CN101284869B - 一种抗病毒的多肽及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝎毒素抗病毒的多肽及用途，通过分子生物学和化学合成的方法，获得蝎毒素抗病毒多肽(AVP-W2)，然后采用抗体中和法测定了该蝎毒抗病毒多肽对麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性，在低浓度可以有效抑制病毒感染。多肽AVP-W2在制备治疗或预防由病毒引起的疾病中的应用药物，有很好的前景。本发明的抗病毒肽对MeV和HIV活性高，方法简便，可作为抗病毒药物开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种高效抗病毒功能的多肽。具体地说，本发明涉及一种东亚钳蝎抗病毒多肽在抗麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)中的用途。
背景技术
病毒感染是一个严重危害人类健康的疾病，这个问题困扰了人类多年。早在公元前412年的古希腊时期，希波克拉底就已经记述了类似流感的疾病；1742年至1743年由流感病毒引起的流行性感冒曾殃及90％的东欧人；1889年至1894年席卷西欧的“俄罗斯流感”，发病范围广泛，死亡率很高；1918年，一场致命的流感席卷全球，造成了2000万至5000万人死亡；1957年“亚洲流感”及1968年“香港流感”的爆发，就美国的统计数据来看，分别有7万人和3.4万人因此丧命；流感病毒平均每年在美国也导致11万多人住院，3.4万人死亡。1981年6月，美国疾病控制中心首先报道了5例获得性人类免疫缺陷症，随后，在美国和其他国家都陆续发现了类似症状的病人，后在全世界大规模传播开来；至2003年艾滋病毒感染新例达到近550万例，使全世界艾滋病毒(HIV)携带者和病人(AIDS)数量达到3430万人。报告指出，除非出现奇迹，大部分病人将在今后10年内死亡。自人类发现艾滋病后，已有1880万人死于该绝症；由SARS病毒引起的“非典”在2003年爆发。据世界卫生组织统计数字，2003年全球累计非典病例共8422例，全球因非典死亡人数919人，病死率近11％。从这些统计数据可以看出，病毒感染已经对人类的健康造成极大的危害，并且还正在继续危害人类的健康。
病毒分布广泛，能引起各种人类疾病，难以治疗，危害人类健康。比如HIV病毒引起的获得性人类免疫缺陷症(AIDS)，该病患者的免疫功能部分或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈；流感目前没有药物可以治愈，市面上的流感药物只能够减轻流感症状，通过人体自身的免疫能力对抗病毒。现在比较有效的方法是注射流感疫苗预防，有效率为70％至90％。由于流感病毒极其容易发生变异，每年流行的流感病毒类型不一样，因此必须每年注射疫苗才能发挥作用；乙肝没有办法治愈，但是可以其控制不发作，一旦感染，终生携带。病毒很难杀灭，是由于病毒使用了寄主的活动机制。现有的抗病毒药物一般为病毒遗传物质复制的抑制剂，这些抑制剂也会抑制人体的遗传物质复制，所以对人体也是具有毒性的，所以现在最积极的预防病毒的方法仍然还是接种疫苗。但是有些病毒如流感、HIV，其自身遗传物质不稳定，容易发生突变，从而使得在此之前的疫苗对这种新的突变病毒的预防作用降低或者完全失效。而阳离子防御肽的发现使人们看到了治疗病毒疾病的新方法。
阳离子防御肽是一类由宿主生成，并且在天然免疫中特异性发挥防御性作用的一类小肽。这一类小分子多肽通常由10-50个氨基酸构成，静电荷从+2到+9不等，在生物体抵御微生物的入侵中发挥重要的作用。根据结构的差别，阳离子防御肽可以分为如下几类：含有2-4个β片层的两亲性分子、两亲性α螺旋、卷曲结构、以及含有高级结构的分子。阳离子防御肽在体内对细菌、真菌、寄生虫、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明，蜂毒溶血肽Melitiin和天蚕素Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制人免疫缺陷病毒HIV-1的增殖，爪蟾抗病毒肽Magainin-2对疱疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制效果，这些多肽都是α螺旋类阳离子防御肽。目前的研究表明，α螺旋类阳离子防御肽特异性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒进入的过程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，Dermaseptin就是通过作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，从而达到抗病毒的作用。所以，阳离子防御肽不再是传统的疫苗防治，而是通过直接抑制病毒达到抗病毒的目的。
蝎子中阳离子防御肽的研究也已经有多年的历史。其中除了从淋巴系统中发现的防御肽外，更多的是从蝎毒腺中分离到的防御肽，例如hadrurin，Scorpine，opistoporin，parabutoporin，ISCT，pandinin。这些肽的功能都已经得到有效的鉴定。本室长期从事蝎毒素的研究，目前从文库中筛选并鉴别的系列阳离子多肽。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种抗病毒的多肽，抗病毒活性高，该抗病毒肽含有17个氨基酸，生产成本低，水溶性好。
本发明涉及一种抗病毒多肽在制备治疗或预防麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)感染的药物中的应用，具有抑制病毒感染的功能，抑制效果好，无副作用。多肽AVP-W2在制备MeV和HIV引起疾病的治疗或预防药物中的应用，其在预防和治疗由MeV和HIV所引起的感染效果显著。
