CN115491299A - 一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统及其应用。所述气液界面暴露系统包括生物气溶胶发生单元、输送单元和细胞暴露单元；所述气溶胶发生单元由空气压缩机、高效空气过滤器一、质量流量控制器一、雾化器依次经聚四氟乙烯管和转接头串联组成；所述输送单元包括缓冲瓶、高效空气过滤器二、质量流量控制器二和高效空气过滤器三；所述细胞暴露单元包括干燥管、气溶胶检测仪和细胞处理模块，所述细胞处理模块包括暴露模块和尾气外排模块；所述尾气外排模块包括依次连接的高效空气过滤器四、质量流量控制器三和抽气泵，该气液界面暴露系统能够更真实的模拟气溶胶在人体肺部的呼吸暴露情况，提高了大气气溶胶呼吸暴露风险评估的准确性。

Description

一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统及其 应用
技术领域
本发明属于毒害污染物暴露与健康风险评估技术领域，具体涉及一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统及其应用。
背景技术
作为大气污染物的重要组成部分，大气气溶胶从微米到纳米级的尺寸分布，使其很容易通过呼吸系统在肺部沉积或随循环系统分布在人体的各个部位，进而危害人体健康。研究显示，气溶胶暴露与哮喘，麻疹，肺炎，癌症及某些传染性疾病等都存在着显著的相关性。然而，目前气溶胶暴露对人体的健康影响及其生理生化机制仍存在很多未知。建立气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露模型，对于气溶胶暴露过程中的生理效应与作用机制的研究具有重要意义。
目前呼吸系统的体外暴露模型，往往采用浸没式暴露的方法，直接将毒害污染物或治疗药物添加至细胞培养基中进行细胞毒性评价。这种暴露模型不仅忽略了真实的肺部微环境，不能很好地模拟肺部的真实快速吸收和交换过程，而且气溶胶颗粒特性(例如尺寸、表面电荷、溶解度、聚集状态和化学特性等)在溶液中会发生改变。相比而言，气液界面暴露模型能够更加真实的模拟人体呼吸系统接触气溶胶的过程。
目前气溶胶的健康效应评估研究主要通过收集环境气溶胶并进行细胞暴露。气溶胶的生理生化效应主要取决于其组成、浓度、尺寸分布、溶解性等理化特性。直接收集的环境气溶胶因其复杂组成和差异性理化性质，导致了不同研究中气溶胶毒作用效应的异质性，也导致了气溶胶毒作用机制研究的另一难点。实验室发生气溶胶能有效控制气溶胶的物理特性，对于研究物理特性对气溶胶毒效应的影响有重要意义，也是气溶胶致病机制研究的基础。
据报道，生物气溶胶造成了高达34％的室内空气污染，大约24％的大气颗粒物和5％～10％的总悬浮颗粒由生物气溶胶组成，其中，细菌和真菌是最重要组成，全球每年细菌和真菌的排放量超过28tg和190tg。且相比其他化学组分，生物气溶胶因其增殖活性表现出极大的健康威胁，甚至特定生物气溶胶的危害是没有阈值的。基于此，生物气溶胶，尤其是以细菌、病毒或真菌为主的具有生物活性的生物气溶胶的健康风险需要更多的关注。
现有技术虽然公开了一种细胞暴露在气溶胶中的实验设备，但是其设备制备的气溶胶是纳米颗粒气溶胶，利用高压放电原理和精确注射泵组成的电晕场气化纳米颗粒溶液制备纳米颗粒气溶胶，此气溶胶的制备设备并不能适用于生物气溶胶的制备。中国发明专利CN113933217A公开了一种生物气溶胶的发生和平衡系统，但是其仅仅是提供了生物气溶胶发生的装置，并没有涉及气溶胶的细胞暴露，如何在保证生物气溶胶生物活性的同时保持细胞的良好活性，这需要对气溶胶的发生及气溶胶暴露过程的条件进行严格控制，现有研究并未涉及同时对气溶胶发生条件和气溶胶对细胞暴露条件的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有同时保持生物气溶胶生物活性及保持细胞的良好活性的气溶胶对细胞暴露条件的缺乏，提供一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统及其应用。
本发明的目的在于提供一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统。
本发明的目的还在于提供所述气液界面暴露系统在气液界面暴露细胞的研究中的应用。
本发明的目的还在于提供利用所述气液界面暴露系统暴露细胞的方法。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
