30分钟和60分钟之后，对释放的胰蛋白酶进行定量。如图5所示，在培养30分钟之后，观察到，Smart DigestTM上的固定化胰蛋白酶损失为约20％，而其它原型(即，具有本发明技术的涂层的基于二氧化硅的固体载体)则示出为小于10％。
实施例5.用固定化酶进行NIST mAb消化
大约50μg的NIST mAb在具有5mM的DTT的8M胍缓冲液中变性和还原1小时，然后在黑暗中用15mM的IAM进行烷基化30分钟。然后，使用NAP-5柱(GE Healthcare)对烷基化的蛋白质进行脱盐并且将其与15μL的固定化酶混合。在70℃下在摇动器上进行消化10分钟，然后提交100μL的上清液进行LC-MS分析。
如图6所示，NIST mAb用作将要被固定化胰蛋白酶消化的模型蛋白质。通过标准LC-MS分析生成的肽图表现出与溶液中的消化相似的总体特征，然而，Smart DigestTM出现更严重的不完全消化，其中漏切超过20％，而更佳的原型则仅示出为约8％(图7和图8)。不完全消化可能是诱导非特异性结合和相互作用的固定化载体的不利表面化学物质造成的，并且也可能与如实施例3和实施例4中所论述的胰蛋白酶的去缀合有关。所测试的原型利用了“厚度”可调节的亲水性涂层，以使消化效率最大化。如图7所示，利用标记为经改性的原型3的改性剂的优选涂层，实现了最佳消化效率。
实施例6.温度对消化效率的影响
根据实施例5，在60℃、70℃、80℃下消化样本，如图8A、图8B和图8C所示。
实施例7.Ca2+对消化效率和非特异性结合的影响
根据实施例5，评估了1mM至50mM的Ca2+对消化的影响，如图9A和图9B所示。
实施例8.p H对消化效率和脱酰胺的影响。
根据实施例5，在pH 7.6和pH 6.6下消化样本，如下表2所示。
表2.在不同温度下测量的缓冲液的pH
温度 50mM的Tris溶液的pH 用于固定化胰蛋白酶的pH
25℃ 7.6 6.6
70℃ 7.0 5.8
实施例9.添加剂对消化效率的影响
将5％的多元醇添加到消化缓冲液中，并且根据实施例5，对样本进行消化。评估50mM的甲硫氨酸对防止人工氧化的影响。将5％、10％的乙腈添加到消化缓冲液中，以评估其对减少人工脱酰胺的影响，如图14所示。
实施例10.PCR管筛选
根据实施例5，样本在5个不同的来自Biologix、Axygen、Andwin Scientific、RPIScientific和Applied Biosciences的PCR管中消化(参见图15和图17)。
实施例11.Tris浓度优化
使用50mM、100mM和200mM的Tris作为消化缓冲液，并且根据实施例5，在70℃下消化蛋白质样本，如图10A和图10B所示。
实施例12.精氨酸和二甲基-精氨酸对疏水性肽回收率的影响
将5mM、20mM的二甲基-精氨酸和20mM、50mM的精氨酸添加到消化缓冲液中，并且根据实施例5，在70℃下消化蛋白质样本，如图3A和图3B所示。通过具有正压歧管的PVDF膜过滤器对所有蛋白质消化物进行过滤。
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。例如，可以使用其它色谱系统或检测系统。

Claims (43)

