CN115521288A - 用作诱发抗原特异性反应的免疫原性增强的化合物，其荧光标记物、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种式1所示的用作诱发抗原特异性反应的免疫原性增强的化合物，其荧光标记物、制备方法及用途，属于药物化学技术领域。所述方法包括步骤：由4‑氨基吡啶和DIPEA获得化学式2表示的第一中间体；由所述第一中间体和β‑氨基丙酸甲酯盐酸盐，获得化学式3表示的第二中间体；由所述第二中间体和水合肼反应获得化学式4表示的第三中间体；由第三中间体和异硫氰酸异丙酯获得1‑(2‑(4‑异丙基‑5‑硫氧基‑4,5‑二氢‑1H‑1,2,4‑三唑‑3‑基)乙基)‑3‑(吡啶‑4‑基)脲。本发明制备获得的小分子化合物，能够通过激活CD91进入到DC细胞中。
Figure DDA0003889981550000011
【化学式1】
Figure DDA0003889981550000012
【化学式2】
Figure DDA0003889981550000013
【化学式3】

Description

用作诱发抗原特异性反应的免疫原性增强的化合物，其荧光 标记物、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种用作诱发抗原特异性反应的免疫原性增强的化合物，其荧光标记物、制备方法及用途。
背景技术
感染性疾病或癌症治疗中细胞免疫疗法因其较好的治疗效果越来越受到关注。该方法通过抗原呈递细胞(也叫做树突状细胞(DC))的有效呈现和刺激免疫T细胞来达到杀灭病毒的目的。
热休克蛋白糖蛋白96(gp96)和抗原肽的复合物被抗原呈递细胞吸收，并由主要组织相容性复合体(MHC)I类分子呈递。为了解释这个过程的异常效率，gp96的摄取被认为是通过一个受体发生的，该受体为低密度脂蛋白受体相关蛋白(CD91)。几乎所有热休克蛋白利用CD91受体，即使其中一些蛋白质彼此没有同源性。
免疫原性热休克蛋白(HSP)gp96、hsp70和钙网蛋白与CD91结合用于交叉呈递HSP伴侣肽的抗原呈递细胞。该事件导致引发T细胞反应。我们表明CD91作为这些HSP的信号受体允许抗原呈递细胞(APC)的成熟、细胞因子的分泌和T辅助细胞的启动。具体来说，CD91以一种独特的方式响应HSP被磷酸化模式和磷酸-CD91触发信号级联以激活NF-κB。每个HSP-CD91抗原呈递细胞上的相互作用刺激了一种独特的细胞因子谱，它决定了引发特定的T辅助细胞亚群。
比如，专利CN 109535228 B公开了用作诱发抗原特异性T细胞反应的免疫原性增强剂的融合蛋白，所述融合蛋白包含：(a)抗原呈递细胞(APC)结合域或CD91受体结合域；(b)蛋白转导域；及(c)病原体的抗原，其中，所述APC结合域或CD91受体结合域位于所述融合蛋白的N端，且所述病原体的抗原位于所述蛋白转导域的C端。所述蛋白转导域选自：(i)融合多肽，其包含T细胞致敏信号转导肽、连接子及转位肽；(it)T细胞致敏信号转导肽；及(iii)长度为34-112个氨基酸残基的转位肽。
这些结果对于在携带肿瘤的宿主中原位T细胞反应的发展以及针对癌症和传染病的疫苗接种很重要。
热休克蛋白的分子量一般都比较大，体积较大，不便被DC细胞所摄取。
综上所述，现有技术中与CD91结合的为蛋白质大分子，分子量较大，体积较大，保存不方便，成本相对较高，因此，设计一种能够与CD91结合的小分子化合物，以替代该蛋白质大分子将抗原带入DC细胞，是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用作诱发抗原特异性反应的免疫原性增强的化合物，其荧光标记物、制备方法及用途，能够制备获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲化合物及其荧光标记物，该化合物能够用于细胞免疫疗法。
为实现上述目标，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种1.式1所示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲化合物。
Figure BDA0003889981530000021
【化学式1】
本发明提供了一种合成1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的方法，所述方法包括以下步骤：
由4-氨基吡啶和DIPEA获得化学式2表示的第一中间体；
由所述第一中间体和β-氨基丙酸甲酯盐酸盐，获得化学式3表示的第二中间体；
由所述第二中间体和水合肼反应获得化学式4表示的第三中间体；
由所述第三中间体和异硫氰酸异丙酯获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲。