本发明提供了一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统，所述气液界面暴露系统包括生物气溶胶发生单元1、输送单元2和细胞暴露单元3；所述气溶胶发生单元由空气压缩机4、高效空气过滤器一5、质量流量控制器一6、雾化器7依次经聚四氟乙烯管和转接头串联组成；所述输送单元包括缓冲瓶8、高效空气过滤器二9、质量流量控制器二10和高效空气过滤器三11；所述细胞暴露单元3包括干燥管12、气溶胶检测仪13和细胞处理模块，所述细胞处理模块包括暴露模块14和尾气外排模块19；所述尾气外排模块19包括依次连接的高效空气过滤器四16、质量流量控制器三17和抽气泵18；所述雾化器7一端与质量流量控制器一6相连，另一端与缓冲瓶8相连；质量流量控制器二10一端与高效空气过滤器二9相连，另一端与缓冲瓶8；高效空气过滤器三11与缓冲瓶8相连；干燥管12一端与缓冲瓶8相连，另一端与暴露模块14相连；干燥管12与暴露模块14之间还设置有气溶胶检测仪13，用于检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；暴露模块14、高效空气过滤器四16、质量流量控制器三17与抽气泵18依次串联；暴露模块14上设置有温控模块15，用于维持暴露模块的温度。
优选地，所述细胞暴露单元3包括一套或多套细胞处理模块。
优选地，所述暴露模块14包括一个或多个暴露腔；所述高效空气过滤器四16和质量流量控制器三17的数目比暴露腔个数多一个；每个暴露腔分别串联一个高效空气过滤器四16和质量流量控制器三17。暴露腔内放置对应尺寸的Transwell小室，用于放置待暴露细胞。
优选地，所述暴露模块均包括3个或6个暴露腔。
进一步优选地，所述暴露模块包括3个暴露腔。
进一步优选地，所述暴露模块包括6个暴露腔。
优选地，所述暴露模块14包括三个暴露腔，暴露腔一141、暴露腔二142、暴露腔三143；所述高效空气过滤器四16包括四个，分别为高效空气过滤器四一161、高效空气过滤器四二162、高效空气过滤器四三163和高效空气过滤器四四164；所述质量流量控制器三17包括四个，分别为质量流量控制器三一171、质量流量控制器三二172、质量流量控制器三三173和质量流量控制器三四174；干燥管12通过分支管道与暴露腔一141、暴露腔二142、暴露腔三143相连，暴露腔一141与高效空气过滤器四一161相连，暴露腔二142与高效空气过滤器四二162相连，暴露腔三143与高效空气过滤器四三163相连；干燥管12通过主管道与高效空气过滤器四四164相连；高效空气过滤器四一161、四二162、四三163和四四164分别与质量流量控制器三一171、三二172、三三173和三四174相连；质量流量控制器三一171、三二172、三三173和三四174分别连接于主管道然后通过主管道与抽气泵18相连。
优选地，所述高效空气过滤器均包括壳体和滤芯，捕集粒径为0.1μm以上；避免空气中颗粒的干扰。
优选地，所述质量流量控制器均为热传感式。
优选地，所述质量流量控制器一6和质量流量控制器二10的量程为0～30L/min；所述质量流量控制器三四174的量程为0～1.5L/min；所述质量流量控制器三一171、三二172和三三173的量程为0～10mL/min。
优选地，所述雾化器7为空气压缩雾化器。
优选地，所述干燥管12带有湿度传感器，可实时监测并调控气溶胶气体的湿度。
优选地，所述温控模块包括加热或制冷元件、温度传感器，用于控制密闭暴露腔暴露温度维持在36～38℃。
优选地，所述暴露腔带有细胞培养Transwell小室支架，与Transwell小室适配，Transwell小室经聚酯膜或聚碳酸酯膜隔成上层和下层，暴露时Transwell小室下层(即暴露腔内)添加新鲜培养基，上层为贴壁细胞。
优选地，所述聚酯膜或聚碳酸酯膜孔径大小为0.1～12μm。
优选地，所述聚酯膜或聚碳酸酯膜孔径大小为0.1～3.0μm。
优选地，所述Transwell小室经聚酯膜隔成上层和下层，聚酯膜为透明膜，便于在显微镜下观察细胞状态，膜孔径0.1～3.0μm，细胞不会穿过聚酯膜，避免气液界面培养过程中细胞发生迁移。
气液界面暴露系统在气液界面暴露细胞的研究中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用中的细胞为呼吸道上皮细胞。
优选地，步骤S1中，所述呼吸道上皮细胞为呼吸道上皮细胞的永生化细胞。永生化细胞系比原代细胞更为稳定。
所述呼吸道上皮细胞为人正常肺上皮细胞、人支气管上皮细胞、人鼻粘膜上皮细胞或人鼻咽上皮细胞。
利用所述气液界面暴露系统暴露细胞的方法，包括如下步骤：
S1.细胞气液界面适应性培养