为了实现上述目的，采用化学合成的方法，获得了蝎毒抗病毒多肽AVP-W2，抗病毒试验结果表明，抗病毒多肽AVP-W2对MeV和HIV有明显的抑制作用。当AVP-W2的浓度达到10μg/mL时，AVP-W2对MeV和HIV的抑制率就可以达到100％抑制。ABP-W2是一种具有抗病毒能力阳离子防御肽，目前的研究结果显示ABP-W2抗病毒能力强，毒性低；加上ABP-W2只有17个氨基酸，工业生产成本低，所以将阳离子抗病毒肽ABP-W2应用于抗病毒药物具有广阔的前景。
本发明提供的一种蝎毒抗病毒多肽。首先构建高质量东亚钳蝎毒腺组织cDNA文库，具体包括蝎毒腺总RNA的分离和mRNA纯化，cDNA的第一链和第二链合成，双链cDNA与pSPORT1载体(购自美国Invitrogen)的连接和转化，获得蝎毒腺组织cDNA文库。在构建文库的基础上，随机挑选50克隆子进行测序，序列分析发现W2克隆子为一个新的东亚钳蝎抗病毒肽基因，命名为AVP-W2。一种分离的多肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：tactaggaaaatgaaagttaaattccttctcgctgtcttcttgatcgttttggttgttactgatcattgtcatgcattggtcggacttctcccttcggtgatcggagggctggtatcagcattcaagggccgaaggaaacgccagatggaagctcgattcgaaccccaaaataggaattacaggaaacgcgagctcgaccttgaaaagttattcgcaaatatgcctgattactgatctcaattactctttcagtttcatcgcttagcataagtttttcaagttactgccgctactattgcatcatgatgtgaattggttactttctaatataataaaaaaactatacttaatcataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。AVP-W2的前体组织形式编码74个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(22个残基)、成熟肽(17个残基)和前体肽(35个残基)。基于蝎毒素前体C末端残基的加工规则，AVP-W2末端最后的残基Phe被特异性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化(图1)。因此，本发明提供一个东亚钳蝎蝎毒抗病毒肽：LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2(SEQ ID NO：2)。
本发明提供的一种高效抗麻疹病毒的多肽(SEQ ID NO：2)。通过固相化学合成的办法，得到了纯度达95％以上的合成多肽AVP-W2(图2和图3)。抗病毒结果表明合成多肽AVP-W2对MeV和HIV增殖的高效抑制作用，在10μg/mL时，AVP-W2对MeV和HIV的抑制率就可以达到100％抑制。
本发明涉及的AVP-W2抗病毒多肽，只含有17个氨基酸，生产成本低，水溶性好。对于MeV和HIV有良好的抑制作用，而且没有副作用。与现有的抗病毒药物相比，这个药物具有更加直接而且有效的作用。
附图说明
图1东亚钳蝎蝎毒抗病毒肽AVP-W2基因及其氨基酸。
cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；成熟肽氨基酸以黑体标记；方框部分氨基酸为羧肽酶识别位点；阴影部分氨基酸为C端前体肽。
图2东亚钳蝎抗病毒多肽AVP-W2的HPLC纯度图。
图3东亚钳蝎抗病毒多肽AVP-W2质谱鉴定分子量图。
图4不同浓度AVP-W2对MeV滴度的影响。
横坐标为AVP-W2的浓度(μg/mL)，纵坐标为相应浓度的多肽处理后病毒的滴度(titer/mL)。
图5不同浓度AVP-W2对MeV的抑制率。
横坐标为AVP-W2的浓度(μg/mL)，纵坐标为相应浓度的多肽对病毒的抑制率(％)。
图6不同浓度AVP-W2对HIV滴度的影响。
横坐标为AVP-W2的浓度(μg/mL)，纵坐标为相应浓度的多肽处理后病毒的滴度(titer/mL)。
图7不同浓度AVP-W2对HIV的抑制率。
横坐标为AVP-W2的浓度(μg/mL)，纵坐标为相应浓度的多肽对病毒的抑制率(％)。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：一种蝎毒抗病毒多肽的制备。步骤如下：
A：蝎毒腺总RNA的提取(Trizol LS一步法：Trizol LS购自美Invitrogen)
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入10ml Trizol LS混匀，室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室温放置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5m175％乙醇洗涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理的灭菌水，55-60℃保温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TRIZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推荐方法进行。制备的蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总RNA。
B：mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化mRNA，其工作原理是基于寡聚核苷酸Oligo(dT)与mRNA 3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素标记Oligo(dT)，通过它与mRNA 3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的ddH2O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品的制备：将RNA加入到含有32μlβ-巯基乙醇的800μl的GTC中。②探针的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μl，加蒸馏水至50μl；加入1.6ml预热的稀释缓冲液(dilution buffer已加入32μlβ-巯基乙醇)，与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2ml的磁珠SA-PMPS(购自美Promega)于1.5ml的离心管中；用0.5×SSC(氯化钠和柠檬酸三钠溶液：)重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃上清液；2ml的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH2O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000g×3分钟)或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。关于mRNA分离的所有操作步骤见PolyA Tract mRNA分离系统的说明书(Promega，USA)。
C：第一链cDNA合成
①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter和6μl mRNA(含3μgmRNA)，70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加入下列成分：4μl 5X firststrand buffer；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl H2O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加入5μl逆转录酶，混匀后取2μl，加1μl[α-32P]dCTP(4μCi)(示踪管)。与上述反应组分(样品管)同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪管，依次加入43μl 20mM EDTA(乙二胺四乙酸)和5μl酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μl点于两张滤膜上，1份用10％TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空气干燥后，放入1.5ml闪烁液中(为1#样品)；另1份空气干燥后，放入1.5ml闪烁液(为2#样品)。另30μl示踪液，加1.5μl7.5M醋酸氨(NH4Oac)和90μl无水乙醇(-20℃)，混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5ml 70％无水乙醇(-20℃)，14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发，溶于10μl TEN溶液，加入10μl 2X加样缓冲液，取10μl用于碱性凝胶电泳。用[α-32P]dCTP标记λDNA HindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μl 0.2M EDTA终止反应。取6μl反应液和6ml 2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后，用7％TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干(8h左右)，进行放射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。
Hind III 10X buffer 2μl
dGTP 0.2mM
dATP 0.2mM
[α-32P]dCTP 2μCi
Hind III markers 1μg
Klenow DNA polymerase 2unit
Add ddH2O to final volume of 20μl
D：第二链cDNA合成
①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加入2μl(10units)T4DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μl0.5M EDTA；⑤加入等体积(150μl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，彻底涡旋后，室温下14,000rpm离心5min。将水相(140μl)转入另一1.5ml Ep管；⑥加入70μl的7.5M醋酸氨和0.5ML无水乙醇(-20℃)，涡旋后，室温下14,000rpm离心20min；⑦弃上清，加入0.5ml 70％乙醇(-20℃)，同上离心2min。弃上清，37℃干燥10min。
DEPC-treated water 92μl
5X second strand buffer 30μl
10mM dNTP mix 3μl
E.coli DNA ligase(10units/μl) 1μl
E.coli DNA polymerase(10units/μl) 4μl
E.coli RNase H(2units/μl) 1μl
Final Volume 150μl
E：双链cDNA与Sal I衔接头的连接
①用25μl灭菌水溶解步骤D的cDNA样品，然后按下表依次加入；②轻轻混匀，16℃反应过夜(约20h)。③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提和醋酸氨/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
5X T4DNA ligase buffer 10μl
Sal I adapters 10μl
T4DNA ligase 5μl
Final Volume 50μl
F：NotI消化双链cDNA