Figure BDA0003889981530000031
【化学式2】
Figure BDA0003889981530000032
【化学式3】
Figure BDA0003889981530000033
【化学式4】
进一步，由4-氨基吡啶和DIPEA获得化学式2表示的第一中间体，包括以下步骤：
将4-氨基吡啶和DIPEA混合，使用二氯甲烷进行溶解，冷却后滴入氯甲酸苯酯后，保温搅拌，之后移入室温环境继续反应直至反应完全。
进一步，由所述第一中间体和β-氨基丙酸甲酯盐酸盐，获得化学式3表示的第二中间体,包括以下步骤：
将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐加入反应容器中，再向其中依次加入二氯甲烷、三乙胺和化学式3表示的第二中间体，室温下搅拌反应。
进一步，由所述第二中间体和水合肼反应获得化学式4表示的第三中间体，包括以下步骤：
将化学式3表示的第二中间体加入反应容器中，使用乙醇溶解，加入水合肼，回流反应。
进一步，由所述第三中间体和异硫氰酸异丙酯获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲，包括以下步骤：
将化学式4表示的第三中间体和异硫氰酸异丙酯加入反应容器中，用甲醇溶解后，回流反应。
本发明提供了一种4-(3-(3-氨磺酰基苯基)脲基)丁酸化合物在细胞免疫疗法中的用途，所述化合物能够与荧光分子结合，通过激活CD91分子达到进入DC细胞的目的。
本发明提供了一种式5所示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物。
Figure BDA0003889981530000041
【化学式5】
本发明提供了一种合成1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物的方法，所述方法包括以下步骤：
由β-氨基丙酸甲酯盐酸盐和(Boc)2O获得式6所示的第四中间体；
由所述的第四中间体和水合肼获得式7所示的第五中间体；
由所述的第五中间体和异硫氰酸异丙酯获得式8所示的第六中间体；
由所述的第六中间体和氯化氢乙醇获得如式9所示的第七中间体；
由所述的第七中间体和BODIPY-CO2H获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物。
Figure BDA0003889981530000042
【化学式6】
Figure BDA0003889981530000051
【化学式7】
Figure BDA0003889981530000052
【化学式8】
Figure BDA0003889981530000053
【化学式9】
进一步，所述由3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸甲酯和水合肼获得式6所示的第四中间体，包括以下步骤：将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐、二氯甲烷和三乙胺加入反应容器中，冰浴冷却，加入(Boc)2O，保温搅拌，之后移入室温反应。
进一步，所述由第四中间体和异硫氰酸异丙酯获得式7所示的第五中间体，包括以下步骤：将式6所示的第四中间体溶解后，加入水合肼，回流反应。
进一步，由所述的第五中间体和异硫氰酸异丙酯获得如式8所示的第六中间体，包括以下步骤：将式7所示的第五中间体加入反应容器中，用无水乙醇溶解后，加入异硫氰酸异丙酯，加热反应；将反应液去除溶剂后，加入氢氧化钠溶液，回流反应；冷却后调节PH至中性。
进一步，由所述的第六中间体和氯化氢乙醇获得如式9所示的第七中间体，包括以下步骤：将式8所示的第六中间体和氯化氢乙醇溶液在反应容器中混合反应。
进一步，由所述的第七中间体和BODIPY-CO2H获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物，包括以下步骤：将第七中间体、BODIPY-CO2H、BtOH加入反应容器中，使用THF溶解后，冰浴冷却；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和三乙胺，保温搅拌，之后移入室温反应。
本发明由于采用以上技术方案，与现有技术相比，作为举例而非限定，具有以下的优点和积极效果：
本发明中的小分子具有分子量小、易于与CD91结合和快速进入DC细胞的特点。
附图说明
图1为本发明实施例提供的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲化合物的核磁谱图。
图2为本发明实施例提供的第七中间体的核磁谱图。
图3为本发明实施例提供的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的荧光标记物的核磁谱图。