对细胞进行复苏及传代培养，恢复细胞活性；然后将细胞经消化、重悬、计数，以5×104～1×105cells/well的密度接种于Transwell细胞培养小室，小室下层(培养板)和小室上层分别添加含有胎牛血清和抗生素的细胞培养基覆盖住细胞，更换新鲜培养基；培养至细胞融合度为80％；吸除小室上层培养基，将下层培养基替换成含有胎牛血清不含抗生素的细胞培养基，使Transwell小室的聚酯膜上的细胞既能与培养基接触又能与空气接触，继续培养12～24h，使细胞适应气液界面状态；
S2.生物悬液的制备
将微生物活化并培养至对数生长期，然后制备成密度为105～109CFU/mL的生物悬液；
S3.细胞暴露
检验所述气液界面暴露系统的气密性，将步骤S2制备的生物悬液置于雾化器中，并将步骤S1得到的细胞连同Transwell小室转移至暴露腔中，小室下层(暴露腔内)添加含有胎牛血清不含抗生素的细胞培养基，使Transwell小室的聚酯膜上的细胞即能与培养基接触又能与空气接触；以12～42L/min的气体流量对生物悬液进行雾化制备生物气溶胶，生物气溶胶稀释0.1～10倍、调整湿度为80％～100％后输送至细胞暴露单元；设置尾气处理模块气体流量为不大于1.5L/min，设置暴露流量为不大于10mL/min，暴露不大于24h；暴露完成后，将细胞转移至新的培养孔板，更换培养基孵育0～24h，收集细胞并进行毒理学指标评价。
优选地，步骤S1中，所述细胞为呼吸道上皮细胞。
优选地，步骤S1中，所述呼吸道上皮细胞为呼吸道上皮细胞的永生化细胞。永生化细胞系比原代细胞更为稳定。
进一步优选地，步骤S1中，所述呼吸道上皮细胞为人正常肺上皮细胞、人支气管上皮细胞、人鼻粘膜上皮细胞或人鼻咽上皮细胞。
优选的，步骤S1中，所述小室上层加入0.5mL细胞培养基，下层加入1mL细胞培养基。
优选地，步骤S2中，所述微生物为细菌或真菌。
优选地，步骤S2中，所述微生物为细菌。
优选地，步骤S2中，所述细菌为铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。
优选地，步骤S1、S2在无菌环境中进行，步骤S3中，雾化器、暴露腔在进行细胞暴露前经紫外照射30min灭菌。
优选地，步骤S1中，所述细胞培养基中含有10％的胎牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。
优选地，步骤S1和S3中，不含抗生素的细胞培养基含有10％的胎牛血清。
优选地，步骤S3中，所述呼吸道上皮细胞来自上呼吸道，生物气溶胶稀释0.1～10倍、调整湿度为80％～90％；所述呼吸道上皮细胞来自下呼吸道，生物气溶胶稀释0.1～10倍、调整湿度为90％～100％。
优选地，步骤S3中，设置过量气体流量为1.5L/min，避免气溶胶颗粒在管路中沉积。
优选地，步骤S3中，所述呼吸道上皮细胞来自上呼吸道，设置暴露流量为10mL/min；所述呼吸道上皮细胞来自下呼吸道，步骤S7中设置暴露流量为5mL/min。
优选地，步骤S3中，所述暴露的时间为0～10h。暴露时间过短，不足以反应暴露情况，暴露时间过长，气流的切应力会对细胞造成损伤。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的气液界面暴露系统中，将呼吸道上皮细胞接种于Transwell细胞培养小室，小室下层提供培养基维持活性，细胞以气液界面的形式暴露于大气气溶胶，能够更真实的模拟气溶胶在人体肺部的呼吸暴露情况，从而提高大气气溶胶呼吸暴露风险评估的准确性；
2.本发明的气液界面暴露系统通过生物气溶胶发生和传输单元可准确控制暴露气溶胶的组分、粒径分布、浓度、湿度等物理特性，可用于研究不同物理特性生物气溶胶的毒性效应；
3.本发明的气液界面暴露系统通过与生物气溶胶暴露腔并联的气溶胶检测仪，可对暴露生物气溶胶的物化性质进行实时监测分析，控制暴露气溶胶的稳定性，提升暴露体系的可利用率；
4.本发明提供的气液界面暴露系统组合紧凑，应用方法操作简单，暴露过程稳定可控，气溶胶性状可实时监测，为气溶胶的健康风险评估和致病机制研究提供了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统，图中箭头指向为气流流向。
图2为本发明实施例1中暴露模块和温控模块的结构，其中A为暴露腔、暴露模块、温控模块剖视图，B为暴露腔、温控模块立体图，图中箭头指向为气流流向。
图3为本发明实施例2中气液界面暴露模型对细胞进行暴露应用方法的流程图。
图4为本发明实施例3中不同浓度气溶胶暴露下细胞活性结果，con即对照组control。
图5为本发明实施例4中不同气溶胶浓度暴露下金黄色葡萄球菌对人支气管上皮细胞16HBE的黏附和侵袭丰度。
图6为本发明实施例5中不同浓度气溶胶暴露下人支气管上皮细胞的葡聚糖渗透率。
图7为本发明实施例6中不同发生流量与雾化的气溶胶的粒径和浓度关系。
图8为本发明对比例1中不同培养时间获得的细胞的葡聚糖渗透漏率的结果.
