CN115537404A

CN115537404A - 一株具有潜在抗肿瘤作用的i型单纯疱疹病毒株及应用

Info

Publication number: CN115537404A
Application number: CN202111578178.0A
Authority: CN
Inventors: 袁蒙蒙; 张永辉; 刘广芝; 郭真真; 李辉; 李亚龙; 程朝飞; 张玉薇
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN115537404B

Abstract

本发明提供一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株，为单纯疱疹病毒1型HSV‑1 YMM株。通过透射电子显微镜观察和基因测序分析，分离病毒为100‑125nm左右的球形包膜病毒，基因序列与HSV‑1完全匹配，确定分离出一株HSV‑1病毒。其中，HSV‑1 YMM病毒株诱导卵巢癌细胞SKOV3和ES2高表达IFN‑a、IFN‑β、CXCL9和CXCL10，且IFN‑α、CXCL9和CXCL10表达高于HSV‑1 F病毒，推测HSV‑1 YMM相对于HSV‑1 F有更强的诱导抗肿瘤免疫和免疫细胞招募的能力，具有抗肿瘤开发潜力新的HSV‑1病毒株，为下一步开发新型溶瘤病毒药物的研发奠定了基础。

Description

一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株及应用

技术领域

本发明涉及一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株及应用，属于病毒微生物技术领域。

背景技术

单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，单纯疱疹病毒属，是一种包膜线性双链DNA病毒，病毒基因组全长152kb。HSV-1是一种在世界各地普遍流行的病毒原体，有证据表明，全球约67％的人一生中都被HSV-1感染过。绝大数人被HSV-1感染后症状较轻，主要表现为口腔疱疹，部分是生殖器疱疹。

溶瘤病毒是一类能够在肿瘤中选择性复制，在正常细胞中不复制或者低复制的病毒的总称。2015年，首个工程化表达人粒细胞-巨细胞刺激因子的I型单纯疱疹病毒T-Vec被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。HSV-1作为溶瘤病毒备受关注，也成为抗肿瘤药物的开发热点。2021年第二个HSV-1改造的溶瘤病毒Teserpaturev用于治疗恶性胶质瘤在日本获批上市。因此分离一株完全自主知识产权的适合用于溶瘤病毒改造的HSV-1病毒株成为溶瘤病毒药物开发的前提条件。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株，所述I型单纯疱疹病毒株为单纯疱疹病毒1型HSV-1 YMM株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202189，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年11月30日。

所述单纯疱疹病毒1型HSV-1 YMM株US4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述单纯疱疹病毒1型HSV-1 YMM株US4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

所述的I型单纯疱疹病毒株在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的I型单纯疱疹病毒株在制备疫苗中的应用。

本发明有益效果：

本发明从患者口唇疱液样本中分离得到一株病毒，经基因测序、透射电镜形态分析，鉴定分离病毒为I型单纯疱疹病毒，命名为HSV-1 YMM。通过透射电子显微镜观察和基因测序分析，分离病毒为100-125nm左右的球形包膜病毒，基因序列与HSV-1完全匹配，确定分离出一株HSV-1病毒。

本发明分离的HSV-1病毒株，与HSV-1 F的对比研究表明，HSV-1 YMM与HSV-1 F相比，具有相同的细胞毒性、复制能力及更强的诱导免疫的能力。其中，HSV-1 YMM诱导SKOV3和ES2上调IFN-a、IFN-β、CXCL9和CXCL10的表达；HSV-1 YMM诱导SKOV3和ES2上调IFN-a、CXCL9和CXCL10倍数显著高于HSV-1 F。

本发明的HSV-1 YMM病毒株诱导卵巢癌细胞SKOV3和ES2高表达IFN-a、IFN-β、CXCL9和CXCL10，且IFN-α、CXCL9和CXCL10表达高于HSV-1 F病毒，推测HSV-1 YMM相对于HSV-1 F有更强的诱导抗肿瘤免疫和免疫细胞招募的能力。

本发明的HSV-1 YMM是一株具有抗肿瘤开发潜力新的HSV-1病毒株，为下一步开发新型溶瘤病毒药物的研发奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1分离病毒颗粒的电镜照片。