图4为本发明实施例提供的各组CD91的RNA转录水平图。
图5为本发明实施例提供的流式分析确认pAVE3578序列对CD91 RNA干扰情况图。
图6为本发明实施例提供的小分子化合物处理后的DC细胞荧光照片。
图7为本发明实施例提供的流式细胞术分析荧光强度的变化图。
具体实施方式
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制。
实施例1
化学式2表示的第一中间体的制备
Figure BDA0003889981530000071
【化学式2】
Figure BDA0003889981530000072
将4-氨基吡啶和DIPEA加入一个干燥的50-mL圆底烧瓶中，使用二氯甲烷溶解，冰浴冷却至0-5℃，滴入氯甲酸苯酯，保温搅拌半小时，之后移入室温继续反应5h。
以薄层层析监测反应，直至4-氨基吡啶完全消耗。
展开剂：PE:EA＝1:2，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液显色。
反应液旋转蒸发除去溶剂，以硅胶柱层析分离(PE:EA＝1:2)，得第一中间体(白色固体2.05g，产率90％)。
实施例2
化学式3表示的第二中间体的制备
Figure BDA0003889981530000073
【化学式3】
Figure BDA0003889981530000074
Figure BDA0003889981530000081
将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐加入一个干燥的25-mL圆底烧瓶中，依次加入二氯甲烷、三乙胺和实施例1中获得的第一中间体，室温下搅拌反应12h。
以薄层层析监测反应，直至第一中间体转化完毕。
展开剂：DCM:MeOH＝15:1，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液显色(Rf＝0.4)。
反应液旋转蒸发除去溶剂，以硅胶柱层析分离(DCM:MeOH＝20:1)，得第二中间体(白色固体590mg，产率88％)。
实施例3
化学式4表示的第三中间体的制备
Figure BDA0003889981530000082
【化学式4】
Figure BDA0003889981530000083
将实施例2中获得的第二中间体加入一个干燥的50-mL圆底烧瓶中，使用乙醇溶解，加入水合肼，78℃下回流反应12h。
以薄层层析监测反应，直至第二中间体转化完毕。
展开剂：DCM:MeOH＝1:1，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液显色(Rf＝0.3)。
反应液旋转蒸发除去溶剂，以硅胶柱层析分离(DCM:MeOH＝1:1)，得第三中间体(白色固体565mg，产率84％)。
实施例4
化学式5表示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的制备
Figure BDA0003889981530000091
【化学式5】
Figure BDA0003889981530000092
将实施例3获得的第三中间体和异硫氰酸异丙酯加入一个干燥的50-mL圆底烧瓶中，以甲醇溶解，70℃下回流反应10h。
以薄层层析监测反应，直至第三中间体转化完全。
展开剂：DCM:MeOH＝15:1，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液显色。
反应液冷却，加入甲醇钠，加热回流12h。
反应液旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析(DCM:MeOH＝15:1)，得(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲(白色固体502mg，产率72％)。
核磁谱见说明书附图1，可知：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)9.12(s,1H),8.28(bd,J＝6.6Hz,2H),7.35(bd,J＝6.6Hz,2H),6.54(t,J＝6.0Hz,1H),4.89(bs,1H),3.47(td,J＝6.6,6.0Hz,2H),2.94(t,J＝6.6Hz,2H),1.47(d,J＝7.2Hz,6H)。
实施例5
化学式6表示的第四中间体的制备
Figure BDA0003889981530000101
【化学式6】
Figure BDA0003889981530000102
将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐、二氯甲烷和三乙胺加入一个干燥的50-mL圆底烧瓶中，冰浴冷却至0-5℃，加入(Boc)2O，保温搅拌半小时，之后移入室温过夜。