图9为本发明对比例2中不同暴露时间的细胞活性结果。
附图标记中：1.生物气溶胶发生单元，2.输送单元，3.细胞暴露单元，4.空气压缩机，5.高效空气过滤器一，6.质量流量控制器一，7.雾化器，8.缓冲瓶，9.高效空气过滤器二，10.质量流量控制器二，11.高效空气过滤器三，12.干燥管，13.气溶胶检测仪，14.暴露模块，15.温控模块，16.高效空气过滤器四，17.质量流量控制器三，18.抽气泵，19.尾气外排模块，141.暴露腔一，142.暴露腔二，143.暴露腔三，161.高效空气过滤器四一，162.高效空气过滤器四二，163.高效空气过滤器四三，164.高效空气过滤器四四，171.质量流量控制器三一，172.质量流量控制器三二，173.质量流量控制器三三，174.质量流量控制器三四。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统
一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统，如图1所示，图中箭头指向为气流流向；所述气液界面暴露系统包括生物气溶胶发生单元1、输送单元2和细胞暴露单元3；所述气溶胶发生单元由空气压缩机4、高效空气过滤器一5、质量流量控制器一6、雾化器7依次经聚四氟乙烯管和转接头串联组成；所述输送单元包括缓冲瓶8、高效空气过滤器二9、质量流量控制器二10和高效空气过滤器三11；所述细胞暴露单元包括干燥管12、气溶胶检测仪13、暴露模块14和尾气外排模块19；所述尾气外排模块19包括依次连接的高效空气过滤器四16、质量流量控制器三17和抽气泵18；
所述雾化器7一端与质量流量控制器一6相连，另一端与缓冲瓶8相连；质量流量控制器二10一端与高效空气过滤器二9相连，另一端与缓冲瓶8；高效空气过滤器三11与缓冲瓶8相连；干燥管12一端与缓冲瓶8相连，另一端与暴露模块14相连；干燥管12与暴露模块14之间还设置有气溶胶检测仪13，用于检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；暴露模块14、高效空气过滤器四16、质量流量控制器三17与抽气泵18依次串联；暴露模块14上设置有温控模块15，用于维持暴露模块的温度；暴露模块14包括三个暴露腔，暴露腔一141、暴露腔二142、暴露腔三143；所述高效空气过滤器四16包括四个，分别为高效空气过滤器四一161、高效空气过滤器四二162、高效空气过滤器四三163和高效空气过滤器四四164；所述质量流量控制器三17包括四个，分别为质量流量控制器三一171、质量流量控制器三二172、质量流量控制器三三173和质量流量控制器三四174；干燥管12通过分支管道与暴露腔一141、暴露腔二142、暴露腔三143相连，暴露腔一141与高效空气过滤器四一161相连，暴露腔二142与高效空气过滤器四二162相连，暴露腔三143与高效空气过滤器四三163相连；干燥管12通过主管道与高效空气过滤器四四164相连；高效空气过滤器四一161、四二162、四三163和四四164分别与质量流量控制器三一171、三二172、三三173和三四174相连；质量流量控制器三一171、三二172、三三173和三四174分别连接于主管道然后通过主管道与抽气泵18相连。
暴露模块14包括三个暴露腔，暴露腔一141、暴露腔二142、暴露腔三143，根据需要可以增加或减少暴露腔的数目，高效空气过滤器16和质量流量控制器17的个数也对应的增加或减少。暴露模块14可以包括三个或三个以上暴露腔，以便同时进行对照组、不同细胞类型或不同培养条件下气溶胶暴露对比。
生物气溶胶发生单元1生成的生物气溶胶经过输送单元2运输至细胞暴露单元3对细胞进行暴露，之后再利用尾气外排模块19将气溶胶净化后排出。所述尾气外排模块19还能控制大气气溶胶的暴露流量。
雾化器7产生的生物气溶胶可以通过缓冲瓶8和高效空气过滤器三11进行缓冲，降低产生的生物气溶胶的压力；雾化器7产生的生物气溶胶还可以通过高效空气过滤器二9和质量流量控制器二10进行稀释，从而控制气溶胶的浓度。
所述高效空气过滤器一5、高效空气过滤器二9、高效空气过滤器三11、高效空气过滤器四16均包括壳体和滤芯，可以捕集粒径在0.1μm以上的颗粒物，避免空气中颗粒的干扰。
所述质量流量控制器一6、质量流量控制器二10、质量流量控制器三17均为热传感式，其中质量流量控制器一6、质量流量控制器二10的量程为0～30L/min，质量流量控制器三四174的量程为0～1.5L/min；质量流量控制器三一171、三二172和三三173的量程为0～10mL/min。
所述雾化器7为空气压缩雾化器，压缩空气通过细小管口形成高速气流，产生的负压带动气溶胶悬液高速撞击到阻挡物上，飞溅形成气溶胶喷雾。
所述干燥管12带有湿度传感器，可实时监测并调控气溶胶气体的湿度。
所述温控模块包括两部分，分别分布在暴露模块的上方和下方，包括加热或制冷元件、温度传感器，用于控制密闭暴露腔温度维持在37℃左右。
所述气溶胶检测仪13用于对暴露气溶胶的粒径分布和浓度的监测。
暴露模块和温控模块的结构如图2所示，其中A为暴露腔、暴露模块、温控模块剖视图，B为暴露腔、温控模块立体图，图中箭头指向为气流流向。
如图2所述，暴露模块设置有6个暴露腔；待暴露的细胞置于暴露腔中Transwell小室的聚酯膜上，方便暴露后细胞的取出；细胞及聚酯膜浸没于细胞培养基中，气溶胶到达暴露腔后经过气液界面对细胞进行暴露。
所述暴露腔带有Transwell细胞培养小室支架，与Transwell小室适配，小室经聚酯膜或聚碳酸酯膜隔成上层和下层，暴露时小室下层添加新鲜培养基，上层为贴壁细胞。
实施例2气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露模型的应用方法
利用实施例1的气液界面暴露模型对细胞进行暴露，应用方法的流程图如图3所示。
首先，堵塞暴露模块的进气口，再打开抽气泵18抽气，检验模型的气密性，若流量计指示降至0，则视为不漏气，随后将准备好的生物气溶胶的生物悬液置于雾化器7中，并将用于毒性评估的细胞置于暴露腔，下层添加细胞对应培养基；然后打开空气压缩机1出气口，压缩空气以特定的流量对生物悬液进行雾化制备生物气溶胶，利用高效空气过滤器二9、质量流量控制器二10和高效空气过滤器三11以发生气流特定倍数的流量对生物气溶胶进行稀释，经过干燥管12调节生物气溶胶湿度，并输送至细胞暴露单元3。打开气溶胶检测仪13，检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；打开尾气外排模块19中的抽气泵18，设置暴露流量；另外，同时增设一组细胞暴露单元，暴露于洁净空气作为对照，暴露一定时间后，收集细胞并进行毒理学指标评价。
实施例3人肺上皮细胞气溶胶暴露后细胞活性测定
利用实施例1的气液界面暴露模型对人肺上皮细胞进行暴露。
1.细胞复苏及传代
制备含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，作为Beas-2B细胞培养基。
在37℃水浴中迅速解冻液氮中冻存的人肺上皮细胞Beas-2B，并转移至Beas-2B细胞培养基中，于37℃、5％CO2培养2～3d。培养完成后，弃去培养基，PBS清洗细胞3次，加入0.05％(v:v)的胰酶1mL于37℃消化细胞1min，再添加3mL Beas-2B细胞培养基终止消化，离心收集细胞，并加新的Beas-2B细胞培养基重悬细胞，并以1：3的比例传代培养2～3代，得到融合度达90％的处于对数生长期Beas-2B细胞。
2.细胞气液界面培养
将上述对数生长期Beas-2B细胞经消化、重悬和计数后，以5×104cells/well的密度接种于内径12mm Transwell细胞培养小室上层，向所述小室加入Beas-2B细胞培养基，上层加入0.5mL，下层添加1mL，置于37℃细胞培养箱中培养48h，至细胞融合度为80％，然后吸去上层培养基，下层培养基替换为1mL含10％胎牛血清不含抗生素的RPMI-1640培养基，使Transwell小室的聚酯膜上的细胞即能与培养基接触又能与空气接触，继续培养24h，使贴壁的Beas-2B细胞适应气液界面状态，得到用于毒性评估的Beas-2B细胞。
3.生物悬液的制备
挑取少量冻存的革兰氏阴性菌中铜绿假单胞菌于营养琼脂培养基平板上划线，37℃过夜培养后，挑取单菌落接种至营养肉汤培养基中，继续在37℃培养12h，得到处于对数生长期的菌液。离心收集菌体，PBS清洗后在无菌水中重悬制备菌悬液，调节菌悬液浓度，至酶标仪测得菌悬液OD600为0.1，然后梯度稀释，得到OD600分别为0.1、0.01和0.001的铜绿假单胞菌悬液，对应的菌密度分别为106、107、108CFU/mL，即生物悬液。
4.暴露模型准备
检验模型的气密性，将细菌悬液置于雾化器中，增设三组细胞暴露单元，并将上述用于毒性评估的Beas-2B细胞连同Transwell小室转移至暴露腔，下层添加5mL含10％胎牛血清不含抗生素的RPMI-1640培养基。Transwell小室的聚酯膜上的细胞即能与培养基接触又能与空气接触。
5.气溶胶暴露
打开空气压缩机出气口，压缩空气以12L/min的流量依次对铜绿假单胞菌悬液进行雾化，稀释气路以发生气流9倍的流量对生物气溶胶进行稀释，经过干燥管调节气溶胶湿度为95％，并输送至细胞暴露模块。打开气溶胶检测仪，检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；打开尾气外排模块中的抽气泵，同时打开对照组洁净干空气瓶，设置暴露流量为0.5mL/min，暴露6h，收集细胞并进行毒理学指标评价。相同条件暴露洁净空气作为对照组。
6.细胞凋亡测定
暴露结束后，将Transwell小室从暴露腔中取出，转移至干净无菌的12孔板，每孔加入200μL含体积百分数10％CCK-8的RPMI-1640培养基(不含胎牛血清)，在培养箱孵育3h。取100μL上层培养基转入96孔板中，以酶标仪测定450nm处吸光度OD。不含细胞，单纯的含10％CCK-8的RPMI-1640培养基作为空白组。按照以下公式计算细胞活性。
细胞活性＝(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)。
不同浓度气溶胶暴露下细胞活性结果如图4所示，con即对照组control。
图4显示，OD600为0.1、0.01和0.001的铜绿假单胞菌悬液发生稀释后得到的气溶胶中铜绿假单胞菌丰度分别为104、105、106CFU/m3，相比于对照组，细菌气溶胶的暴露导致了OD450的升高，表明104、105、106CFU/m3丰度的细菌气溶胶暴露造成了细菌活性损伤。
实施例4人支气管上皮细胞气溶胶暴露后粘附和侵袭的能力测定
利用实施例1的气液界面暴露模型对人支气管上皮细胞进行暴露。
1.细胞复苏及传代
制备含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基，作为16HBE细胞培养基。
人支气管上皮细胞16HBE复苏步骤同实施例3人肺上皮细胞Beas-2B步骤。
2.细胞气液界面培养
将上述完成复苏和传代的16HBE细胞经消化、重悬和计数后，以1×105cells/well的密度接种于内径12mm Transwell细胞培养小室上层，向所述小室加入16HBE细胞培养基，上层加入0.5mL，下层加入1mL，置于37℃细胞培养箱中培养24h，至细胞融合度为80％，然后吸去上层培养基，下层培养基替换为1mL含10％胎牛血清不含抗生素的DMEM培养基，继续培养24h，使16HBE细胞适应气液界面状态，得到用于毒性评估的16HBE细胞。
3.生物悬液的制备：
按照实施例3铜绿假单胞菌的制备方法制备密度为107、108CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液，即生物悬液。
4.暴露模型准备
同实施例3，区别下层添加5mL含10％胎牛血清不含抗生素的DMEM培养基。
5.气溶胶暴露
打开空气压缩机出气口，压缩空气以20L/min的流量对金黄色葡萄球菌悬液进行雾化，稀释气路以发生气流1倍的流量对生物气溶胶进行稀释，经过干燥管调节气溶胶湿度为85％，并输送至细胞暴露模块。打开气溶胶检测仪，检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；打开尾气外排模块中的抽气泵，同时打开对照组洁净干空气瓶，设置暴露流量为1mL/min，暴露3h，收集细胞并进行毒理学指标评价。
6.细菌粘附和侵袭能力的测定
粘附能力测定：暴露完成后，将Transwell小室从暴露腔中取出，转移至干净无菌的12孔板，PBS清洗细胞三次，0.1％SDS裂解液裂解细胞，收集裂解液，离心弃上清，PBS重悬后稀释涂布，并于37℃过夜培养后计数。
侵袭能力测定：暴露完成后，将Transwell小室从暴露腔中取出，转移至干净无菌的12孔板，PBS清洗细胞三次，每孔加入500μL含25μg/mL庆大霉素的DMEM培养基孵育1h后，0.1％SDS裂解液裂解细胞，收集裂解液，离心弃上清，PBS重悬后稀释涂布，并于37℃过夜培养后计数。
不同气溶胶浓度暴露下金黄色葡萄球菌对人支气管上皮细胞16HBE的黏附和侵袭丰度如图5所示，
图5显示，细菌密度为107、108CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液发生稀释后得到的气溶胶中细菌丰度分别为105、106CFU/m3，两组浓度暴露下，都观察到细菌的生长，表明105、106CFU/m3的金黄色葡萄球菌气溶胶暴露后均能成功粘附于细胞表面，或侵袭进入细胞。
实施例5人支气管上皮细胞气溶胶暴露后屏障功能的损伤测定
利用实施例1的气液界面暴露模型对人支气管上皮细胞进行暴露。
1.细胞复苏及传代
同实施例4。
2.细胞气液界面培养
同实施例4。
3.生物悬液的制备：
同实施例3的方法制备密度为107、108CFU/mL铜绿假单胞菌悬液，即生物悬液。
4.暴露模型准备
同实施例4。
5.气溶胶暴露
打开空气压缩机出气口，压缩空气以20L/min的流量对铜绿假单胞菌悬液进行雾化，稀释气路以发生气流9倍的流量对生物气溶胶进行稀释，经过干燥管调节气溶胶湿度为85％，并输送至细胞暴露模块。打开气溶胶检测仪，检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；打开尾气外排模块中的抽气泵，同时打开对照组洁净干空气瓶，设置暴露流量为1mL/min，暴露12h，收集细胞并进行毒理学指标评价。
6.上皮屏障功能损伤的测定
暴露完成后，将Transwell培养板上室从暴露单元中取出，上层培养基替换为含0.5mg/mL FITC标记的葡聚糖的无酚红的实施例4的16HBE细胞培养基，上层培养基替换为不含葡聚糖不含酚红的实施例4的16HBE细胞培养基，37℃、5％CO2培养90min，分别取100μL上层和100μL下层培养基检测荧光强度，检测激发波长488nm、发射波长525nm。按照以下公式计算葡聚糖渗透率。
Figure BDA0003810164400000131
膜面积为暴露单元上下层之间膜的面积。
不同浓度气溶胶暴露下人支气管上皮细胞的葡聚糖渗透率如图6所示，
图6显示，细菌气溶胶的暴露增加了细胞上皮屏障的渗透性，且暴露浓度越高对上皮屏障的损伤越大。
实施例6气溶胶发生流量的测定
1.方法
检验模型的气密性，将磷酸缓冲液置于雾化器中，打开空气压缩机出气口，压缩空气以12、20、27、34.5、42L/min的流量(发生流量)对缓冲液进行雾化，并通过气溶胶检测仪，检测生成气溶胶的浓度和粒径分布。
2.结果
不同发生流量与雾化的气溶胶的粒径和浓度关系如图7所示，图7结果显示，气溶胶的发生流量和雾化的气溶胶的浓度和粒径存在显著的相关性，发生流量越高，得到的气溶胶浓度越高，但气溶胶的粒径越低。
对于上呼吸道细胞暴露气溶胶粒径优选2.5～10μm，对于下呼吸道细胞暴露气溶胶粒径优选<2.5μm。气溶胶的尺寸改变也会影响气溶胶浓度，为更好的调节浓度，另外引入了稀释气路。
对比例1人肺上皮细胞Beas-2B细胞融合所需培养时间的测定
1.方法
将复苏后的人肺上皮细胞Beas-2B细胞经消化、重悬和计数后，以5×104cells/well的密度接种于Transwell细胞培养小室上层，向所述小室加入Beas-2B细胞培养基，上层0.5mL，下层1mL，每48h更换培养基，培养24～120h，并在24h、48h、72h、96h、120h收获细胞，按照实施例5的方法通过FITC标记的葡聚糖检测细胞单层的渗透性，葡聚糖渗透漏率。
按照实施例5相同的方法通过FITC标记的葡聚糖检测不同培养时间收获细胞的单层渗透性，以检验细胞融合所需要的培养时间。
2.结果
不同培养时间获得的细胞的葡聚糖渗透漏率的结果如图8所示，图8结果显示，培养的前72h细胞持续增殖，细胞的单层渗透性随着培养时间下降，在培养96h后，细胞的单层渗透性上升。说明细胞接种后72～96h形成融合单层，在细胞接种后72～96h进行暴露比较合适。
对比例2气溶胶暴露时间的测定
1.方法
检验模型的气密性，压缩空气以12L/min磷酸缓冲液进行雾化，并将培养好的的Beas-2B的融合细胞置于暴露腔，下层添加5mL含1％胎牛血清的RPMI-1640培养基(不含抗生素)，上层为贴壁的人肺上皮细胞Beas-2B细胞。打开尾气外排模块中的抽气泵，设置过量气体流量为1L/min，设置暴露流量为5mL/min，暴露0～18h，并检测细胞活性。通过洁净空气暴露并检测细胞活性，判断气流的切应力对细胞造成的损伤。细胞活性的测定参照实施例3。
2.结果
不同暴露时间的细胞活性结果如图9所示。
图9显示，在暴露12h后细胞活性下降，说明暴露时间不能过长，控制暴露时间小于12h比较合适。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种气溶胶对呼吸道上皮细胞暴露的气液界面暴露系统，其特征在于，包括生物气溶胶发生单元(1)、输送单元(2)和细胞暴露单元(3)；所述气溶胶发生单元由空气压缩机(4)、高效空气过滤器一(5)、质量流量控制器一(6)、雾化器(7)依次串联组成；所述输送单元包括缓冲瓶(8)、高效空气过滤器二(9)、质量流量控制器二(10)和高效空气过滤器三(11)；所述细胞暴露单元(3)包括干燥管(12)、气溶胶检测仪(13)和细胞处理模块，所述细胞处理模块包括暴露模块(14)和尾气外排模块(19)；所述尾气外排模块(19)包括依次连接的高效空气过滤器四(16)、质量流量控制器三(17)和抽气泵(18)；所述雾化器(7)一端与质量流量控制器一(6)相连，另一端与缓冲瓶(8)相连；质量流量控制器二(10)一端与高效空气过滤器二(9)相连，另一端与缓冲瓶(8)；高效空气过滤器三(11)与缓冲瓶(8)相连；干燥管(12)一端与缓冲瓶(8)相连，另一端与暴露模块(14)相连；干燥管(12)与暴露模块(14)之间还设置有气溶胶检测仪(13)，用于检测暴露气溶胶的浓度和粒径分布；暴露模块(14)、高效空气过滤器四(16)、质量流量控制器三(17)与抽气泵(18)依次串联；暴露模块(14)上设置有温控模块(15)，用于维持暴露模块的温度。
