CN115501920B - 一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片制备方法，包括以下步骤：S1、分别制作含有微流道的盖片以及硅模板；S2、在所述硅模板上加工基片形成中间芯片；S3、在所述中间芯片上修饰pH敏感膜，所述pH敏感膜由栅极和饱和甘汞电极分别作为工作电极和参比电极置于电解液中制备而成；S4、将所述盖片与修饰pH敏感膜后的中间芯片键合封装制备芯片；本发明通过深硅刻蚀方法制备硬模版，免去了派瑞林层光刻、显影步骤，优化了OECT微纳制造工艺流程，降低成本，还可以大幅提高批次之间芯片结构、尤其是半导体层的一致性，为高灵敏核酸扩增检测微流控芯片研制提供了新的技术路线。
Description
技术领域
本发明涉及有机电化学晶体管技术领域，具体涉及一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片制备方法。
背景技术
有机电化学晶体管(OECT)是三端子信号放大器件，以具有可渗透性的有机半导体作为沟道材料，并以液体作为栅极介质。由于具有较大的信号放大能力，较好的生物兼容性，OECT被广泛应用于生物传感领域。常见的OECT制备方法包括增材制造(如喷墨打印，3D打印)，激光切割，电化学沉积等。根据Bernard经典理论，OECT的信号放大能力与有机半导体层的几何结构密切相关。一般的，(W×H/L)越大，OECT的信号放大能力越强。其中，W、H、L分别表示半导体层的宽度、厚度与长度。
然而，制备高集成度OECT时，W与H均不宜太大。为此，降低L是提高器件性能的最有效途径。微纳加工工艺是实现半导体层L控制的最直接手段。目前报道的具有最大跨导值(54mS)的OECT就是通过微纳加工工艺制备L为2μm的半导体层实现的。
最早的OECT微纳制备工艺由Mallaris提出。其核心步骤是光刻胶显影后，通过反应离子刻蚀(RIE)方法对派瑞林层进行图案化。但是，光刻胶在后续RIE流程中会同派瑞林层一起被刻蚀，因而需要精确控制光刻胶与派瑞林的刻蚀比。此外，一次流片如果包含不同尺寸的半导体层，将使刻蚀比制定异常复杂。再者，第一、二层派瑞林之间需要涂覆隔离液降低粘附。但是隔离液会与显影液发生反应，使得第二层派瑞林在显影过程中脱附，降低芯片制造的成品率，进而严重阻碍OECT芯片批量制造、以及高性能OECT基传感器的研制。
聚合酶链式反应(PCR)是以DNA半保留复制机制为基础，利用DNA聚合酶在体外条件下通过变性、退火、延伸等步骤扩增特定核酸片段的一种技术。基于PCR技术的分子诊断是医院对传染病诊断的“金标准”。重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种恒温扩增技术,被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，其特点除了具有较高的特异性和灵敏度外，反应速度非常快(约20min)，最适温度在37℃-42℃之间。由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。不管是PCR还是RPA，核酸扩增在延伸步骤中，DNA链末端的3’羟基基团攻击待掺入脱氧核糖核酸的5’α-磷酸基团，发生亲核反应形成3’-5’磷酸二酯键，与此同时，羟基末端上的一个质子被碱基取代。这意味着，每形成一个新的磷酸二酯键，糖-磷酸主链就会释放一个质子，从而使扩增过程伴随着缓冲液pH值的变化。因此，可以通过在OECT中引入pH敏感层，实现核酸扩增的高灵敏度检测。
专利“CN113333042A-一种用于核酸检测的微流控芯片及其制作方法”需要在微流控芯片键合后制备pH敏感膜。但是，用于pH敏感膜电沉积的电解液在微流道内引入可能使pH敏感分子吸附在微流道侧壁以及基底上，影响后续的恒温扩增过程，引入背景噪声，降低传感器的灵敏度与准确度。
发明内容
基于上述问题及原理，本发明提出了一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片制备方法。
具体的，所述制备方法包括以下步骤：
S1、分别制作含有微流道的盖片以及硅模板；
S2、在所述硅模板上加工基片形成中间芯片；
S3、在所述中间芯片上修饰pH敏感膜，所述pH敏感膜由栅极和饱和甘汞电极分别作为工作电极和参比电极置于电解液中制备而成；
S4、将所述盖片与修饰pH敏感膜后的中间芯片键合封装制备芯片。