1.一种消化包含蛋白质的样本的方法，所述方法包括：
将所述样本添加到装置中，所述装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中所述表面涂层使酶固定化，同时减少所述样本与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用；
使酶固定化在所述表面涂层上以用于消化所述样本的所述蛋白质；以及
加热所述样本以完成所述蛋白质的热辅助消化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液为溶液中的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述缓冲液选自由以下项组成的组：Tris、BIS-Tris、MES、HEPES、三乙醇胺和三乙胺。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述装置内的溶液的pH介于5.0和9.0之间。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶液中的缓冲液进一步包含一种或多种添加剂，所述一种或多种添加剂选自由以下项组成的组：木糖醇、甲硫氨酸和CaCl2。
6.根据权利要求1所述的方法，其中完全消化包括将所述蛋白质消化到小于15％的漏切。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质样本被加热并且用固定化酶进行消化，并且完全消化在10分钟内发生。
8.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述样本以利用固定化酶完成所述蛋白质的消化在5分钟内发生。
9.根据权利要求1所述的方法，其中加热发生在高于45℃，优选地65℃至75℃且不高于85℃范围内的升高的温度下。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用设备施加加热，所述设备选自由以下项组成的组：烘箱、培养箱、摇床、热混合器。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面涂层包括两个部分：第一涂层部分和第二涂层部分，所述第一涂层部分具有用于生物缀合的官能团，所述第二涂层部分具有减少所述蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用的官能团。
12.根据权利要求11所述的方法，其中固定化之后的所述表面涂层包括亲水性涂层，所述亲水性涂层具有附接到其表面的固定化酶。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面涂层在所述固体载体的表面上提供至少5μmol/m2的表面覆盖率。
14.根据权利要求1所述的方法，其中固定化酶选自由以下项组成的组：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Lys-C、胃蛋白酶、Glu-C、Arg-C、Asp N、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、IdeS、IdeZ、PNGase F或任何组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶用亲水性交联基团改性以增加化学稳定性和热稳定性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶用疏水性改性剂改性以增加对所述蛋白质样本的亲和力。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体载体包括基于聚合物的材料、基于二氧化硅的材料、杂化材料、琼脂糖或纤维素。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶固定化在其上的所述固体载体是无孔的或多孔的或磁性的，呈膜、粒子、整料、设备的表面、微芯片的表面的形式。
19.根据权利要求1所述的方法，其中消化所述样本的所述蛋白质的整个过程包括在加热所述样本以完成消化之前对所述样本进行的一个或多个预处理步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个预处理步骤包括使所述样本的所述蛋白质变性、还原所述蛋白质样本、使所述蛋白质样本烷基化或使所述样本的所述蛋白质脱盐或任何组合。
21.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述样本以完成消化提供将所述蛋白质消化为具有小于约15％的漏切和大于约85％的序列覆盖率。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将消化的蛋白质提交到下游分析，所述下游分析包括液相色谱-紫外(LC-UV)或液相色谱-质谱(LC-MS)中的至少一者。
23.一种处理包含蛋白质的样本的方法，所述方法包括：
将所述样本添加到装置中，所述装置容纳缓冲液和包括表面涂层的固体载体表面，其中所述表面涂层使酶和亲和配体固定化，同时减少所述样本与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用；
使酶固定化在所述表面涂层上以用于消化所述样本中的所述蛋白质；
使亲和配体固定化在所述表面涂层上以用于靶向捕获所述样本的一部分；
用所述表面涂层上的固定化酶消化所述样本中的所述蛋白质；
用所述表面涂层上的固定化亲和配体靶向捕获所述样本的所述部分，以及
加热所述样本以激活所述蛋白质的消化。
24.根据权利要求23所述的方法，其中靶向捕获所述样本的所述部分的步骤发生在消化所述样本中的所述蛋白质的步骤之前、期间或之后。
25.根据权利要求23所述的方法，所述方法进一步包括调节反应条件，使得所述靶向捕获的步骤发生在所述消化的步骤之前、期间或之后。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述反应条件包括缓冲液组成、反应温度或反应pH。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述固体载体表面是粒子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述酶和所述亲和配体固定化在相同的粒子上。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述装置内的溶液的pH介于5.0和9.0之间。
30.根据权利要求23所述的方法，其中加热发生在高于45℃，优选地65℃至75℃且不高于85℃范围内的升高的温度下。
31.根据权利要求30所述的方法，其中使用设备施加加热，所述设备选自由以下项组成的组：烘箱、培养箱、摇床、热混合器。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述表面涂层包括两个部分：第一涂层部分和第二涂层部分，所述第一涂层部分具有用于生物缀合的官能团，所述第二涂层部分具有减少所述蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用的官能团。
33.根据权利要求32所述的方法，其中固定化之后的所述表面涂层包括亲水性涂层，所述亲水性涂层具有附接到其表面的固定化亲和配体。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述表面涂层在所述固体载体的表面上提供至少5μmol/m2的表面覆盖率。
35.一种用于蛋白质样本制备的试剂盒，所述试剂盒包括：
固体载体表面，所述固体载体表面具有覆盖所述固体载体表面的聚合物涂层，其中所述聚合物涂层提供至少5μmol/m2的表面覆盖率并且减少蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用；
缓冲液；
容器，所述容器用于容纳具有聚合物涂层的固体载体表面和所述缓冲液；以及
热源，所述热源用于辅助所述蛋白质样本制备。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述聚合物涂层包括两个部分：第一涂层部分和第二涂层部分，所述第一涂层部分具有用于生物缀合的官能团，所述第二涂层部分具有减少所述蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用的官能团。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述第一涂层部分包含固定化生物分子。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述固定化生物分子包括酶、亲和配体或它们的组合。
39.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述第二涂层部分是亲水的，以减少所述蛋白质与所述固体载体表面之间的不期望的相互作用。
40.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述热源是选自由以下项组成的组的设备：烘箱、培养箱、摇床和热混合器。
41.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述热源包括微波热源、对流热源或红外热源。
42.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述固体载体是无孔的、多孔的或表面多孔的，呈粒子、整料、膜或者设备、微芯片或载玻片的表面的形式。
43.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述固体载体表面包含多个粒子，每个粒子具有在约10nm至约200微米范围内的粒度。
CN202180033902.3A 2020-05-08 2021-05-07 用于热辅助酶消化的方法 Pending CN115552215A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063022056P 2020-05-08 2020-05-08
US63/022056 2020-05-08
PCT/IB2021/053910 WO2021224883A1 (en) 2020-05-08 2021-05-07 Methods for heat-assisted enzyme digestion