其中，左图为放大50000倍，右图为放大150000倍。

图2为本发明实施例2HSV-1 YMM溶瘤及复制能力检测结果图。

其中，A、结晶紫染色法分析病毒感染48小时后的活细胞比例，图片为结晶紫染色后照片，NC为无处理组，MOI 1为MOI 1的病毒处理组，MOI 0.1为MOI 0.1的病毒处理组；B、CCK-8方法分析病毒感染49小时后细胞活力，ns:P＞0.05，表示无显著差异；C、病毒复制曲线。

图3为本发明实施例3HSV-1 YMM诱导I型干扰素和趋化因子的表达结果图。

其中，#:p＞0.05，*:p＜0.05，***:p＜0.001，#表示:统计学无显著差异，*和***表示:有统计学显著差异。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；涉及试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；涉及试验方法如无特别说明均为常规方法。

本发明实施例中所用的主要细胞与试剂：

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)购自美国模式培养物集存库(ATCC)；SKOV3(人卵巢癌细胞)、ES2(人卵巢透明细胞癌细胞)和ID8(小鼠卵巢癌细胞)由本实验室保存。Vero细胞和ID8细胞培养使用含10％(v/v)胎牛血清(Fetal bovine serum FBS)和1％(v/v)青霉素-链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin Solution PS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)的完全培养基，其它细胞培养使用含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)PS青霉素-链霉素的RPMI1640完全培养基。

HSV-1 F病毒株购自ATCC，DMEM(货号：11995065)、PRMI1640(货号：22400089)、青霉素-链霉素(货号：15140122)和PowerUp SYBR Green预混液(货号A25742)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。胎牛血清(货号：SH30071.03HI Hyclone)购自格来赛生命科技(上海)有限公司。CCK-8试剂盒(货号CK04同仁化学)购自东仁化学科技(上海)有限公司。1％(w/v)草酸铵结晶紫染色液(货号：G1062)购自北京索莱宝科技有限公司。血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304-02)购自天根生化(北京)科技有限公司。快速高保真DNA聚合酶(货号：Z03-050)购自上海微悉生物技术有限公司。

实施例1病毒分离及鉴定

1、病毒分离培养

Vero细胞常规消化后，接种40万细胞至6孔板中，使用浓度5％(v/v)二氧化碳、37℃的细胞培养箱过夜培养，使细胞密度达到60-70％，弃去细胞上清，使用PBS缓冲液洗两遍，加入2mL DMEM。在征得患者YMM完全知情同意后，无菌采集患者口唇周围疱液样本，加入Vero细胞，37℃吸附3小时后，更换含2％FBS和1％PS的DMEM继续培养，每日观察细胞病变情况，待细胞病变达80％左右，收集细胞，反复冻融两次，4000×g离心20分钟去除细胞碎片，收集上清分装后保存于-80℃作为种子病毒，命名为HSV-1 YMM。

2、病毒滴度测定

选用TCID₅₀方法测定病毒滴度。病毒大量扩增使用HSV-1 YMM感染Vero细胞，至细胞病变80％左右，收集细胞，使用适量DMEM重悬后，反复冻融2次，4000×g离心20分钟去除细胞碎片，收集上清，分装后置于-80℃保存。

取-80℃中保存的病毒，使用含2％FBS的DMEM制备10^-1-10^-9病毒稀释液，每个稀释度终体积为1.2mL左右。常规消化Vero细胞，按照每孔1万个细胞接种至96孔板，37℃过夜培养，弃去细胞上清，每孔100μL稀释病毒液加入细胞中，每个稀释度10个重复。持续观察5天，记录每孔细胞病变情况，计算病毒滴度。

3、病毒测序鉴定

使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取100μL病毒悬液的总DNA。以HSV-1-gG F:GCTTTGTTTGCCGCTGTTTC(SEQ ID NO：1)和HSV-1-gG R:AAGTCGTGTGCTGTTTCTCC(SEQID NO：2)为引物，使用高保真DNA聚合酶扩增HSV-1的US4膜蛋白G基因片段，1％琼脂糖电泳鉴定后，送测序鉴定。