具体的，在步骤S1中，所述硅模板和盖片均可通过直接购买或者常规工艺获得。作为优选，所述硅模板采用深硅刻蚀工艺制备，所述盖片上设有软光刻工艺制备的1个或多个独立的微流道，微流道数量以不少于8个为佳。
进一步的，在步骤S1中，所述硅模板采用深硅刻蚀工艺制备，具体的说，所述深硅刻蚀工艺的制备方法为：在硅片上制备二氧化硅氧化层；旋涂光刻胶并光刻显影；使用氧等离子体刻蚀硅片；将图案化的硅片置于酸中，去掉二氧化硅层；形成硬质硅模板。
所述硬质硅模板可以重复使用，不仅保证了批次之间芯片的一致性，还可以大幅降低光刻胶、显影液、套刻掩膜版的使用，大幅降低芯片制造成本。
所述步骤S2中，所述加工基片的过程包括在制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元的表面沉积至少一层聚合物绝缘层，然后对准硅模板，打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口，在硅膜板上直接或者移除硅膜板后在最外层聚合物绝缘层上涂布有机半导体层，使有机半导体层能够对应覆盖源极、漏极和栅极窗口，然后通过移除覆盖有多余有机半导体层的硅膜板或者最外层聚合物绝缘层，使极片表面保留有至少一层具有源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应窗口的聚合物绝缘层，形成中间芯片。
更进一步的，在步骤S2中，所述加工基片的过程包括，在所述基片上使用MEMS工艺制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元；然后沉积第一、第二聚合物绝缘层；再通过套刻标记对准硅模板，利用反应离子刻蚀工艺或电感耦合等离子体刻蚀工艺打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口；移除硅模板后，再涂上有机半导体层，使有机半导体层能够对应覆盖源极、漏极和栅极窗口，最后再将第二聚合物绝缘层揭下，形成中间芯片。
进一步的，在步骤S2中，沉积第一聚合物绝缘层前，使用屏蔽胶描边，在第一层聚合物绝缘层形成后，除去屏蔽胶，使第一聚合物绝缘层与基底呈现阶梯状；沉积第二聚合物绝缘层前，也使用屏蔽胶描边，在第二层聚合物绝缘层形成后，除去屏蔽胶，使基底、第一聚合物绝缘层、第二聚合物绝缘层边缘呈现阶梯状。
更进一步的，在步骤S2中，所述加工基片的过程为：在所述基片上使用MEMS工艺制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元；然后沉积聚合物绝缘层；通过套刻标记将硅模板对准，并用反应离子刻蚀工艺或电感耦合等离子体刻蚀工艺打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口；然后通过半导体层模板向电极单元中的源极、漏极和栅极所在的窗口中注入有机半导体层，从垂直于源极、漏极、栅极和PAD电极单元平面的方向移除硅模板，形成中间芯片。
具体的，在步骤S2中，在套刻标记将硅模板对准后，需使用光刻胶粘结后，再使用反应离子刻蚀工艺或电感耦合等离子体刻蚀工艺打开窗口。
由于OECT制造过程涉及沟道位置与电极位置的对准，需要使用套刻工艺，因此微加工需要在2寸(直径50毫米，面积7850mm2)以上的wafer上完成。深硅刻蚀可以通过硬膜版与硅片的外形对齐，因此可以加工1mm2的芯片，单次硅片加工面积降低了近4个数量级。
具体的，所述电解液由EDOT单体、BTB以及PBS溶于KNO3水溶液制备而成。
更进一步的，所述步骤S3中，通过电沉积方法在所述步骤S2制得的中间芯片上修饰pH敏感膜。
有益效果
1.由于OECT制造过程涉及沟道位置与电极位置的对准，需要使用套刻工艺，因此微加工需要在2寸(直径50毫米，面积7850mm2)以上的wafer上完成。本发明所述的深硅刻蚀工艺可以通过硬膜版与硅片的外形对齐，因此可以加工1mm2的芯片，单次硅片加工面积降低了近4个数量级。
2.本发明所述的硬模板可以重复使用，不仅保证了批次之间芯片的一致性，还可以大幅降低光刻胶、显影液、套刻掩膜版的使用，大幅降低芯片制造成本。
3.传统微加工工艺必须使用两层聚合物绝缘层，方能完成OECT制备。本发明使用硬模板方法不仅可以通过单层聚合物绝缘层实现OECT制备，还可以免除传统微加工工艺中的显影过程，减少显影液对聚合物绝缘层与基底、聚合物绝缘层之间贴合的影响，同时大大降低了OECT的制造周期。