①将步骤E的样品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温育2h；③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μl TEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存备用。
REACT 3buffer 5μl
Not I 4μl
Final Volume 50μl
G：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除过量SalI衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μl加于离心柱中，2 000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上离心；
②收集洗脱液用于连接反应。
H：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化
①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液中依次加入下列成分：5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M醋酸氨，70μl无水乙醇(-20℃)。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃)洗涤，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl电击转化50μl大肠杆菌(E.coli K12MC1061)。用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG 3’(按SalI衔接头序列设计)；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT15 3’(按NotI引物-衔接头的序列设计)。
5X T4DNA ligase buffer 4μl
pSPORT1，Not I-Sal I-Cut(50ng/μl) 1μl
cDNA(3ng/μl) 4μl
T4DNA ligase 1μl
Add ddH2O to final volume 20μl
I：随机测序策略筛选cDNA文库
随机从构建好的东亚钳蝎毒腺cDNA文库中挑选50克隆子，送上海三博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明克隆子W2为一个全新的抗病毒肽基因，命名为AVP-W2。其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：tactaggaaaatgaaagttaaattccttctcgctgtcttcttgatcgttttggttgttactgatcattgtcatgcattggtcggacttctcccttcggtgatcggagggctggtatcagcattcaagggccgaaggaaacgccagatggaagctcgattcgaaccccaaaataggaattacaggaaacgcgagctcgaccttgaaaagttattcgcaaatatgcctgattactgatctcaattactctttcagtttcatcgcttagcataagtttttcaagttactgccgctactattgcatcatgatgtgaattggttactttctaatataataaaaaaactatacttaatcataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(图1)。AVP-W2的前体组织形式编码74个氨基酸残基，由三个部分组成，即信号肽(22个残基)、成熟肽(17个残基)和前体肽(35个残基)。基于蝎毒素前体C末端残基的加工规则，AVP-W2末端最后的残基Phe被特异性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。AVP-W2抗病毒多肽氨基酸序列，一种分离的东亚钳蝎抗病毒多肽序列，其序列为：LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
实施例2：化学合成蝎毒抗病毒多肽AVP-W2
从东亚钳蝎毒腺中分离了一个由17氨基酸组成的多肽AVP-W2，且被酰氨化。采用固相化学合成的办法获得高纯度的AVP-W2多肽：LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2。
实施例3：抗病毒多肽AVP-W2药物对麻疹病毒的抑制
材料：
A：Vero E6细胞的培养
非洲绿猴肾上皮细胞系(VeroE6)，购自中国典型培养物保藏中心。
培养基：10％(传代培养基)或2％(维持培养基)小牛血清(FCS，GIBCO-BRL)，56℃，30分钟加热灭菌；2mM/mL左旋谷氨酸盐；100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。培养条件为：37℃，5％CO2培养箱培养。
B：病毒株
本研究使用的Edmonston麻疹病毒来源于中科院武汉病毒所(购自美国典型培养物保藏中心)。
具体操作方法：
单层Vero E6细胞接于96孔板，每孔104细胞，加入抗性培养基，使得细胞生长贴壁。病毒加入到含单层Vero E6细胞的维持培养基中，48小时后通过噬斑法测病毒的滴度，通过滴度确定麻疹病毒对于Vero E6细胞的病毒半数组织培养感染量TCID50为2×105titer/mL。
为测定AVP-W2对病毒的作用，贴壁细胞将进行以下三步处理：
A：病毒的处理
50μL的多肽AVP-W2以2.5、5.0、10、20μg/mL的系列浓度，分别与50μL的2×105TCID50/mL麻疹病毒混合，二者均用维持培养基作溶剂；阴性对照为50HL维持培养基与50HL病毒混合。混合后于37℃孵育1小时。孵育后的病毒10倍等比稀释。
B：细胞感染