PCR反应体系：10×HiFi buffer(高保真缓冲液)5μL、MgCl₂(50mM)1.2μL、dNTPmixture(dNTP混合溶液)(10mM)1μL、HSV-1-gG F(10μM)1μL、HSV-1-gG R(10μM)1μL、DNA(400ng/1μL)1μL、HiFi polymerase(高保真聚合酶)1μL、ddH₂O 38.8μL。

PCR反应条件：预变性94℃4min，变性98℃10sec退火60℃30sec延伸72℃30sec 35循环，延伸72℃5min，4℃保存。

4、HSV-1 YMM透射电子显微镜形态学鉴定

取10mL病毒悬液使用12000×g离心20min去除细胞碎片，收集上清，使用100000×g超速离心1小时，去除上清，使用300μL PBS重悬，加入300μL 4％多聚甲醛，室温静置10min灭活病毒。取碳支持膜铜网浸入病毒液2min，室温晾制5-10min，使用1％磷钨酸染色1min，使用透射电子显微镜(JEM-1400日本电子株式会社)观察。

5、HSV-1 YMM病毒株分离鉴定结果

患者YMM疱液样本感染Vero细胞，第3天观察到明显的细胞病变，第4天细胞病变达到80％，收集细胞，获得病毒种子。病毒种子使用Vero细胞大量扩增，经测定获得滴度为2.25×10⁸PFUs/mL病毒。

PCR成功扩增出1000bp大小的基因片段，经测序比对分析，扩增片段为HSV-1病毒US4基因，基因序列与美国华盛顿大学分离株(MN401208.1)100％匹配。US4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

US4基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)：

ATGTCGCCGGGCGCCATGCGTGCCGTTGTTCCCATTATCCCATTCCTTTTGGTTCTTGTCGGTGTATCGGGGGTTCCCACCAACGTCTCCTCCACCACCCAACCCCAACTCCAGACCACCGGTCGTCCCTCGCATGAAGCCCCCAACATGACCCAGACCGGCACCACCGACTCTCCCACCGCCATCAGCCTTACCACGCCCGACCACACACCCCCCCATGCCAAGTATCGGACTGGAGGAGGAGGAGGAAGAGGAGGAGGGGGCCGGGGATGGCGAACATCTTAAGGGGGGAGATGGGACCCGTGACACCCTACCCCAGTCCCCGGGTCCAGCCGTCCCGTTGGCCGGGGATGACGAGAAGGACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCACCCCCCGGTCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGACCGAAGACACCCCCCACCAGTATCGGGCCGCTGGCAACTCGACCCACGACCCAACTCCCCTCAAAGGGGCGACCCTTGGTTCCGACGCCTCAACATACCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCGTCAGCACCGTCATCCACACCTTATCGTTTGTGTGTATTGTTGCGATGGCGACACACCTGTGTGGTGGTTGGTCCAGACGCGGGCGACGCACACACCCTAGCGTGCGTTACGTGTGCCTGCCGCCCGAACGCGGGTAG

US4氨基酸序列(SEQ ID NO：14)：

Met Pro Ser Ile Gly Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala GlyAsp Gly Glu His Leu Lys Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro Gln Ser ProGly Pro Ala Val Pro Leu Ala Gly Asp Asp Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro ValVal Pro Pro Pro Gly Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr Ser Arg Pro LysThr Pro Pro Thr Ser Ile Gly Pro Leu Ala Thr Arg Pro Thr Thr Gln Leu Pro SerLys Gly Arg Pro Leu Val Pro Thr Pro Gln His Thr Pro Leu Phe Ser Phe Leu ThrAla Ser Pro Ala Leu Asp Thr Leu Phe Val Val Ser Thr Val Ile His Thr Leu SerPhe Val Cys Ile Val Ala Met Ala Thr His Leu Cys Gly Gly Trp Ser Arg Arg GlyArg Arg Thr His Pro Ser Val Arg Tyr Val Cys Leu Pro Pro Glu Arg Gly

透射电子显微镜下(如图1所示，左图放大50000倍，右图放大150000倍)，病毒颗粒呈圆球状，颗粒直径在100-125nm左右，表面有包膜，可见棘突状包膜蛋白分布于病毒表面。

通过基因序列和形态学分析，确定分离出一株HSV-1病毒，并命名为HSV-1 YMM株。

该单纯疱疹病毒1型HSV-1 YMM株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202189，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年11月30日。

实施例2 HSV-1 YMM细胞毒性及复制能力分析

为了进一步研究HSV-1 YMM能否成为溶瘤病毒的改造平台。首先，我们对HSV-1YMM的细胞毒性和复制能力进行评价，并与HSV-1 F株进行对比研究。

1、HSV-1 YMM对卵巢癌细胞毒性分析

CCK-8法测定病毒细胞毒性：使用SKOV3、ES2和ID8癌细胞按照每孔1000个细胞接种96孔板，37℃培养4小时待细胞贴壁后，分别按照感染复数(Multiplicity of InfectionMOI)1和0.1加入HSV-1 YMM和HSV-1 F病毒稀释液，并设置细胞对照组(NC)。37℃继续培养48小时后，弃去上清，加入含CCK-8完全培养基，37℃培养1小时，使用酶标仪(Synergy H1美国伯腾仪器有限公司)测定450nm吸光值。以对照组(NC)细胞活力为100％，计算病毒感染后各组残留细胞活力百分比(细胞相对活力)，数据处理使用Mean±SD，每组实验重复3次。

结晶紫染色法分析病毒细胞毒性：使用SKOV3、ES2和ID8按照每孔50000个细胞接种48孔板，37℃培养4小时待细胞贴壁后，分别按照MOI 1和0.1加入HSV-1 YMM和HSV-1 F病毒稀释液。37℃继续培养48小时后，使用1％草酸铵结晶紫染色，拍照保存。

2、HSV-1 YMM复制能力分析

按照每孔1×10⁵Vero细胞接种24孔板，37℃培养4小时待细胞贴壁后，弃去上清。使用DMEM稀释病毒，按照MOI 0.1分别加入HSV-1 YMM和HSV-1 F病毒稀释液500μL，37℃吸附4小时后，弃去病毒液，加1mL完全培养基，37℃继续培养。分别在12、24、36、48、60和72小时收集细胞和上清，使用TCID₅₀的方法测定每孔病毒滴度。

3、结果

使用结晶紫染色法研究发现，如图2A所见，使用MOI等于1的病毒，在3株卵巢癌细胞中毒性作用显著，SKOV3和ES2约有70％以上细胞死亡；当MOI等于0.1时，在ES2和ID8中细胞毒性不明显，在SKOV3中可观察到明显细胞毒性，但明显小于MOI 1时的细胞毒性；HSV-1YMM和HSV-1 F相比，在卵巢癌的细胞毒性作用无明显的区别。

使用CCK-8检测，MOI等于1时，如图2B所见，HSV-1 YMM组和HSV-1 F组中细胞活力分别是，SKOV3 33.6±7.4％和35.1±0.83％，ES2 56.2±6.1％和42.8±6.7％，ID8 65±3％和60.33±4.5％；MOI等于0.1时，HSV-1 YMM组和HSV-1 F组中细胞活力分别是，SKOV374.9±7.1％和78.73±5.6％，ES2 96.6±5.8％和91.63±9.2％，ID8 100.6±2.9％和103.6±6.1％。以上结果表明，HSV-1 YMM和HSV-1 F在卵巢癌细胞中细胞毒性作用无明显差异。

如图2C所见，病毒复制能力研究中，HSV-1 YMM在12、24、36、48、60和72小时的病毒产量分别是(9.5±0.4)×10⁴、(1.8±0.8)×10⁶、(2.8±0.7)×10⁷、(6.7±2.2)×10⁷、(3.3±0.9)×10⁷和(1.4±0.7)×10⁸PFUs；HSV-1 F在12、24、36、48、60和72小时的病毒产量分别是(8.4±0.2)×10⁴、(1.9±0.3)×10⁶、(1.4±0.7)×10⁷、(4.7±3.7)×10⁷、(2.4±0.6)×10⁷和(2.3±0.5)×10⁷PFUs。HSV-1 YMM的复制能力与HSV-1 F无显著差异，48小时达到病毒复制高峰，每个细胞病毒产量100-900PFUs。

综上所述，HSV-1 YMM在细胞毒性和复制能力上与HSV-1 F无显著差异。

实施例3实时荧光定量PCR法基因表达分析

分别使用MOI 1的HSV-1 YMM和HSV-1 F病毒感染卵巢癌细胞SKOV3，24小时后，收集细胞，用RNAiso Plus(货号：9108Q，Takara)试剂盒提取总RNA；用PrimeScript^TM RTMaster Mix(货号：RR036Q，Takara)反转录试剂盒合成cDNA；按照试剂盒说明书的程序进行反转录，定量PCR引物序列如下：

GAPDH-F:CCATCTTCCAGGAGCGAGATC(SEQ ID NO：4)

GAPDH-R:AGCCTTCTCCATGGTGGTGA(SEQ ID NO：5)

IFNα-F:TGCTCTCTGGGCTGTGATCTC(SEQ ID NO：6)

IFNα-R:GGAGGAAGGAGAGATTCTGCTCA(SEQ ID NO：7)

IFNβ-F：ATTGACCATCTATGAGATGCTCCAG(SEQ ID NO：8)

IFNβ-R：GTCTCATTCCAGCCAGTGCTAGA(SEQ ID NO：9)

CXCL9-F:GTTCTGATTGGAGTGCAAGGAAC(SEQ ID NO：10)

CXCL9-R:CTTGGGGCAAATTGTTTAAGGTC(SEQ ID NO：11)

CXCL10-F:AGTGGCATTCAAGGAGTACCTCTC(SEQ ID NO：12)

CXCL10-R:CAATGATCTCAACACGTGGACA(SEQ ID NO：13)

分别检测GAPDH内参基因、干扰素α(Interferonα，IFN-α)、干扰素β(Interferonβ，IFN-β)、趋化因子CXC配体9(CXCL9)和趋化因子CXC配体10(CXCL10)；上机检测使用QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪系统，数据处理使用相对定量方法:变化倍数＝2^-ΔΔCt。数据统计使用单因素方差分析方法。以无处理组为1，计算处理组增加倍数，数据呈现使用Mean±SD，每组实验重复3次。

cDNA合成体系：5×PrimeScript^TM RT Master Mix 2μL、RNA 1μg，加RNase FreedH₂O(去RNA酶水)至总体积10μL。

cDNA合成反应条件：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)，4℃。

定量PCR反应体系：2×PowerUp^TM SYBR Green Master Mix 5μL、Primer F(上游引物)(10μM)0.2μL、Primer R(下游引物)(10μM)0.2μL、cDNA 1μL、dH₂O 2.6μL。

反应条件：94℃10分钟，95℃5秒、60℃1分钟，40循环，溶解曲线反应设置。

结果：溶瘤病毒抗肿瘤作用除了直接产生细胞毒性，更重要的是诱导免疫系统，产生特异性抗肿瘤免疫反应。其中病毒诱导产生的I型干扰素(IFN-a和IFN-β)和趋化因子(CXCL9和CXCL10)，在招募抗原递呈细胞，增强肿瘤抗原递呈功能，诱导特异性抗肿瘤免疫发挥重要作用。

我们使用实时荧光定量PCR方法，检测HSV-1 YMM和HSV-1 F感染的卵巢癌细胞中I型干扰素和趋化因子的表达，结果发现，如图3所示：HSV-1 YMM感染SKOV3后IFN-α、CXCL9和CXCL10的表达相比HSV-1 F处理组显著升高。在ES2中，HSV-1 YMM感染后IFN-α、CXCL9和CXCL10也显著升高。HSV-1 YMM诱导IFN-β的表达在ES2细胞中也显著高于HSV-1 F。以上证据表明，HSV-1 YMM感染卵巢癌细胞后诱导抗肿瘤免疫能力显著强于HSV-1 F。

可见，HSV-1 YMM诱导卵巢癌细胞SKOV3表达IFN-α和IFN-β，且IFN-α表达高于HSV-1 F病毒，推测HSV-1 YMM相对于HSV-1 F有更强的诱导抗肿瘤免疫的能力。

