TW202142864A - 生物氣溶膠檢測裝置 - Google Patents

Abstract

一種生物氣溶膠檢測裝置，包含一收集模組、一檢測模組、一電源；該收集模組包含一油水容器，內裝油膜/磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate-buffered saline，PBS)，一抽氣風扇，一弧形漸縮氣道，一小型泵浦，一蠕動泵浦。該抽氣風扇進氣口設置一防塵罩與過濾器，將吸入空氣初步過濾，並經由該氣道產生衝擊力將空氣中的生物氣溶膠打入油水容器的油膜上方，讓生物氣溶膠吸附於油膜表面，然後定時透過小型泵浦將壓力風打在油膜表面上，使油膜翻轉，在翻轉過程，被測生物氣溶膠會翻轉至油膜下，進入PBS中。檢測模組包含一感測晶片，一訊號處理模組、微控制器及無線通訊模組，或顯示裝置。該感測晶片上固著至少一專一性的適體或抗體，以專一性檢測進入PBS中特定的生物氣溶膠。進入PBS中的待測物，經由循環流道的設計，配合蠕動泵浦的驅動，讓油膜下的PBS及待測物都會循環流經感測晶片，使待測物有效接觸專一性的適體或抗體，達成高比率的捕捉與檢測。該生物氣溶膠包含病毒、病菌、真菌、花粉等。

Description

生物氣溶膠檢測裝置

本發明是有關一種生物氣溶膠檢測裝置，特別是一種能夠同時執行多種生物氣溶膠收集與就地感測之生物氣溶膠檢測裝置。

已知有幾種病原體通過人與人之間的空氣傳播，包括病毒如流感(flu)、冠狀病毒(coronavirus)例如SARS、MERS、COVID-19、水痘(chicken pox)和羅露拉菌rubeola(麻疹)、諾羅病毒(Norovirus)、或杯狀病毒(Calicivirus)、以及細菌如結核分枝桿菌(tuberculosis)、博德特氏菌百日咳(whooping cough)、和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(如肺炎)。這些空氣傳播的病原體可以在固體顆粒上傳播，如灰塵和皮膚薄片，或通過呼吸，說話，咳嗽，打噴嚏，嘔吐等產生的氣溶膠霧滴。

還有從感染者以外的其他來源傳播的空氣傳播病原體，如細菌和真菌孢子(fungi)，鳥糞中的細菌或空調等基於液體的系統。還發現沖洗廁所產生含病原體的氣溶膠。當人類暴露於處在此類病原體的環境中時，存在空氣傳播感染的風險。此外，某些季節中，在空氣傳播的花粉也會引發某些人的過敏反應。

用於生物氣溶膠的三種最常見的有效採樣方法是過濾(filters)，衝擊器(impactors)和撞擊器(impingers)。Impingers是基於液體收集的採樣器，依賴於5或20mL的工作體積，而過濾器和衝擊器是基於乾燥採集的採樣器，依賴於洗 脫步驟從各自的固體支持物中提取收集的病毒。該洗脫可導致最終提取的樣品體積大，通常為幾毫升。如果在採樣的空氣體積中僅存在少量病毒顆粒，則這些大體積產生巨大的稀釋，使得這些方法不適合於低檢測限(LoD)測量。此外，從撞擊器，過濾器或衝擊器到生物感測器的液體體積的處理和處理的集成和自動化需要大量的系統複雜性，不適合就地照護點(PoC)應用。

另外，也有些應用使用BioSamplers(SKC Inc.)搭配220伏SKC BioLite取樣泵(SKC Inc.)進行生物氣溶膠取樣。簡而言之，將採樣器連接到在線蒸汽疏水閥(SKC Inc.)以保護泵免受潮濕，並且允許泵運行5分鐘暖身，然後採樣。用含有0.5%(w/v)牛血清白蛋白級分V(BSA)粉末的15ml無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)填充SKC BioSampler，並置於離地面1-1.5m處。每個採樣泵以8/1/min的流速運行30分鐘，允許每個站點採樣約240升空氣。在採樣期結束時，關閉泵，將BioSampler斷開，並將樣品培養基從SKC Bio-Sampler收集容器無菌轉移到無菌的15ml錐形管中。送去進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。所有採樣器在每個採樣日結束時用高壓滅菌器消毒。

此外市面上也有一些系統包括一個定制的靜電沉澱(ESP)為基礎的生物氣溶膠採樣器，與下游定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析相結合。將霧化的病毒直接取樣到液體體積為150μL的小型化收集器中，這構成了隨後的生物測定的簡單且直接的界面。與其他基於液體的生物氣溶膠採樣器相比，該方法將樣品稀釋減少了至少一個數量級。

上面介紹的生物氣溶膠的常用取樣方法依賴於捕獲顆粒的實驗室分析。目前沒有已建立的方法在採樣點提供敏感的檢測，識別和量化。然而，在靠近病人的就地照護點(PoC)或在醫療保健和其他設施中進行空氣監測時，敏感 和直接檢測空氣傳播病原體可能有助於快速診斷，疾病擴散和預防爆發，以及清洗受污染的設施後，達成立即性的生物氣溶膠控制。