2.根据权利要求1所述气液界面暴露系统，其特征在于，所述暴露模块(14)包括一个或多个暴露腔；所述高效空气过滤器四(16)和质量流量控制器三(17)的数目比暴露腔个数多一个；每个暴露腔分别串联一个高效空气过滤器四(16)和质量流量控制器三(17)。
3.根据权利要求2所述气液界面暴露系统，其特征在于，所述暴露模块包括3个或6个暴露腔。
4.根据权利要求2所述气液界面暴露系统，其特征在于，所述暴露模块(14)包括三个暴露腔，暴露腔一(141)、暴露腔二(142)、暴露腔三(143)；所述高效空气过滤器四(16)包括四个，分别为高效空气过滤器四一(161)、高效空气过滤器四二(162)、高效空气过滤器四三(163)和高效空气过滤器四四(164)；所述质量流量控制器三(17)包括四个，分别为质量流量控制器三一(171)、质量流量控制器三二(172)、质量流量控制器三三(173)和质量流量控制器三四(174)；干燥管(12)通过分支管道与暴露腔一(141)、暴露腔二(142)、暴露腔三(143)相连，暴露腔一(141)与高效空气过滤器四一(161)相连，暴露腔二(142)与高效空气过滤器四二(162)相连，暴露腔三(143)与高效空气过滤器四三(163)相连；干燥管(12)通过主管道与高效空气过滤器四四(164)相连；高效空气过滤器四一(161)、四二(162)、四三(163)和四四(164)分别与质量流量控制器三一(171)、三二(172)、三三(173)和三四(174)相连；质量流量控制器三一(171)、三二(172)、三三(173)和三四(174)分别连接于主管道然后通过主管道与抽气泵(18)相连。
5.权利要求1～4任一所述气液界面暴露系统在气液界面暴露细胞的研究中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述应用中的细胞为呼吸道上皮细胞。
7.利用权利要求1～4任一所述气液界面暴露系统暴露细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.细胞气液界面适应性培养
对细胞进行复苏及传代培养，恢复细胞活性；然后将细胞经消化、重悬、计数，以5×104～1×105cells/well的密度接种于Transwell细胞培养小室，小室下层和小室上层分别添加含有胎牛血清和抗生素的细胞培养基，覆盖住细胞，更换新鲜培养基；培养至细胞融合度为80％；吸除小室上层培养基，将下层培养基替换成含有胎牛血清不含抗生素的细胞培养基，使Transwell小室的聚酯膜上的细胞既能与培养基接触又能与空气接触，继续培养12～24h，使细胞适应气液界面状态；
S2.生物悬液的制备
将微生物活化并培养至对数生长期，然后制备成密度为105～109CFU/mL的生物悬液；
S3.细胞暴露
检验权利要求1～4任一所述气液界面暴露系统的气密性，将步骤S2制备的生物悬液置于雾化器中，并将步骤S1得到的细胞连同Transwell小室转移至暴露腔中，小室下层添加含有胎牛血清不含抗生素的细胞培养基，使Transwell小室的聚酯膜上的细胞即能与培养基接触又能与空气接触；以12～42L/min的气体流量对生物悬液进行雾化制备生物气溶胶，生物气溶胶稀释0.1～10倍、调整湿度为80％～100％后输送至细胞暴露单元；设置尾气处理模块气体流量为不大于1.5L/min，设置暴露流量为不大于10mL/min，暴露不大于24h；暴露完成后，将细胞转移至新的培养孔板，更换培养基孵育0～24h，收集细胞并进行毒理学指标评价。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞为呼吸道上皮细胞。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述呼吸道上皮细胞为呼吸道上皮细胞的永生化细胞。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述含有胎牛血清和抗生素的细胞培养基中含有10％的胎牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素；步骤S1和S3中，含有胎牛血清不含抗生素的细胞培养基含有10％的胎牛血清。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116272455A (zh) * 2023-05-24 2023-06-23 北京市农林科学院信息技术研究中心 生物气溶胶发生系统
CN116272455B (zh) * 2023-05-24 2023-08-04 北京市农林科学院信息技术研究中心 生物气溶胶发生系统

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