CN115505052B - 一种β-环糊精衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环糊精衍生物的制备方法，其中环糊精溶解后加入改性的介孔二氧化硅颗粒，加入1，4‑丁烷磺内酯，加热状况下进行回流反应2‑7h，反应完成后将改性介孔二氧化硅颗粒滤除并干燥，再将反应液冷却后通过该颗粒过筛，滤出液用纳滤膜分离杂质，干燥，得到白色粉末状磺丁基‑β‑环糊精。

Description

一种β-环糊精衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及β-环糊精衍生物的制备方法领域，具体而言是磺丁基-β-环糊精的合成方法，特别是一种改进的制备工艺，得到低毒性高稳定性的产品。
背景技术
环糊精（CD ）作为药物辅料可抑制药物 结晶，并降低由药物结晶所引起的组织毒性，CD 还可 通过阻隔药物分子与血管壁上皮细胞的直接接触而减 轻药物对血管的损害。此外，通过与药物形成包合物， CD 亦可掩盖药物本体的气味、抑制药物挥发等，因此在制药领域广泛应用。环糊精的严重限制是其自身相对较差的水溶性，并且其倾向于形成结晶包涵物复合物，对某些药物的表观溶解度不足，并且具有较为严重的肾毒性和溶血性。
SBE-β-CD（商品名Captisol）是β-环糊精 的衍生物，也称为磺丁基-β-环糊精或磺丁基 醚-β-环糊精,是美国20世纪90年代由美国Cydex公司开发，与β-CD相比，其具有更好的水溶性，且溶血作用小、肾毒性低，是一种应用非常广阔的化工材料，在药物辅料、疫苗载体、环保工业等领域应用，主要成分为1、4、7取代物。因取代度、取代位置、立体选择性等差异，产品质量上存在差异。通过实践和改进控制杂质，使其与药物分子包合稳定。有研究表明其在转运包覆病毒载体的脂质体领域，特别是新冠病毒疫苗、柯萨奇病毒疫苗脂质体领域，也有广泛应用前景。
SBE-β-CD结构中具有羧基，故与药 物间的相互作用既可通过疏水作用，亦可借助药物与材 料间的静电相互作用，且本身由于带电而水溶性大幅 度提高。制备方法是β-环糊精与1，4-丁烷磺内酯发生取代，取代反应可发生在β-CD葡萄糖单元2，3，6碳羟基位置上，由于β-CD是由7个吡喃葡萄糖通过α-（1、4）糖苷键连接而成，有21个可能发生取代反应的位点，理论上可以到的取代度为21的β-环糊精衍生物（7个伯羟基，6-OH，14个仲羟基2，3-OH），但由于立体位阻既反应条件的限制，取代度一般不超过10。通常，取代度越高，电荷量越大，结合力先升后降。环糊精对药物稳定性的提高程度取决于嵌入环糊精 内腔的药物基团对于整体药物分子稳定性的影响，并 且与形成的药物-CD 包合物的稳定性密切相关，。因此不同药物由于电荷和取代基结构差异，有不同的结合特性，通过电荷”包合性“较好的药物，在体内环境中可能稳定性不足，易于造成安全性问题，例如氯霉素-SBE-β-CD包合物中， 氯霉素分子中非极性基团大小适于进入SBE-β-CD圆筒空腔中，所以包合反应容易进行，氯霉素中硝基苯基团与苯环相连的C上的OH容易与空腔外侧形成氢键，从而使包合物的稳定性加强，在眼部局部应用可保证安全性。现有技术中鼻咽，眼部，皮肤等药物使用中，可以采用低取代SBE-β-CD，研究表明通过不影响前药表观眼吸收的SBE4-β-CD（平均取代度4）预防毛果芸香平前药的眼睛刺激。SBE-β CD的溶解能力取决于替代程度。通常，取代度越高，因此电荷量越大，结合力越差