4.传统的微加工方法需要使用多步的涂胶、光刻、显影工艺。但光刻胶与显影液配置、光刻胶厚度、显影时间均影响半导体沟道的几何结构。本发明所述的硬模板方法可免除这些工艺流程。因此使用硬模板法可以大幅提高批次之间芯片结构、尤其是半导体层的一致性。
附图说明
图1为本发明所述制备方法主要流程示意图；
图2为一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片结构示意图；
图3为另一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片结构示意图；
图4a为阳性质控的RPA反应过程中电流变化图；
图4b为阴性质控的反应过程中电流变化图；
图4c为上述图4b、图4c两组的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；
图中10-盖片，11-基片，12-硅模板，13-PH敏感膜，101-微流道，111-基底，112-电极层，113-第一绝缘层，114-第二绝缘层，115-半导体层，1121-电极单元，11211-源极，11212-漏极，11213-栅极，1122-PAD电极单元，11221-漏极PAD，11222-漏极PAD，11223-栅极PAD。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，给出了本发明的较佳实施例。但应当理解为这些实施例仅仅是用于更详细说明之用，而不应理解为用以任何形式限制本发明，即并不意于限制本发明的保护范围。
实施例1
一、结构描述
如图2所示，微流控芯片包括：盖片10，基片11，盖片10包含微流道101；基片11包含基底111，电极层112，第一绝缘层113，半导体层115。
电极层112包括多组由源极11211、漏极11212、栅极11213组成的电极单元1121，以及由源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223组成的PAD电极单元1122。
源极11211与源极PAD11221通过导线相连；漏极11212与漏极PAD11222通过导线相连；栅极11213与栅极PAD11223通过导线相连。
半导体层115填满源极11211与漏极11212之间的空隙；半导体层115覆盖源极11211与漏极11212部分或全部表面；半导体层115覆盖栅极11213的部分或者全部。
栅极11213表面的半导体层115上修饰有pH敏感膜13。
微流道101上设置有反应池与电极单元1121的位置相对应。
二.制作方法描述
如图1所示，具体制备方法包括：
(1)分别制作含有微流道的盖片10，硅模板12；
(2)利用硅模板12加工基片11形成中间芯片；
(3)在中间芯片上修饰pH敏感膜13，所述pH敏感膜13由栅极和饱和甘汞电极分别作为工作电极和参比电极置于电解液中制备而成；
(4)将盖片10与修饰pH敏感膜后的中间芯片键合封装。
1.盖片10及微流道101的制备方法为：
(1)分别用丙酮、乙醇、去离子水进行清洗硅片，除去硅片表面的污垢，随后放置在100℃的干燥箱中20min。
(2)将硅片与六甲基二硅烷室温共置于真空干燥箱中2min，将硅片硅烷化。
(3)暗室中，在硅片上倾倒SU8-2025负性光刻胶；静置10min后，将硅片转移到甩胶机上，以600r/min甩胶10s，再反向4000r/min甩胶20s；静置20min后，取出硅片并在干燥箱中80℃干燥2min，120℃干燥10min。
(4)将制备好的印制有液体输入输出口、流体运输通道和反应池的光刻掩膜版用紫外光刻机进行曝光；曝光后，将硅片浸泡在配置好的显影液中显影5min，最后用乙醇冲洗显影后的芯片，得到光刻阳膜。
(5)将显影后的阳膜在干燥箱中110℃下加热20min，加热结束用氮气吹干；将阳膜用三甲基氯硅烷化试剂(TMCS)蒸3min，并氮气吹干。
(6)将硅烷化的阳模芯片放置在容器中，将配置好的PDMS倾倒于阳膜芯片上，PDMS层的厚度约为4mm。
(7)将上述容器转移到真空干燥箱中，抽真空3min，除去PDMS中残留的气泡，然后在干燥箱中80℃干燥2h，固化PDMS。
(8)将固化后的PDMS从阳模上取下，用手术刀将其切成需要的大小，最后用打孔器在PDMS上打出微流道的进液口和出液口。
2.如图2所示，在硅模板12上加工基片11以及修饰pH敏感膜13的具体制备方法为：
(1)选用石英玻璃作为基底111，将基底浸泡于铬酸溶液中24h，利用去离子水清洗，烘干备用；
(2)基底111上溅射厚度为30nm的钛(Ti)作为PDMS与金(Au)的粘附层，再溅射厚度为200nm的金(Au)，形成电极层112；