第一步中处理的病毒加入单层贴壁的Vero E6细胞，每孔50μL。每个浓度的AVP-W2设置3个重复孔。病毒在37℃吸附细胞2小时。然后1000g离心10分钟，去除上清液。重新加入100μL新鲜的维持培养基，在37℃，5％CO2培养箱培养48小时。
C：观察结果
48小时后，观察96孔板中病毒的滴度。加入兔抗麻疹病毒多抗，37℃孵育1小时；然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1小时；最后加入DAB显色，挑选合适的病毒稀释度在显微镜下进行噬斑计数。根据噬斑数求得麻疹病毒滴度。
病毒样品滴度＝噬斑数×稀释倍数
抑制率＝(阴性对照滴度-待测样品滴度)/阴性对照滴度×100％
抗病毒结果表明合成多肽AVP-W2对麻疹病毒的增殖具有高效抑制作用：当AVP-W2的浓度为10μg/mL时，对麻疹病毒增殖的抑制率可以达到97.6％；当AVP-W2的浓度为20μg/mL时，对麻疹病毒增殖的抑制率可以达到100％。
(见表1)
实施例4：抗病毒多肽AVP-W2药物对HIV的抑制
材料：
A：Vero E6细胞的培养
非洲绿猴肾上皮细胞系(VeroE6)购自中国典型培养物保藏中心，人宫颈癌细胞系HeLa(CD4-LTR/β-Gal)来自中科院武汉病毒所。
培养基：10％(传代培养基)或2％(维持培养基)小牛血清(FCS，GIBCO-BRL)，56℃，30分钟加热灭菌；2mM/mL左旋谷氨酸盐；100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。培养条件为：37℃，5％CO2培养箱培养。
B：病毒株
本研究使用的人免疫缺陷病毒株HIV1的基因组DNA(pKS242)来源于中科院武汉病毒所。
具体操作方法：
单层Vero E6细胞接于96孔板，每孔104细胞，加入抗性培养基，使得细胞生长贴壁。为测定AVP-W2对病毒的作用，贴壁细胞将进行以下四步处理：
A：HIV颗粒的收获
将2μg编码HIV1的DNA(pKS242)加入单层Vero E6细胞，37℃孵育2小时。然后，除去旧的培养基，加入新的维持培养基，37℃孵育30小时。30小时后取培养上清，即HIV颗粒。
B：病毒的处理
50μL的多肽AVP-W2以2.5、5.0、10、20μg/mL的系列浓度，分别与50μL上一步收集的病毒混合，二者均用维持培养基作溶剂；阴性对照为50μL维持培养基与50μL病毒混合。混合后于37℃孵育1小时。孵育后的病毒10倍等比稀释。
C：细胞感染
第二步中处理的病毒加入单层贴壁的HeLa(CD4-LTR/β-Gal)细胞，每孔50μL。每个浓度的AVP-W2设置3个重复孔。病毒在37℃吸附细胞2小时。然后1000g离心10分钟，去除上清液。重新加入100μL新鲜的维持培养基，在37℃，5％CO2培养箱培养48小时。
D：观察结果
48小时后，观察96孔板中病毒的滴度。受到HIV病毒感染的HeLa(CD4-LTR/β-Gal)细胞会呈现蓝色，可根据蓝色细胞的数目计算病毒的滴度与抑制率。
病毒样品滴度＝蓝色细胞数目×稀释倍数
抑制率＝(阴性对照滴度-待测样品滴度)/阴性对照滴度×100％
抗病毒结果表明合成多肽AVP-W2对HIV的增殖具有高效抑制作用：当AVP-W2的浓度为10μg/mL时，对HIV病毒增殖的抑制率可以达到93.4％；当AVP-W2的浓度为20μg/mL时，对HIV病毒增殖的抑制率可以达到100％。(见表2)
表1不同浓度AVP-W2对麻疹病毒的作用。
| 多肽浓度(μg/mL) | 2.5 | 5.0 | 10 | 20 | 阴性对照 |
| 滴度(titer/mL) | 66 | 58 | 2 | 0 | 82 |
| 抑制率(％) | 19.5 | 29.3 | 97.6 | 100.0 | 0 |
表2为不同浓度AVP-W2对HIV病毒的抑制作用。
| 多肽浓度(μg/mL) | 2.5 | 5.0 | 10 | 20 | 阴性对照 |
| 滴度(titer/mL) | 63 | 55 | 8 | 0 | 122 |
| 抑制率(％) | 48.4 | 54.9 | 93.4 | 100 | 0 |
SEQUENCE LISTING
Claims (4)
1.一种分离的东亚钳蝎抗病毒的多肽的编码基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的东亚钳蝎抗病毒的多肽，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的一种分离的东亚钳蝎抗病毒的多肽在制备治疗或预防麻疹病毒的药物中的应用。
4.如权利要求2所述的一种分离的东亚钳蝎抗病毒的多肽在制备治疗或预防人免疫缺陷病毒的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Moerman L等.Antibacterial and antifungal properties of alpha-helical,cationic peptides in the venom of scorpions from southernAntibacterial and antifungal properties of alpha-helical,cationic peptides in the venom of scorpions from southernAfrica.EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY269 19.2002,269(19),4799-4810. |
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| Willems J等.Cationic peptides from scorpion venom can stimulate andinhibit polymorphonuclear granulocytes.TOXICON40 12.2002,40(12),1679-1683. |
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