研究发现，HSV-1 YMM细胞毒性和复制能力与HSV-1 F无显著差异；这说明HSV-1YMM株在病毒生物学特性上与Teserpaturev亲本病毒HSV-1 F无显著区别，改造为溶瘤病毒时在复制溶瘤能力上不会发生巨大差异。溶瘤病毒抗肿瘤作用除了复制溶瘤，更重要的是诱导抗肿瘤免疫反应。病毒通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡和高表达免疫活化的细胞因子等方式激活抗肿瘤免疫。

序列表

<110> 河南省人民医院

<120> 一株具有潜在抗肿瘤作用的I 型单纯疱疹病毒株及应用

<130> PCR反应

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gctttgtttg ccgctgtttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aagtcgtgtg ctgtttctcc 20

<210> 3

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgtcgccgg gcgccatgcg tgccgttgtt cccattatcc cattcctttt ggttcttgtc 60

ggtgtatcgg gggttcccac caacgtctcc tccaccaccc aaccccaact ccagaccacc 120

ggtcgtccct cgcatgaagc ccccaacatg acccagaccg gcaccaccga ctctcccacc 180

gccatcagcc ttaccacgcc cgaccacaca cccccccatg ccaagtatcg gactggagga 240

ggaggaggaa gaggaggagg gggccgggga tggcgaacat cttaaggggg gagatgggac 300

ccgtgacacc ctaccccagt ccccgggtcc agccgtcccg ttggccgggg atgacgagaa 360

ggacaaaccc aaccgtcccg tagtcccacc ccccggtccc aacaactccc ccgcgcgccc 420

cgagaccagt cgaccgaaga caccccccac cagtatcggg ccgctggcaa ctcgacccac 480

gacccaactc ccctcaaagg ggcgaccctt ggttccgacg cctcaacata ccccgctgtt 540

ctcgttcctc actgcctccc ccgccctgga caccctcttc gtcgtcagca ccgtcatcca 600

caccttatcg tttgtgtgta ttgttgcgat ggcgacacac ctgtgtggtg gttggtccag 660

acgcgggcga cgcacacacc ctagcgtgcg ttacgtgtgc ctgccgcccg aacgcgggta 720

g 721

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccatcttcca ggagcgagat c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

agccttctcc atggtggtga 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgctctctgg gctgtgatct c 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggaggaagga gagattctgc tca 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

attgaccatc tatgagatgc tccag 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtctcattcc agccagtgct aga 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gttctgattg gagtgcaagg aac 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cttggggcaa attgtttaag gtc 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

agtggcattc aaggagtacc tctc 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

caatgatctc aacacgtgga ca 22

<210> 14

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 14

Met Pro Ser Ile Gly Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Asp Gly Glu His Leu Lys Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu

20 25 30

Pro Gln Ser Pro Gly Pro Ala Val Pro Leu Ala Gly Asp Asp Glu Lys

35 40 45

Asp Lys Pro Asn Arg Pro Val Val Pro Pro Pro Gly Pro Asn Asn Ser

50 55 60

Pro Ala Arg Pro Glu Thr Ser Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Pro Leu Ala Thr Arg Pro Thr Thr Gln Leu Pro Ser Lys Gly Arg

85 90 95

Pro Leu Val Pro Thr Pro Gln His Thr Pro Leu Phe Ser Phe Leu Thr

100 105 110

Ala Ser Pro Ala Leu Asp Thr Leu Phe Val Val Ser Thr Val Ile His

115 120 125

Thr Leu Ser Phe Val Cys Ile Val Ala Met Ala Thr His Leu Cys Gly

130 135 140

Gly Trp Ser Arg Arg Gly Arg Arg Thr His Pro Ser Val Arg Tyr Val

145 150 155 160

Cys Leu Pro Pro Glu Arg Gly

165

Claims

1.一株具有潜在抗肿瘤作用的I型单纯疱疹病毒株，其特征在于，所述I型单纯疱疹病毒株为单纯疱疹病毒1型HSV-1YMM株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202189，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年11月30日。

2.如权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒株，其特征在于，所述单纯疱疹病毒1型HSV-1YMM株US4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒株，其特征在于，所述单纯疱疹病毒1型HSV-1YMM株US4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

4.如权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒株在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒株在制备疫苗中的应用。