(3)在金膜上匀胶并烘干，使用掩膜版进行光刻与显影，最后进行湿法腐蚀，实现微电极层112的图形化，形成备用芯片A，包括电极单元1121与PAD电极单元1122；电极单元1121具体包括：源极11211、漏极11212、栅极11213；PAD电极单元1122具体包括：源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223；
(4)源极11211与源极PAD11221通过导线相连；漏极11212与漏极PAD11222通过导线相连；栅极11213与栅极PAD11223通过导线相连；源极11211与漏极1121之间的间距为5微米；源极11211与漏极11212连线与栅极11213之间的间距为20微米；
(5)使用屏蔽胶保护备用芯片A的两侧，并利用气相沉积在微电极层表面铺设派瑞林C作为第一层绝缘层113；
(6)揭取备用芯片A上的屏蔽胶，形成派瑞林C台阶结构，形成备用芯片B；
(7)利用屏蔽胶保护备用芯片B的两侧，并利用气相沉积在第一绝缘层上铺设派瑞林C作为第二层绝缘层114；
(8)揭取备用芯片B上的屏蔽胶，形成派瑞林C二级台阶结构，形成备用芯片C；
(9)通过套刻标记将硅模板12与备用芯片C对准，并通过光刻胶进行固定，台阶结构能够避免光刻胶在硅模板12与备用芯片C之间缝隙的漫延；
(10)通过干法体蚀刻方法打开对应于源极11211、漏极11212、栅极11213以及源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223的窗口；形成备用芯片D；
(11)移除硅模板12，在备用芯片D上旋涂有机半导体层115，形成备用芯片E；
(12)将备用芯片E的第二聚合物绝缘层揭下，形成备用芯片F，所述备用芯片F即为中间芯片；
(13)使用电沉积方法在备用芯片F(中间芯片)的栅极半导体层表面修饰pH敏感膜13，形成备用芯片G；
3.pH敏感膜的制备方法：
(1)将10mmol/L EDOT单体，1mmol/L BTB以及1mmol/L PBS溶于0.1mol/L KNO3水溶液制成电解液；
(2)将备用芯片F上表面覆盖有半导体层115的栅极11213置于电解液中，作为电化学三电极体系的工作电极；
(3)饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝作为对电极；工作电极的电位扫描范围为(0-1V vs.SCE)，扫描速率为100mV/s。5次CV循环后，栅电极呈现淡蓝色，表明其表面已经成功修饰PEDOT:BTB薄膜。
实施例2
如图3所示，本实施例展示另一种基片制备方法制备有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片，具体的：
一.结构描述
1.图3为本发明实施例的芯片结构示意图，微流控芯片包括：盖片10，基片11，盖片10包含微流道101；基片11包含基底111，电极层112，第一绝缘层113，半导体层115。
电极层112包括多组由源极11211、漏极11212、栅极11213组成的电极单元1121，以及由源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223组成的PAD电极单元1122。
源极11211与源极PAD11221通过导线相连；漏极11212与漏极PAD11222通过导线相连；栅极11213与栅极PAD11223通过导线相连。
半导体层115填满源极11211与漏极11212之间的空隙；半导体层115覆盖源极11211与漏极11212部分或全部表面；半导体层115覆盖栅极11213的部分或者全部。
栅极11213表面的半导体层115上修饰有pH敏感膜13。
微流道101上设置有反应池与电极单元1121的位置相对应。
二.制作方法描述
如图1所示，具体制备方法包括：
(1)分别制作含有微流道的盖片10，硅模板12；
(2)利用硅模板12加工基片11形成中间芯片；
(3)在中间芯片上修饰pH敏感膜13，所述pH敏感膜13由栅极和饱和甘汞电极分别作为工作电极和参比电极置于电解液中制备而成；
(4)将盖片10与修饰pH敏感膜后的中间芯片键合封装。
1.盖片10及微流道101的制备方法为：
(1)分别用丙酮、乙醇、去离子水进行清洗硅片，除去硅片表面的污垢，随后放置在100℃的干燥箱中20min。
(2)将硅片与六甲基二硅烷室温共置于真空干燥箱中2min，将硅片硅烷化。
(3)暗室中，在硅片上倾倒SU8-2025负性光刻胶；静置10min后，将硅片转移到甩胶机上，以600r/min甩胶10s，再反向4000r/min甩胶20s；静置20min后，取出硅片并在干燥箱中80℃干燥2min，120℃干燥10min。
(4)将制备好的印制有液体输入输出口、流体运输通道和反应池的光刻掩膜版用紫外光刻机进行曝光；曝光后，将硅片浸泡在配置好的显影液中显影5min，最后用乙醇冲洗显影后的芯片，得到光刻阳膜。
(5)将显影后的阳膜在干燥箱中110℃下加热20min，加热结束用氮气吹干；将阳膜用三甲基氯硅烷化试剂(TMCS)蒸3min，并氮气吹干。
(6)将硅烷化的阳模芯片放置在容器中，将配置好的PDMS倾倒于阳膜芯片上，PDMS层的厚度约为4mm。
(7)将上述容器转移到真空干燥箱中，抽真空3min，除去PDMS中残留的气泡，然后在干燥箱中80℃干燥2h，固化PDMS。
(8)将固化后的PDMS从阳模上取下，用手术刀将其切成需要的大小，最后用打孔器在PDMS上打出微流道的进液口和出液口。
2.在硅模板12上加工基片11以及修饰pH敏感膜13的具体制备方法为：
(1)选用石英玻璃作为基底111，将基底浸泡于铬酸溶液中24h，利用去离子水清洗，烘干备用；
(2)基底111上溅射厚度为30nm的钛(Ti)作为PDMS与金(Au)的粘附层，再溅射厚度为200nm的金(Au)，形成电极层112；
(3)在金膜上匀胶并烘干，使用掩膜版进行光刻与显影，最后进行湿法腐蚀，实现微电极层112的图形化，形成备用芯片a，包括电极单元1121与PAD电极单元1122；电极单元1121具体包括：源极11211、漏极11212、栅极11213；PAD电极单元1122具体包括：源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223；
(4)源极11211与源极PAD11221通过导线相连；漏极11212与漏极PAD11222通过导线相连；栅极11213与栅极PAD11223通过导线相连；源极11211与漏极1121之间的间距为5微米；源极11211与漏极1121连线与栅极11213之间的间距为20微米；
(5)使用屏蔽胶保护备用芯片a的两侧，并利用气相沉积在微电极层表面铺设派瑞林C作为绝缘层113；形成备用芯片b；
(6)通过套刻标记将硅模板12与备用芯片b对准，并通过干法体蚀刻方法打开对应于源极11211、漏极11212、栅极11213以及源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223的窗口；并打开对应于源极11211、漏极11212、栅极11213之间的间隙的窗口结构；形成备用芯片c；
(7)芯片c表面注入有机半导体材料(PEDOT:PSS)；
(8)将硅模板12从平行于源极/漏极/栅极平面的方向移除，形成备用芯片d，所述备用芯片d即为中间芯片；
(9)备用芯片d包括：基底111，源极11211、漏极11212、栅极11213、源极PAD11221、漏极PAD11222、栅极PAD11223、绝缘层113、半导体层115；
(10)使用电沉积方法在备用芯片d(中间芯片)的栅极半导体层表面修饰pH敏感层13，形成备用芯片e；
3.pH敏感膜的制备方法：
(1)将10mmol/L EDOT单体，1mmol/L BTB以及1mmol/L PBS溶于0.1mol/L KNO3水溶液制成电解液；
(2)将备用芯片d上表面覆盖有半导体层115的栅极11213置于电解液中，作为电化学三电极体系的工作电极；
(3)饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝作为对电极；工作电极的电位扫描范围为(0-1V vs.SCE)，扫描速率为100mV/s。5次CV循环后，栅电极呈现淡蓝色，表明其表面已经成功修饰PEDOT:BTB薄膜。
实施例3
本实施例展示实施例1-2所述的有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片使用方法：
使用病毒RNA提取试剂盒提取同时携带有N基因、E基因和ORF1ab基因的SARS-Cov-2假病毒RNA和临床样本，-20℃保存备用。SARS-Cov-2假病毒从公司购买；
以TwistDx公司的Basic RT试剂盒为例，配制RPA扩增体系。为保证检测结果的准确性，设置3个阳性对照组(SARS-Cov-2假病毒RNA)、阴性对照组(无SARS-Cov-2假病毒RNA)和3个样本检测组，多组RPA反应微流道(Ⅱ-Ⅷ)在设计上是彼此独立的；
(1)微流道Ⅰ用作器件性能验证，测试微流道Ⅰ中的器件pH响应；
(2)4℃条件下向微流道Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中分别通入SARS-Cov-2假病毒RNA和相同体积的去离子水，向微流道Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ通入待测样品。
(3)4℃条件下分别向微流道Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ中通入重组酶聚合酶与脱氧核糖核苷酸dNTPs、以及去离子水；然后向通道Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中通入对应于N基因、E基因、ORF1ab基因的RPA引物作为阳性对照、通道Ⅴ中通入相同体积的去离子水作为阴性对照；通道Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ中分别通入N基因、E基因、ORF1ab基因的RPA引物用于检测待测样本；
其中微流道Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ用作RPA反应的阳性对照：加入缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTPs、SARS-Cov-2假病毒RNA的三种基因(N基因、E基因、ORF1ab基因)、及其对应的RPA引物、以及去离子水；
微流道Ⅴ用作RPA反应的阴性对照：加入缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTPs、SARS-Cov-2假病毒的RPA引物和去离子水，但是不加入SARS-Cov-2假病毒模板；
微流道Ⅵ用作SARS-Cov-2核壳蛋白N基因的RPA反应：加入缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTPs、待测样本、N基因的RPA引物以及去离子水；
微流道Ⅶ用作SARS-Cov-2膜蛋白E基因的RPA反应：加入缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTPs、待测样本、E基因的RPA引物以及去离子水；
微流道Ⅷ用作SARS-Cov-2ORF1ab基因的RPA反应：加入缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTPs、待测样本、ORF1ab基因的RPA引物和去离子水。
(4)将芯片温度提高至42℃；
(5)控制所有栅极电位为0.6V，漏极电位为-0.6V，源极电位为0V，测量源极PAD与漏极PAD之间的电流变化；
(6)通过微流道Ⅰ中的器件pH响应计算待测核酸浓度。
图4展示了上述实施例1-2所述的芯片响应SARS-Cov-2假病毒阳性质控和阴性质控的核酸检测结果。具体地，针对SARS-Cov-2病毒基因组高度保守区域ORF1ab设计特异性引物，取阳性质控和阴性质控分别加入到恒温扩增(RPA)反应混合液中。将上述制备好的芯片放入PCR反应管，确保反应混合液浸没控制栅极。
更具体地，按照RPA试剂盒说明书，配制RPA反应混合液(缓冲液、重组酶聚合酶、脱氧核糖核苷酸dNTP、ORF1ab上下游扩增引物)分装成两个PCR反应管。然后，分别取2ul阳性质控(～200copies)或者阴性质控(～0copies)加入到上述PCR反应管后放入恒温水浴锅(37℃-42℃)。最后，加入镁离子溶液作为反应激活剂。对芯片的控制栅极输入1V的直流电压信号，当RPA反应进行时，控制栅极发生pH变化导致其电位发生变化，实时测量(每分钟测量)源极PAD电极与漏极PAD电极之间的电流变化来确定反应体系中的核酸扩增情况。
结果分析：
20分钟后，RPA扩增完毕。阳性质控(4a)的RPA反应过程检测到明显的电流变化，而阴性质控(4b)的反应过程中几乎无电流变化。核酸扩增完成后，取两组的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图4c)，阳性质控组显示有大量DNA产物(100-200bp)，而阴性质控组则无DNA产生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种有机电化学晶体管增敏的核酸扩增检测微流控芯片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别制作含有微流道的盖片以及硅模板；
S2、在所述硅模板上加工基片形成中间芯片；
S3、在所述中间芯片上修饰pH敏感膜，所述pH敏感膜由栅极和饱和甘汞电极分别作为工作电极和参比电极置于电解液中制备而成；
S4、将所述盖片与修饰pH敏感膜后的中间芯片键合封装制备芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述硅模板采用深硅刻蚀工艺制备，所述盖片上设有软光刻工艺制备的相互独立的一个或多个微流道。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述微流道数量至少8个。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述深硅刻蚀工艺的制备方法为：在硅片上制备二氧化硅氧化层；旋涂光刻胶并光刻显影；使用氧等离子体刻蚀硅片；将图案化的硅片置于酸中，去掉二氧化硅层；形成硬质硅模板。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述加工基片的过程包括在制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元的表面沉积至少一层聚合物绝缘层，然后对准硅模板，打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口，在硅膜板上直接或者移除硅膜板后在最外层聚合物绝缘层上涂布有机半导体层，使有机半导体层能够对应覆盖源极、漏极和栅极窗口，然后通过移除覆盖有多余有机半导体层的硅膜板或者最外层聚合物绝缘层，使极片表面保留有至少一层具有源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应窗口的聚合物绝缘层，形成中间芯片。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述加工基片的过程包括，在所述基片上使用MEMS工艺制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元；然后沉积第一、第二聚合物绝缘层；再通过套刻标记对准硅模板，利用反应离子刻蚀工艺或电感耦合等离子体刻蚀工艺打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口；移除硅模板后，再涂上有机半导体层，使有机半导体层能够对应覆盖源极、漏极和栅极窗口，最后再将第二聚合物绝缘层揭下，形成中间芯片。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，沉积第一聚合物绝缘层前，使用屏蔽胶描边，在第一层聚合物绝缘层形成后，除去屏蔽胶，使第一聚合物绝缘层与基底呈现阶梯状；沉积第二聚合物绝缘层前，也使用屏蔽胶描边，在第二层聚合物绝缘层形成后，除去屏蔽胶，使基底、第一聚合物绝缘层、第二聚合物绝缘层边缘呈现阶梯状。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述加工基片的过程为：在所述基片上使用MEMS工艺制备源极、漏极、栅极和PAD电极单元；然后沉积聚合物绝缘层；通过套刻标记将硅模板对准，并用反应离子刻蚀工艺或电感耦合等离子体刻蚀工艺打开源极、漏极、栅极和PAD电极单元对应的窗口；然后通过半导体层模板向源极、漏极和栅极所在的窗口中注入有机半导体层，从垂直于源极、漏极、栅极和PAD电极单元平面的方向移除硅模板，形成中间芯片。
9.根据权利要求5或7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，在套刻标记将硅模板对准后，需使用光刻胶粘结后，再使用反应离子刻蚀工艺打开窗口。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述电解液由EDOT单体、BTB以及PBS溶于KNO3水溶液制备而成。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过电沉积方法在步骤S2所述的中间芯片上修饰pH敏感膜。
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