如前所述，SBE-β-CD的复杂结构和电性作用使得制备工艺要求较高，虽然可以采用多个凝胶柱层析获得单一取代度产品，例如，DEAE- Sephadex A-25柱分离结合SephadexG-25柱层析脱盐，但在实际工业生产中为了成本和效率，大规模工业化制备难于应用柱层析多步骤方法，获得的产品多为平均取代度在一定范围内的产品。有证据表明尽管SBE-β-CD是环糊精产品中肾毒性较低的一类，但如果使用浓度和用量过高仍会产生较为严重的肾毒性和组织毒性作用，然而提高电荷作用，提高包覆率，又会带来药物稳定性问题，而为了获得更好的药物包覆性和稳定性，避免药物传送中的渗漏和溶解，SBE-β-CD的用量需控制，“稳定性”“包覆率”和“安全性”的考量对SBE-β-CD环糊精材料性能提出较高要求。
许多抗癌药物具有疏水性，药物自身对正常血管和粘膜细胞也具有毒副作用，对于胃肠外特别是静脉注射，除了肠胃外给药后的肾毒性外，另外存在的限制是其自身相对较差的水溶性，由于β-CD倾向于形成结晶包涵物复合物，对某些药物的表观溶解度不足，而增加 SBE-β-CD 用量会导致副作用增加,给辅料的使用带来困难。另外就是溶血问题，β-CD环糊精的伯羟基(6OH)取代通常可至溶血性降低；引入正离子基团可减少溶血的发生，而负离子基团对降低溶血性效应不明显；两性离子基团通常使溶血性增大；亲水性强的正离子基团几乎不引起溶血性效应。基于上述问题，各国药典对于其取代度规定通常在6以上。SBE-β-CD随着替代的增加，溶血减少，对于单磺酰基衍生物，溶血也可能由这些样品中的β-环糊精杂质促成。由于衍生化时取代基的数量(取代度)及取代位置变化较大，具有丰富的结构异构特点，实际制备中获得纯净的平均取代度较高的SBE-β-CD产品及其困难。
CN111138566 A公开了一种碱性电解水法-微波辐射协同制备低取代度磺基丁基醚-β-CD的方法，避免了有机溶剂，使用电解液，更环保，但只能获得低取代的产品，有较高溶血风险不适宜注射用药，不适合合成平均取代度为5以上的产物，率仅70%，包合率也不高。经实验，在碱性电解水中，无论是采用传统水浴法，还是微波辐射法，所得产物的收率都比在氢氧化钠水溶液中要低。
CN1858071A使用钠在二氧六环中夺取β-环糊精羟基上的质子，然后1，4_磺丁内酯与发生取代反应，得到磺丁基醚-β-环糊精粗品，再经葡萄糖凝胶柱(G-25)除盐纯化，冷冻干燥得到产品。
另外，1，4_磺丁内酯在高碱性环境中（PH大于12）易于产生基因毒性的副产物，上述现有技术中多采用酸碱计量仪对1，4_磺丁内酯滴加量控制等方法，保持反应环境的稳定。CN103694376A公开了一种制备磺丁基 醚-β-环糊精的方法。以β-环糊精和1，4-磺丁内酯为原料，通过向碱性水溶液中引入适量有 机溶剂，增加了 1，4_磺丁内酯的溶解度，提高了磺丁基醚-β-环糊精的合成收率。
上述工艺不仅使用大量有机溶剂，而且凝胶柱纯化在工业规模制备中大大提高了成本，制备过程中对PH和滴加速度等条件苛刻也难于实际应用，对于静脉传递药物特别是抗癌药，其制备的辅料安全和稳定性不够。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述问题，通过对 SBE-β-CD制备工艺改良，获得了特别适合静脉用药的辅料产品，并且制备工艺不同于现有技术方法，具有工业可控性，催化剂材料可重复使用，改性后的介孔材料溶液中呈梯度电荷传送，具有稳定的PH环境，制备得到的产品具有集中度较高的取代度范围，溶血性显著低于现有技术类似工艺获得的产品，制备过程环保高效。
本发明采用的具体步骤包括
1）将介孔二氧化硅颗粒（购自北京中科雷鸣科技有限公司）和三羟甲基氨基甲烷粉末倒入搅拌器中搅拌均匀，转入配有冷凝器的反应设备中，搅拌同时加入NaOH溶液，探头超声震荡，在40-80℃条件下冲击反应10-20min，冷却过滤后，干燥即得改性的介孔颗粒。
2）将β-环糊精置于水溶液中，搅拌至环糊精溶解后加入改性的介孔二氧化硅颗粒，加入1，4-丁烷磺内酯，加热状况下进行回流反应2-7h，反应完成后将改性介孔二氧化硅颗粒滤除并干燥，将冷却后的反应液通过该颗粒，滤出液用纳滤膜分离杂质，干燥，得到白色粉末状磺丁基-β-环糊精。
优选的，介孔二氧化硅粒径0.1-0.7μm，孔径2-50nm，更优选，粒径0.4-0.5μm，孔径10-20nm，改性后孔径适度增加，密度： 2.3 g/cm3。
在另一个可选技术方案中，制备步骤2包括： 将β-环糊精置于盛有水溶液的三颈瓶中搅拌溶解，加入改性的介孔二氧化硅颗粒，通过滴液漏斗加入1，4-丁烷磺内酯，加热，回流反应2-4h后，加速搅拌，继续反应2-4h，停止搅拌和加热，将反应液通过介孔二氧化硅颗粒过滤，滤出液用纳滤膜分离，干燥，得到白色粉末状磺丁基-β-环糊精。
所述纳滤膜包括但不限于LNG-NF-101、LNG-NF-106，优选分子量为100-800Da的。
进一步地，介孔二氧化硅颗粒和三羟甲基氨基甲烷粉末的重量比1：0.1-1，介孔二氧化硅颗粒和NaOH重量比为1-10：1，更优选2-4：1；NaOH溶液浓度2-5mol/L。
在一个优选技术方案中，超声探头垂直伸入液面至液面下1/3范围内进行超声震荡，频率为15-38kHz，优选25-30KHz。
进一步的，步骤2中以重量比计，β-环糊精：介孔颗粒：1，4-丁烷磺内酯为1-10：1-10：0.5-2，优选2-8：3-5：1，加热温度40-80℃，优选50-70℃。
进一步的步骤1中冷却是指冷却到室温（15-25℃）,干燥包括但不限于真空干燥、冷冻干燥、旋转蒸发或微波干燥。
其中的改性介孔二氧化硅颗粒相对原二氧化硅颗粒，孔径有所变化，碱性物质在溶液中呈电荷梯度释放-OH。
进一步的，搅拌速度为20-700rpm，加速搅拌速度优选在400-700rpm范围内。
其中，本发明β-环糊精(购自北京科圣化工试剂有限公司)，1, 4-丁磺内酯(购自郑州阿尔法化工有限公司)均为分析纯级； 介孔二氧化硅颗粒（购自北京中科雷鸣科技有限公司）密度 2.3 g/cm3；纳滤膜购自上海甘霖环保有限公司；其余检测设备购自梅特勒-托利多仪器有限公司。
本发明所述室温指15-25℃。
本发明术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
本发明有益效果包括：
1)避免了频繁加入碱液并监控PH的步骤，溶液环境相对有利于获得取代度集中的磺丁基-β-环糊精，避免了取代度分散导致的包合不稳定；降低了副作用，获得药典标准规定的高取代度的产品。其中的超声震荡形成的冲击波，在浅液面形成带疏水电荷的液滴，介孔颗粒改性后负载电荷释放呈梯度。
2）避免使用了昂贵凝胶树脂，对二氧化硅微颗粒改性，使得该颗粒作为催化剂的同时可以作为吸附和过滤材料，获得的回收颗粒可以重复使用，并简化步骤。
3）本发明产品特别适合静脉用药载体使用，特别是抗癌药物载体，在保证包合率情况下其血溶性和血管膜损伤发生率亦显著降低，。
附图说明
图1：实施例1磺丁基-β-环糊精核磁氢谱图。
具体实施方式
实施例1：
制备步骤，
将100g介孔二氧化硅颗粒加入干燥的搅拌器容器中，批量加入50g三羟甲基氨基甲烷粉末， 以20rpm速度搅拌10-30min后，转入配有冷凝器的反应瓶内，以30-40rpm速度磁力搅拌，同时加入4mol/L的NaOH溶液200ml，加热至60℃，将超声探头垂直伸入液面至液面下1/3范围内固定，超声震荡15min，直至液面分层，有白色液滴形成，频率为25-30KHz，停止加热和超声，冷却至室温，静置1-2h后，过滤，沉淀物在40℃真空干燥后得到碱处理后的介孔二氧化硅颗粒（改性介孔二氧化硅颗粒）；
将50gβ-环糊精置于100ml水中搅拌溶解，倒入三颈瓶中，加入40g上述改性介孔二氧化硅颗粒，搅拌速度100rpm，溶液PH在8.5-10范围内，通过滴液漏斗加入10g的1，4-丁磺内酯，加热至50℃，回流反应3h后，PH仍然在8.5以上，继续搅拌反应2h，溶液PH至7.5以下，停止搅拌，趁热过滤出改性介孔二氧化硅颗粒，反应液自然冷却至15℃；将滤除的改性介孔二氧化硅颗粒在60℃真空干燥；将冷却的反应液通过干燥的改性介孔二氧化硅颗粒进行过滤，以吸附去除部分离子和盐，滤出液经纳滤膜LNG-NF-101分离去除小分子杂质后，真空干燥，即得白色粉末状（代号HBHJ00-ZS03-14），经核磁共振氢谱检测为磺丁基-β-环糊精（纯度≥99.7%，收率89%），取代度范围均一度良好（平均取代度6.51），参见附图1。
测定平均取代度：
采用高效毛细管电泳-间接紫外检测分析方法，未涂层熔融石英毛细管柱（60.2cm×50μm×50cm）；压力进样6s（0.5psi）；分离电压30kV；检测波长214nm， 通过比较校正峰面积百分比对实施例1产品组分分析，测定平均取代度为6.51。
检测杂质含量：
采用气相色谱法检测1, 4-丁磺内酯，色谱柱：DB1701（30m×0.32mm×0.25μm，Agilent Technologies）；氢火焰离子化检测器；载气为氮气（纯度99.999%），燃气为氢气，助燃气为空气；载气流速30ml/min；进样口温度为200℃；柱温为程序升温：初始温度100℃，以10℃/min的升温速率升到200℃，恒温0min，再以30℃/min的升温速率升到260℃，恒温3min；检测器温度为270℃；柱前压为9.9psi；分流比为10:1；进样1μl。采用二乙砜作为内标。取实施例HBHJ00-ZS03-14约0.2g，精密称定，置10ml离心管中，精密加入水1ml，涡旋溶解，再精密加入二氯甲烷1ml，涡旋1min，静置分层，取有机相，进样分析，以标准曲线法计算含量。
高效液相离子对色谱-液质联用同时测定磺丁基-β环糊精钠中杂质4-羟基丁磺酸钠和二磺烷基化醚钠。
高效液相色谱法检测β-环糊精杂质量， 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 (4. 6mm×250 mm, 5μm) 柱;流动相为甲醇-水 (10:90) ;流速为1 ml/min;蒸发光散射检测器,柱温:30℃;漂移管温度70℃;气体 (N2) 压力30 psi.结果 在该色谱条件下, SBE-β-CD和β-CD完全分离。
结果表明单杂含量≤0.05%。
实施例2：
将100g介孔二氧化硅颗粒加入干燥的搅拌器容器中，批量加入40g三羟甲基氨基甲烷粉末， 以20rpm速度搅拌20min后，转入配有冷凝器的反应瓶内，以30-40rpm速度磁力搅拌，同时加入5mol/L的NaOH溶液200ml，加热至60℃，将超声探头垂直伸入液面至液面下1/3范围内固定，超声震荡15min，直至液面分层，有白色液滴形成，频率为25-30KHz，停止加热和超声，冷却至室温，静置2h后，过滤沉淀物在40℃真空干燥后得到碱处理后的介孔二氧化硅颗粒（改性介孔二氧化硅颗粒）；
将70gβ-环糊精置于盛有水溶液的三颈瓶中搅拌溶解，加入30上述改性的介孔二氧化硅颗粒，搅拌速度200rpm，通过滴液漏斗加入10g1，4-丁烷磺内酯，加热至60℃，回流反应4h，此期间溶液PH在8.5-9.5范围内；再以500rpm加速搅拌，继续反应2h，此时溶液PH降至8以下，停止搅拌和加热，将介孔二氧化硅颗粒滤除，真空干燥（60℃）后作为过滤筛，反应液自然冷却至室温，将反应液通过该干燥介孔颗粒过筛吸附未反应离子和杂质，滤出液用纳滤膜分离小分子杂质，真空干燥，得到白色粉末状磺丁基-β-环糊精。经核磁共振氢谱检测纯度≥99.6%，收率85%，取代度范围均一度良好。
取代度检测和杂质检查方法同实施例1，平均取代度6.52，单杂含量≤0.05%。
实施例3：
将70gβ-环糊精置于盛有水溶液的三颈瓶中搅拌溶解，加入30g未处理介孔二氧化硅颗粒，搅拌速度200rpm，通过滴液漏斗加入10g1，4-丁烷磺内酯，加热至60℃，滴加5mol/L的NaOH溶液200ml，回流反应4h后以500rpm加速搅拌，继续反应2h，停止搅拌和加热，将介孔二氧化硅颗粒滤除，真空干燥（60℃）后作为过滤筛，反应液自然冷却至室温，将反应液通过介孔二氧化硅颗粒过筛吸附未反应离子和杂质，滤出液用纳滤膜分离小分子杂质，真空干燥，得到白色粉末状磺丁基-β-环糊精纯度≤76%，收率55%。
对比例1为以 CN106565860A实施例1的工艺方法制备磺丁基-β-环糊精，对比例2为CN103694376A 实施例方法制备磺丁基 -β-环糊精,对比例3为市售的磺丁基-β-环糊精（山东滨州致远生物科技有限公司，平均取代度6.5）。
试验1：磺丁基-β-环糊精对药物包合和增溶作用的检测
选择静脉注射抗癌药物紫杉醇作为试验药物。
精密称取本发明上述实施例、对比例的磺丁基-β-环糊精10g和5g紫杉醇分别包合，具体步骤为将上述磺丁基-β-环糊精加入适量水溶解，在室温条件下搅 拌，将紫杉醇分次加入上述水溶液中，搅拌lh。搅拌完成后，将上述溶液过0.45μπι微 孔滤膜，滤液冷冻干燥得固体包合物。平行3份取平均值的包合率。
溶解度测定：称取过量包合物与紫杉醇置10mL容量瓶中，制成过饱和溶液，于25°C振荡24h。 取上清液离心10min，各精密量取上清液适量于10mL容量瓶，40 %的甲醇定容，超声20min，色谱条件进行测定，记录峰面积，代入回归方程计算出包合物与紫衫醇的溶 解度， 增容率=（包合物溶解度）/（紫杉醇溶解度X103）。以紫外可见分光光度计监测24h内药物的释放。结果表明（参见表1）实施例1-2不仅溶解度增加更为明显，并且药物释出更少，表现出一定受控释放和稳定性，包合物药物静输安全性较高。
表1
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
包合率% 92.23 89.78 45.89 48.98 76.95 69.53
增溶率 485.7 456.8 368.8 298.87 345.5 309.9
释出量 0.005% 0.015% 0.25% 2.67% 1.09% 2.98%
试验2：体外细胞毒性评估
将 卵巢癌Ovcar -3 细胞 (5000/孔) 接种到 96 孔板并按照标准在培养皿中生长3天，加无菌的乙醇溶解的实施例1-2包合物， 72 小时后，将细胞固定在 10% 三氯乙酸(TCA) 并经受 使用标准方法进行磺基激素测定， 测量溶解染料的光密度。
结果表明本发明实施例1-2产品对上述癌细胞具有良好抑制活性，包合物和原药相比并无明显差异，抑制率接近100%。
试验3：溶血性
将上述试验例1中制备的各组磺丁基-β-环糊精-紫杉醇包合物配置分别配置为1mg/ml，5mg/ml的溶液。以卫生部药品标准(二部)第五册附录，1996：109的溶血试验项下(紫外分光光度法)测定溶血率（%）。结果表2所示。
表2
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
1mg/ml 0.12 0.32 1.89 2.74 3.89 2.63
5mg/ml 0.34 0.98 3.71 3.87 6.34 7.56
由于溶血性和磺丁基-β-环糊精取代度密切相关，β环糊精可引起广泛的红细胞溶血，对于SBE-β-CD取代度越低越容易发生溶血，药典规定磺丁基-β-环糊精的取代度不得低于6.1，因此实验选择的磺丁基-β-环糊精对比例产品取代度均高于6.1。环糊精静脉用药安全的关键在于包合物是否有溶血的风险，同时，抗癌药物对正常血管壁具有渗透损伤性，在药物转送过程中药物稳定地包合在环糊精内腔避免过早释放也是药物安全稳定的条件。对比例溶血率较高的原因可能与磺丁基-β-环糊精所带电荷与药物结合稳定性有关，也可能由于制备工艺导致取代度分布均匀度不同（虽然平均取代度基本相同，但集中程度有差别），部分低取代磺丁基-β-环糊精导致溶血风险有关。
根据上述实验结果显示实施例1-2样品组相较对照品组具有明显优势，溶血性显著降低，稳定性增加，肾毒性降低，上述效果和制备工艺的改进有关，现有技术在制备过程中常采用pH自动平衡仪控制碱液加入量，需要在制备过程中随时添加NaOH，本发明的改性的介孔二氧化硅颗粒在溶液中具有梯度电荷释放特性，溶液在反应过程中PH可以保持相对稳定，获得的产品具有较高的均一度，取代度高度分布在6.5左右。这种效应的形成可能与超声过程中冲击形成带电荷液滴有关，电荷液滴会产生局部短暂的闭环现象，可能导致介孔颗粒内部电荷发生变化，部分碱基沉淀和结合在孔径内部，改变了二氧化硅颗粒的内部孔径大小和排列，也可能与介孔吸附结构有关。
上述具体实施例并不构成对本发明的保护范围的限定，本领域技术人员可以根据上述说明对本发明进行各种变化和应用。

Claims (4)

1.一种磺丁基-β-环糊精的制备方法，包括如下步骤：
1）将介孔二氧化硅颗粒和三羟甲基氨基甲烷粉末倒入搅拌器中搅拌均匀，转入配有冷凝器的反应设备中，搅拌同时加入NaOH溶液，探头超声震荡，在40-80℃条件下冲击反应10-20min，冷却过滤后，真空干燥即得改性的介孔二氧化硅颗粒；
2）将β-环糊精置于水溶液中，搅拌至环糊精溶解后加入上述改性的介孔二氧化硅颗粒，加入1，4-丁烷磺内酯，加热状况下进行回流反应2-7h，将改性介孔二氧化硅颗粒滤除后干燥，反应液冷却后通过该颗粒过滤，滤出液用纳滤膜分离，干燥，得到白色粉末状磺丁基-β-环糊精。
2.根据权利要求1所述的一种磺丁基-β-环糊精的制备方法，其特征在于，步骤1）中介孔二氧化硅颗粒和三羟甲基氨基甲烷粉末的重量比1：0.1-1，NaOH溶液浓度2-5mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种磺丁基-β-环糊精的制备方法，其特征在于，所述探头超声震荡是指超声探头垂直伸入液面至液面下1/3范围内进行超声震荡，频率为15-38kHz。
4.根据权利要求1所述的一种磺丁基-β-环糊精的制备方法，其特征在于，步骤2）中以重量比计，β-环糊精：改性的介孔二氧化硅颗粒：1，4-丁烷磺内酯为1-10：1-10：0.5-2，加热温度40-80℃。
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