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115552215A true CN115552215A (zh) 2022-12-30

Family

ID=75919348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180033902.3A Pending CN115552215A (zh) 2020-05-08 2021-05-07 用于热辅助酶消化的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20210347814A1 (zh)
EP (1) EP4147026A1 (zh)
CN (1) CN115552215A (zh)
WO (1) WO2021224883A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115931514A (zh) * 2023-03-09 2023-04-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种微量蛋白样品的前处理方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2841952A4 (en) * 2012-04-22 2015-12-02 Perfinity Biosciences Inc AUTOMATED PROTEIN DEDUCTION, RECOVERY AND ANALYSIS
WO2014120890A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Perfinity Biosciences, Inc. Robust, easy to use immobilized enzyme reactors
WO2015084748A1 (en) * 2013-12-03 2015-06-11 Perfinity Biosciences, Inc A single reactor for simplified sample preparation workflows
US20210396632A1 (en) * 2020-05-08 2021-12-23 Waters Technologies Corporation Methods for heat-assisted enzyme digestion

Also Published As

Publication number Publication date
EP4147026A1 (en) 2023-03-15
WO2021224883A1 (en) 2021-11-11
US20210347814A1 (en) 2021-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210239692A1 (en) Aptamer-Based Multiplexed Assays
Tang et al. Current developments in SELDI affinity technology
JP4324101B2 (ja) 標的物質の結合
JP6156971B2 (ja) 核酸精製方法
CA2518569A1 (en) Liquid tissue preparation from histopathologically processed biological samples, tissues and cells
Stevenson et al. Selective extraction of proteins and other macromolecules from biological samples using molecular imprinted polymers
JP2006519996A5 (zh)
KR102567902B1 (ko) 변형된 클리바아제, 이의 용도 및 관련 키트
EP1601786B1 (en) Tagged polyfunctional reagents capable of reversibly binding target substances in a pH-dependent manner
CN115552215A (zh) 用于热辅助酶消化的方法
EP2951300B1 (en) Robust, easy to use immobilized enzyme reactors
JP2015092183A (ja) 画期的新薬開発のためのターゲットタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する新薬候補物質のスクリーニング方法
CN115947862B (zh) Sh2超亲体蛋白及其与固相缀合所形成的缀合物
CN114126476A (zh) 用于蛋白质的空间分析的方法及相关试剂盒
US20210396632A1 (en) Methods for heat-assisted enzyme digestion
US20210379591A1 (en) Fragmentation of target molecules for sequencing
US20060105407A1 (en) Protein chip for analyzing interaction between protein and substrate peptide thereof
EP3223949A1 (en) Pipette tip and method of use thereof
Sakhnini et al. Designing monoclonal antibody fragment-based affinity resins with high binding capacity by thiol-directed immobilisation and optimisation of pore/ligand size ratio
KR100877187B1 (ko) 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자를포함하는 진단용 단백질 칩과 그의 초고감도 검출 방법
JP6088434B2 (ja) クロマチン免疫沈降アッセイを行うための方法
US20190071662A1 (en) Methods for the Isolation of Biomolecules and Uses Thereof
US20230028205A1 (en) Enrichment method
AU2021261356A1 (en) Devices and methods for sequencing
Yamaguchi et al. Proteolysis approach without chemical modification for a simple and rapid analysis of disulfide bonds using thermostable protease‐immobilized microreactors

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination