CN115537201A - 一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，该方法用层层组装法，通过控制实验材料制备带磁性的多层量子点微球。该方法合成的量子点磁性微球具有良好的单分散性、较高的编码容量以及较强的荧光稳定性。本发明以磁性聚苯乙烯微球为基体，通过层层组装法的方法将量子点连接到微球表面，可得到较为稳定的结构。本发明制备的量子点磁性聚苯乙烯微球具有良好的均一性、物理化学稳定性及荧光发光性能。本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，具体涉及一种以磁性聚苯乙烯微球为基体，同时连接多层油溶性镉系量子点CdSe/ZnS的制备技术。本发明属于纳米生物医药材料领域。
背景技术
近年来，人们越来越重视定期体检和疫苗接种，因为许多疾病在早期临床上无法检测到，并逐渐发展直至症状开始出现。大量临床实践证明，危及生命的疾病预后的关键在很大程度上取决于早期和准确的诊断。此外，即时监测和评估疾病进展有助于根据患者生物学指标的变化及时进行个体化治疗。
适用于临床的生物标志物检测技术主要是：放射免疫测定，如：中国专利申请号202080013212.7，名称为：标识对放射免疫组合治疗的反应性；中国专利申请号：201980082893.X，名称为：用于治疗癌症的放射免疫疗法和免疫检验点疗法的联合疗法。酶联免疫吸附测定 (ELISA)，如：中国专利申请号： 202121467741.2，名称为：用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板；中国专利申请号： 202120404507.9，名称为：一种用于酶联免疫吸附测定的分区温控试剂盒；中国专利申请号：202021904429.0，名称为：酶联免疫吸附测定用96孔板快干装置。以及，化学发光和时间分辨荧光技术，如：中国专利申请号：201810456820.X，名称为：化学发光测定装置以及测定方法；中国专利申请号：CN201710518746.5，名称为：基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法。然而，这些方法有几个缺点：使用异质免疫分析可能会导致实验结果的某些错误和一些局限性。而且，一个试剂盒只能检测一种因子，导致检测线性窄，对大量标本检测效率低。为了弥补这些缺陷，新一代的生物芯片技术——液体芯片技术逐渐发展起来。 2000年人类基因组计划的完成，开启了以功能基因组学和蛋白质组学为核心的后基因组时代。液体芯片技术就是在这种背景下发展起来的。该技术应用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，也是首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）认证用于临床诊断的生物芯片技术。
目前，全球癌症的发病和死亡负担正在增长，癌症在许多国家的死因顺位上已经超越心血管疾病(如脑卒中和冠心病)等高死亡率慢性疾病，这既反映了人口老龄化进程的加快，也反映了癌症相关危险因素暴露的增加。癌性肿瘤会将少量肿瘤细胞转移到其直接血管系统中;然后这些细胞进入循环系统随后进一步扩散到远处器官，等到发现时往往已经到达了癌症中晚期。因此如何完成癌症的早期准确检测，并得到及时治疗是一个至关重要的问题。这不仅可以减少患者经济负担，也是提高治疗效果，减少癌症死亡率。本项目针对癌症早期诊断的临床需求，以液相悬浮芯片技术为手段，建立外泌体蛋白和核酸测定的新型检测方法。主要思路是，空间调控量子点在载体内外分布，制备荧光性能稳定多色荧光微球。探究表面配体修饰后微球的胶体稳定性和光学性质稳定性以及非特异性吸附状况，制备特异性较好的编码微球。使得该多色量子点荧光微球可以应用于后续分子水平的多靶标联合检测平台中，从而实现不同种类外泌体的捕获、识别与分离，及对外泌体蛋白及核酸的高灵敏测定。
液体芯片，也称为悬浮阵列，是一种基于荧光编码微球的技术。多指标组合诊断技术，将流式细胞仪、激光分析、高速数字信号处理技术有机结合，实现对药物、蛋白质、核酸等一到数百个生物分子的高通量定量检测，高灵敏度。液相芯片主要由微球和流式细胞仪组成，检测原理是以微球为载体进行液相三维检测。可根据不同需求对核酸、蛋白质等生物大分子进行大规模分析。当以油溶性量子点为原料，通过合理控制溶剂条件，利用线性聚乙烯-亚胺（Linear Polyethyleneimine 简称PEI）与量子点内部金属的螯合作用可以成功获得不同荧光强度的多层量子点荧光纳米球，如中国专利申请号202011308574.7，名称为：一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法；中国专利申请号201910892730.X，名称为：一种量子点双发射比率荧光探针及其制备方法；中国专利申请号201811280943.9，名称为：量子点荧光微球及其制备方法，且经多层组装的微球仍然保持较好的单分散性。更进一步地，在微球内部掺杂磁性四氧化三铁，以提升其在临床检测环境里的便捷性，制备主客体多层荧光磁性微球，探索在荧光显微镜成像解码平台构建主客体多层荧光磁性微球编码库的可行性。希望通过实验探索多层荧光微球编码库在液相芯片中建立数字式检测解码分析方法的可行性。
发明内容
本发明目的在于提供一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法。
本发明目的方法通过以下方案实现：一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于以磁性聚苯乙烯微球为基体，同时连接多层油溶性镉系量子点CdSe/ZnS的制备技术，用层层组装法，通过控制实验材料制备带磁性的多层量子点微球，具体如下：
（1）首先制备PEI修饰的磁性微球，称取一定量表面羧基化的磁性微球（MBs）、相应量PEI（Mw=750000g/mol）以及碳二亚胺EDC，将三者共同分散于吗啉乙磺酸(MES)中，混合反应3小时后，将混合液磁分离、去上清后，用超纯水洗涤5次，最后将所得磁性微球分散于超纯水中，得到PEI修饰的MBs；
（2）将PEI修饰的MBs用乙醇洗涤2次，重分散于氯仿/正丁醇混合溶剂，体积比v:v=1:20，随后向该混合液中加入浓度为5mg/mL 的QDs/CHCl3（量子点/三氯甲烷），避光涡旋分散0.5h，反应结束后，先用氯仿/正丁醇混合溶剂对磁性微球洗涤1次，然后用乙醇清洗4次，最后水洗1次，得单层量子点磁性荧光微球（简称Q-MBs）；向Q-MBs中加入 PEI的氯化钠水溶液，涡旋分散，垂直吸附0.5h，之后将混合液进行磁分离、并用超纯水清洗3次，接下来的第二层、第三层等的QDs吸附过程则与上述过程类似，即重复PEI修饰步骤以及QDs吸附步骤，从而得到多层量子点磁性荧光微球（简称nQ-MBs）。
所述的基体为带有磁性的聚苯乙烯微球。
所述的多层量子点可以通过选用不同波长不同颜色的量子点进行包覆，从而有利于后续建立对应的编码库。
以磁性聚苯乙烯微球为基体，使用层层组装法，连接CdSe/ZnS量子点，制备多层量子点荧光磁性微球（nQ-MBs）。该方法得到的nQ-MBs荧光效果好，颗粒均一分散，荧光之间干扰较小，且磁性材料的加入使得分离更加容易，使得材料易于广泛应用。
本发明的优点在于：
（1）本发明以磁性聚苯乙烯微球为基体，通过层层组装法的方法将量子点连接到微球表面，可得到较为稳定的结构。
（2）本发明制备的多层磁性聚苯乙烯微球具有良好的单分散性、较高的编码容量以及较强的荧光稳定性。
（3）本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
附图说明
附图1，为PEI修饰的磁性微球的扫描电镜图；
附图2，为单层量子点磁性荧光微球的扫描电镜图；
附图3，多层量子点磁性荧光微球的扫描电镜图像。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
本发明中使用到的材料表面修饰羧基的磁性聚苯乙烯微球（简称MBs）购买自Bangs Laboratories。正丁醇（AR）氢氧化钠（NaOH, AR）、无水乙醇（CH3CH2OH,AR）、氯仿（CHCl3，AR）购于中国国药集团化学试剂有限公司。聚乙烯亚胺（PEI）和吗啉乙磺酸钠缓冲液（MES）购于Sigma-Aldrich。N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC,99%）购于J&K百灵威科技有限公司。油溶性镉系量子点CdSe/ZnS量子点购于苏州星烁纳米科技有限公司。
实施例1
一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球，以磁性聚苯乙烯微球为基体，同时连接多层油溶性镉系量子点CdSe/ZnS的制备技术，用层层组装法，制备带磁性的多层量子点微球，按如下步骤制备：
（1）制备PEI修饰的磁性微球：称取30mg表面羧基化的磁性聚苯乙烯微球（MBs）、312.4mg的PEI（Mw=750000g/mol）以及10.5mg 的EDC，将三者共同分散于8mL MES（10mM，pH5.0）中，混合反应3小时后，将混合液磁分离、去上清后，用超纯水洗涤5次，最后将所得磁性微球分散于超纯水中，得到PEI修饰的MBs。
如附图1所示，为PEI修饰的磁性微球的扫描电镜图像，可以看出在包裹PEI后样品还是呈现规整的球状，保持较好的单分散性，且基底中没有过多杂质。
实施例2
在实施例1基础上，将制备的PEI修饰的MBs用乙醇洗涤2次，重分散于氯仿/正丁醇混合溶剂（v:v=1:20），随后向该混合液中加入QDs/CHCl3（浓度为5mg/mL），避光涡旋分散0.5h，反应结束后，先用氯仿/正丁醇混合溶剂对磁性微球洗涤1次，然后用乙醇清洗4次，最后水洗1次，得单层量子点磁性荧光微球（简称Q-MBs）。
附图2为单层量子点磁性荧光微球的扫描电镜图像，从图中可以看出微球外包裹了单层量子点后，纳米级的客体子球紧密且均匀地排布于微球表面，呈现类似的草莓结构，对于主体来说还是能看出较明显的介孔。整个微球的形状也相对比较规整，呈现出较好的单分散性。
实施例3
在实施例1或2的基础上，向单层量子点磁性荧光微球Q-MBs中加入1mL的PEI的氯化钠水溶液（Mw=25000g/mol，PEI浓度为9mg/mL，0.5MNaCl），涡旋分散，垂直吸附0.5h，之后将混合液进行磁分离、并用超纯水清洗3次，接下来的第二层、第三层等的量子点QDs吸附过程则与上述过程类似，即重复PEI修饰步骤以及QDs吸附步骤，从而得到多层量子点磁性荧光微球（简称nQ-MBs）。
多层量子点磁性荧光微球的扫描电镜图像如附图3所示，与单层相比明显看出介孔大部分被包覆。
Claims (6)
1.一种多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，以磁性聚苯乙烯微球为基体，同时连接多层油溶性镉系量子点CdSe/ZnS的制备技术，用层层组装法，制备带磁性的多层量子点微球，包括如下步骤：
（1）制备PEI修饰的磁性微球，称取一定量表面羧基化的磁性微球（MBs）、相应量PEI（Mw=750000g/mol）以及EDC，将三者共同分散于MES中，混合反应3小时后，将混合液磁分离、去上清后，用超纯水洗涤5次，最后将所得磁性微球分散于超纯水中，得到PEI修饰的MBs；
（2）将PEI修饰的MBs用乙醇洗涤2次，重分散于氯仿/正丁醇混合溶剂（v:v=1:20），随后向该混合液中加入QDs/CHCl3（浓度为5mg/mL），避光涡旋分散0.5h，反应结束后，先用氯仿/正丁醇混合溶剂对磁性微球洗涤1次，然后用乙醇清洗4次，最后水洗1次，得单层量子点磁性荧光微球（简称Q-MBs）；
（3）向Q-MBs中加入 PEI的氯化钠水溶液，涡旋分散，垂直吸附0.5h，之后将混合液进行磁分离、并用超纯水清洗3次，接下来的第二层、第三层等的QDs吸附过程则与上述过程类似，即重复PEI修饰步骤以及QDs吸附步骤，从而得到多层量子点磁性荧光微球nQ-MBs。
2.根据权利要求1所述多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于所述的基体为带有磁性的聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求1所述多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，所述的多层量子点可以通过选用不同波长不同颜色的量子点进行包覆，以利于后续建立对应的编码库。
4.根据权利要求1或2所述多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，按如下步骤制备：
步骤（1），制备PEI修饰的磁性微球MBs中：称取30mg表面羧基化的磁性聚苯乙烯微球（MBs）、312.4mg的PEI（Mw=750000g/mol）以及10.5mg 的EDC，将三者共同分散于8mL MES（10mM，pH5.0）中，混合反应3小时后，将混合液磁分离、去上清后，用超纯水洗涤5次，最后将所得磁性微球分散于超纯水中，得到PEI修饰的MBs。
5.根据权利要求4所述多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，将制备的PEI修饰的MBs用乙醇洗涤2次，重分散于氯仿/正丁醇混合溶剂（v:v=1:20），随后向该混合液中加入QDs/CHCl3（浓度为5mg/mL），避光涡旋分散0.5h，反应结束后，先用氯仿/正丁醇混合溶剂对磁性微球洗涤1次，然后用乙醇清洗4次，最后水洗1次，得单层量子点磁性荧光微球Q-MBs。
6.根据权利要求1或3所述多层量子点磁性聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，向单层量子点磁性荧光微球Q-MBs中加入1mL的PEI的氯化钠水溶液（Mw=25000g/mol，PEI浓度为9mg/mL，0.5MNaCl），涡旋分散，垂直吸附0.5h，之后将混合液进行磁分离、并用超纯水清洗3次，接下来的第二层、第三层等的量子点QDs吸附过程则与上述过程类似，即重复PEI修饰步骤以及QDs吸附步骤，从而得到多层量子点磁性荧光微球nQ-MBs。
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| CN107936944A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-20 | 韩雪 | 高性能量子点编码磁性微球的制备方法 |
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| XIE MIN: "Fluorescent-magnetic dual-encoded nanospheres: a promising tool for fast-simultaneous-addressable high-throughput analysis", 《NANOTECHNOLOGY》, vol. 23, no. 3, pages 2 * |
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