以薄层层析监测反应，直至β-氨基丙酸甲酯盐酸盐完全消耗。
展开剂：DCM:MeOH＝10:1，底物和产物在紫外下不可见，以碱性高锰酸钾溶液显色。
反应液旋转蒸发除去溶剂，所得固体悬浮于PE/EA混合溶液(1:1)，硅胶短柱过滤，滤液旋转蒸发得到第四中间体的粗产物，不经纯化直接用于下一步。
实施例6
化学式7表示的第五中间体的制备
Figure BDA0003889981530000111
【化学式7】
Figure BDA0003889981530000112
将实施例5获得的第四中间体的粗产物溶解于甲醇，加入水合肼，加热至70℃，回流16h。
以薄层层析监测反应，直至第四中间体转化完毕。
展开剂：PE:EA＝1:1，底物和产物在紫外下不可见，以碱性高锰酸钾溶液显色。
反应液旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析(PE:EA＝2:1)，得第五中间体(无色油状物474mg，产率65％)。
实施例7
化学式8表示的第六中间体的制备
Figure BDA0003889981530000113
【化学式8】
Figure BDA0003889981530000114
Figure BDA0003889981530000121
将实施例6中获得的第五中间体加入一个干燥的25-mL圆底烧瓶中，用无水乙醇将其溶解，加入异硫氰酸异丙酯，加热至78℃过夜。
以薄层层析监测反应，直至第五中间体完全消耗。
展开剂：PE:EA＝2:1，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液及茚三酮显色。
反应液旋转蒸发除去溶剂，加入NaOH溶液(2.0M,3mL)，100℃回流10h。
以薄层层析监测反应体系。展开剂：DCM:MeOH＝4:1，产物在紫外下可见，以碱性高锰酸钾溶液及茚三酮显色。
将反应体系冷却至室温，滴加稀盐酸(2.0M)至中性，以乙酸乙酯萃取(10mL*3)。
萃取液合并，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析(DCM:MeOH＝4:1)，得第六中间体(白色固体21.0mg，产率75％)。
实施例8
化学式9表示的第七中间体的制备
Figure BDA0003889981530000122
【化学式9】
Figure BDA0003889981530000123
Figure BDA0003889981530000131
将实施例7中获得的第六中间体加入一个干燥的10-mL圆底烧瓶中，加入新制备的氯化氢乙醇溶液，室温搅拌3h。
以薄层层析监测反应，直至第六中间体完全消耗。展开剂：DCM:MeOH＝1:1，产物在紫外下不可见，以茚三酮显色。
反应液旋转蒸发除去溶剂，所得第七中间体的粗产物(胺盐，白色固体22.5mg，粗产率96％)不经分离，直接用于下一步。
部分样品加碱中和，所得游离胺用于核磁氢谱分析。核磁谱图见说明书附图2，可知：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)7.92(s,1H),3.09(t,J＝6.6Hz,2H),2.95(t,J＝6.6Hz,2H),1.53(d,J＝7.2Hz,6H)。
实施例9
化学式5表示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物的制备
Figure BDA0003889981530000132
【化学式5】
Figure BDA0003889981530000133
将实施例8中获得的第七中间体、BODIPY-CO2H(11)和BtOH加入一个干燥的5-mL圆底烧瓶中，以THF溶解，冰浴冷却至0-5℃，加入EDCI和三乙胺，保温搅拌半小时，之后移入室温过夜。
以薄层层析监测反应，直至第七中间体完全消耗。展开剂：PE:EA＝1:3，产物在紫外下可见，有较强荧光(Rf＝0.1)。
反应液旋转蒸发除去溶剂，使用硅胶柱层析分离(PE:EA＝1:3)，得到荧光标记物BODIPY(1.2mg，产率51％)。
核磁谱图见说明书附图3，可知：1H NMR(600MHz,CDCl3)8.44(bs,1H),5.76-5.73(bs,1H),5.70-5.63(m,1H),5.62-5.59(m,1H),5.56-5.54(m,1H),5.12(bs,1H),4.01-3.92(m,2H),3.91-3.83(m,2H),2.10-1.95(m,4H),1.77-1.70(m,6H)。
实施例10
细胞培养
DC细胞用10％FBS+RPMI-1640培养基正常培养，当生长到80％以上的时候，传代。先弃去细胞培养上清，加2mL的PBS清洗细胞，弃去。加700uL的0.25％胰蛋白酶，放置CO2培养箱中大约1.5min，显微镜下观察细胞形态变圆，轻轻拍打培养瓶，使细胞脱落。加2mL的10％FBS+RPMI-1640培养液使细胞全部脱落。吸取细胞混液于灭菌的15mL离心管中，室温下1000rpm离心3min。弃上清，用1mL的完全培养基重悬，取10uL的细胞悬液加1uL的台盼蓝混匀后，加于细胞计数板进行计数。
实施例11
qPCR分析DC细胞CD91 RNA干扰效果
在实施例5的基础上，保证细胞活力在90％以上，铺6孔板，每孔6×105个细胞。细胞贴壁后弃上清液，换成完全培养基，加入分别包装了下列3种CD91干扰序列pAVE-3576、pAVE-3577、pAVE-3578的腺病毒和包装了对照质粒pAVE-Control腺病毒上清，培养24h后收样，提取总RNA，反转录cDNA，采用下表所示的CD91引物序列，和GAPDH内参引物序列，进行qPCR分析，验证3种CD91干扰序列对CD91的干扰效果。
3种CD91干扰序列如下表
基因 5’-3’ 3’-5’
1.pAVE-3576 GAUCCGUGUGAACCGCUUUAATT UUAAAGCGGUUCACACGGAUCTT
2.pAVE-3577 GCGAACAAACACACUGGCUAATT UUAGCCAGUGUGUUUGUUCGCTT
3.pAVE-3578 GUCCAACUACACGUUACUUAATT UUAAGUAACGUGUAGUUGGACTT
各基因引物序列如下表
基因 Forward(5’-3’) Reverse(5’-3’)
CD91 CTGGCCTATCACCGTGGCTG GACGGTCTCACGCTCGAAGG
MHC-I CTACAACCAGAGCGAGGCCG AATCCTTGCCGTCGTAGGCG
GAPDH GCGGGGCTCTCCAGAACATC TCCACCACTGACACGTTGGC
如图4所示，qPCR分析3种序列对CD91 RNA干扰的差别，实验结果表明第3种序列pAVE3578干扰效果最好，其可用于后续实验。
实施例12
流式分析确认pAVE3578质粒对CD91 RNA的干扰效果
在实施例6的基础上，培养24h后，对干扰效果最好的pAVE3578组收样，流式检测CD91表达量：
方法如下：
实验步骤：
1.收取细胞，4℃下1000rpm离心5分钟，弃去上清液。
2.加入50mL staining Buffer重悬细胞后计数，用台盼蓝(Trypan Blue)进行细胞活性检测。
3.离心细胞液并弃去上清；用Staining Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为2×107个/mL。
4.在每个流式检测管中加入50μL的稀释后的一抗(抗体用Staining Buffer稀释成合适的浓度)；在空白管中加入50μLStaining Buffer。
5.在各管中分别加入50μL细胞悬液，并轻轻混匀。
6.避光4℃孵育20分钟。
7.孵育完成后，4℃下1000rpm离心5分钟，并弃去上清。
8.用100μL Staining Buffer重复洗涤3次。
9.用100μL Staining Buffer重悬细胞后上流式仪检测。
数据分析：
通过graphpad prism 8进行数据分析，用Bonferroni's multiple comparisonstest，alpha＝5.000％进行显著性分析，然后做统计分析。
如图5所示，用干扰腺病毒处理DC细胞后，相比于对照组，pAVE3578较未干扰组CD91的表达量显著降低。
实施例13
总RNA提取实验
包括以下步骤：
吸取6孔板中的培养液，每孔加入1ml Trizol Reagent，用枪头吹打使细胞完全裂解。
将裂解液转移至1.5ml EP管中，室温放置10分钟。
加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温放置10分钟。
12000rpm，4℃离心10分钟，吸取上层清液至新离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10分钟。
12000rpm，4℃离心15分钟，弃去上清液。
沉淀用500μL 75％乙醇洗涤一次。12000rpm、4℃离心5分钟，回收沉淀，弃去上清液。常温，倒置晾干10分钟。
用20μLDEPC-H2O溶解沉淀，测定OD260、OD280，计算RNA浓度。
琼脂糖电泳检查RNA的完整性。
实施例14
Real-time PCR分析
试剂与仪器
实时荧光定量通用试剂(上海生工)
实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，7900，U.S.)
实验方法
逆转录反应体系
Figure BDA0003889981530000171
逆转录程序
42℃30min；85℃10min.
实时荧光定量反应体系
Figure BDA0003889981530000172
定量PCR反应程序
95℃,5分钟变性
95℃,12秒；60℃,40秒.40循环
95℃,10秒；60℃,10秒
40℃,30秒
实施例15
荧光标记的小分子化合物处理DC细胞
保证细胞活力在90％以上，铺6孔板，每孔6×105个细胞。细胞贴壁后弃掉上清，换成完全培养基，分别加入对照质粒pAVE-Control腺病毒上清和第3种序列pAVE3578腺病毒上清，混匀；培养24h后，用荧光标记的小分子化合物处理细胞(40μM)，于3、6、12、24、48h拍照。
图6显示的是每个时间点的白光和荧光下的同一个视野的照片。据图可见小分子化合物处理DC细胞后的24和48h差异最为明显。
实施例16
流式检测细胞荧光
在实例8的基础上，在各时间点收集DC细胞样本，用流式细胞仪检测细胞荧光强度。
步骤如下：
1.收取细胞，4℃下1000rpm离心5分钟，弃去上清液。
2.加入100μL PBS重悬细胞后计数，用台盼蓝(Trypan Blue)进行细胞活性检测。
3.离心细胞液并弃去上清；用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2×107个/mL。
4.将细胞上流式仪检测。
如图7所示，用小分子化合物处理DC细胞24和48h，将CD91进行RNA干扰后(pAVE-3587组)，其荧光强度显著低于CD91 RNA未干扰组(pAVE-Control组)，其余各时间点实验组和对照组荧光强度无显著差异。
虽然已出于说明的目的描述了本公开内容的示例方面，但是本领域技术人员应当意识到，上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所述出现或讨论的顺序来执行功能。本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (14)

1.一种式1所示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲化合物。
Figure FDA0003889981520000011
2.一种合成1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
由4-氨基吡啶和DIPEA获得化学式2表示的第一中间体；
由所述第一中间体和β-氨基丙酸甲酯盐酸盐，获得化学式3表示的第二中间体；
由所述第二中间体和水合肼反应获得化学式4表示的第三中间体；
由所述第三中间体和异硫氰酸异丙酯获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲。
Figure FDA0003889981520000012
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，由4-氨基吡啶和DIPEA获得化学式2表示的第一中间体，包括以下步骤：
将4-氨基吡啶和DIPEA混合，使用二氯甲烷进行溶解，冷却后滴入氯甲酸苯酯后，保温搅拌，之后移入室温环境继续反应直至反应完全。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于,由所述第一中间体和β-氨基丙酸甲酯盐酸盐，获得化学式3表示的第二中间体,包括以下步骤：
将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐加入反应容器中，再向其中依次加入二氯甲烷、三乙胺和化学式2表示的第一中间体，室温下搅拌反应。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于,由所述第二中间体和水合肼反应获得化学式4表示的第三中间体，包括以下步骤：
将化学式3表示的第二中间体加入反应容器中，使用乙醇溶解，加入水合肼，回流反应。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于,由所述第三中间体和异硫氰酸异丙酯获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲，包括以下步骤：
将化学式4表示的第三中间体和异硫氰酸异丙酯加入反应容器中，用甲醇溶解后，回流反应。
7.根据权利要求1所述的一种4-(3-(3-氨磺酰基苯基)脲基)丁酸化合物在细胞免疫疗法中的用途，其特征在于：所述化合物能够与荧光分子结合，通过激活CD91分子达到进入DC细胞的目的。
8.一种式5所示的1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物。
Figure FDA0003889981520000021
9.一种合成1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
由β-氨基丙酸甲酯盐酸盐和(Boc)2O获得式6所示的第四中间体；由所述的第四中间体和水合肼获得式7所示的第五中间体；
由所述的第五中间体和异硫氰酸异丙酯获得式8所示的第六中间体；
由所述的第六中间体和氯化氢乙醇获得如式9所示的第七中间体；
由所述的第七中间体和BODIPY-CO2H获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述由3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸甲酯和水合肼获得式6所示的第四中间体，包括以下步骤：将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐、二氯甲烷和三乙胺加入反应容器中，冰浴冷却，加入(Boc)2O，保温搅拌，之后移入室温反应。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述由第四中间体和异硫氰酸异丙酯获得式7所示的第五中间体，包括以下步骤：将式6所示的第四中间体溶解后，加入水合肼，回流反应。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，由所述的第五中间体和异硫氰酸异丙酯获得如式8所示的第六中间体，包括以下步骤：将式7所示的第五中间体加入反应容器中，用无水乙醇溶解后，加入异硫氰酸异丙酯，加热反应；将反应液去除溶剂后，加入氢氧化钠溶液，回流反应；冷却后调节PH至中性。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，由所述的第六中间体和氯化氢乙醇获得如式9所示的第七中间体，包括以下步骤：将式8所示的第六中间体和氯化氢乙醇溶液在反应容器中混合反应。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，由所述的第七中间体和BODIPY-CO2H获得1-(2-(4-异丙基-5-硫氧基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)脲的BODIPY标记物，包括以下步骤：将第七中间体、BODIPY-CO2H、BtOH加入反应容器中，使用THF溶解后，冰浴冷却；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和三乙胺，保温搅拌，之后移入室温反应。
Figure FDA0003889981520000031
Figure FDA0003889981520000041
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