為解決上述生物氣溶膠收集與就地感測分開的事實，就地感測的裝置，似乎可以將生物感測器結合於生物氣溶膠收集器的後端，來達到POC的檢測目標。但是，現在的多功能工具例如Lab on a chip(LoC)生物感測器僅適用於液體樣品。為了讓檢測和分析空氣傳播顆粒(如生物氣溶膠)有相同的多樣可能性，必須開發兼容空氣取樣和空氣-液體界接技術。另外，取樣後能連接可以立即進行在地檢測的晶片，需要精準與實時兼顧。為了解決空氣取樣和基於液體的感測技術的不兼容問題，跨學科方法有其必要，本發明即在於解決此問題。

本發明目的為設計一個生物氣溶膠感測系統，包含一生物氣溶膠純化收集模組、一感測晶片、一讀取電路、一電源。

更具體的說，本發明目的為設計一種生物氣溶膠檢測裝置，包含一收集模組、一檢測模組、一電源；該收集模組包含一油水容器，內裝油膜/PBS，一抽氣風扇(具有疏水性的表面)，一弧形漸縮氣道，一小型泵浦，一蠕動泵浦。該抽氣風扇進氣口設置一防塵罩與過濾器，將吸入空氣初步過濾，並經由該氣道產生衝擊力將空氣中的生物氣溶膠打入油水容器的油膜上方，讓生物氣溶膠吸附於油膜表面，然後定時透過小型泵浦將壓力風打在油膜表面上，使油膜翻轉，在翻轉過程，被測生物氣溶膠會翻轉至油膜下，進入PBS中。檢測模組包含一感測晶片，一訊號處理模組、微控制器及無線通訊模組，或顯示裝置。該感測晶片上固著至少一專一性的適體或抗體，以專一性檢測進入PBS中特定的生物氣溶 膠。進入PBS中的待測物，經由特殊的流道設計，配合蠕動泵浦的驅動，讓油膜下的PBS及待測物都會循環流經感測晶片，使待測物有效接觸專一性的適體或抗體，達成接近百分百的捕捉與檢測。該生物氣溶膠包含病毒與病菌、真菌、花粉至少其中之一。

更具體的說，本發明的目的，乃是提出了一種生物氣溶膠檢測的方法，包含以下步驟：步驟一、過濾，將通過的待測空氣去除非目標生物氣溶膠；步驟二、抽氣，步驟三、捕捉收集，將生物氣溶膠衝擊至油膜/PBS，氣溶膠容易附著油膜，或是穿越油膜，直接進入PBS中；步驟四、氣溶膠轉水溶膠，利用漸縮流道產生衝擊力，或是小型幫浦吹開油膜翻轉油膜上方捕捉的氣溶膠至PBS中，變成水溶膠；步驟五、濃縮質傳，利用循環流道的設計，將PBS內的水溶膠全數流動到感測晶片與晶片上的探測分子捕捉結合；步驟六、檢測，利用感測晶片上的探測分子捕捉結合，產生的訊號改變，進行目標生物氣溶膠的濃度偵測。

更具體的說，本發明的目的，乃是提出了一種檢測空氣傳播病原體的技術，用於空氣監測和基於呼吸的診斷。更具體地說，本發明的目標是改進能夠在就地照護點(PoC)設置中進行檢測的方案和設備。這些技術能夠在自動PoC設備中實現最佳應用，並且這些設備既小巧且易於使用。此外，本發明的裝置易於將空氣樣品與實驗室晶片(LoC)生物感測器連接。關於LoC生物感測器連接，本發明優選的實施方式是將病原體(病毒、病菌、真菌等)直接取樣到液體溶液中。這有三個主要原因：1)大多數已建立的生物分析技術是基於液體的檢測方案(細胞培養，基於抗體的檢測，核酸檢測等)；2)已經證明，取樣到液體中可以比收集在乾燥的固體表面上更好地保持病毒、病菌的完整性；3)並且收集到液體中允許與包含合適的生物測定和生物感測器的一次性LoC介接，使得能夠在PoC設置 下檢測病毒、病菌顆粒。此外，需要增加靈敏度來檢測氣溶膠中存在的低病毒、病菌載量。因此，必須解決PoC方案的低檢測限(limit of detection,LoD)。

本發明通過考慮以下參數中的一個或組合可以實現低LoD：生物測定的靈敏度增加，裝置的採樣效率提高，裝置的樣品回收增加，採樣時間增加和/或收集體積減小。後者使病毒稀釋成不必要的大液體體積，產生高濃度的回收病毒，因此在給定生物感測器LoD下，有助於降低系統LoD。實際上，顯示高收集效率的採樣裝置可能初看起來很重要，但如果內部產生的樣品稀釋度相對大得多，則在採樣持續時間或降低檢測限方面不會比效率較低的裝置更有用。基於之前的考慮，本發明的目標是設備設計不僅適用於標準的成熟生物測定，而且還可以最大限度地減少採樣病毒的稀釋和內部損失，同時保持足夠高的物理採樣效率。

本發明裝置可同時量測多種氣溶膠，方法是讓實驗室晶片(LoC)生物感測器可以有多組感測模組，例如多組感測電極的實施例，每一組感測電極包含工作電極(金)、反電極(金)，參考電極(Ag/AgCl)；工作電極可以修飾對目標物具有專一性的探測分子例如DNA適體或抗體，目標物包括病毒如流感(flu)、冠狀病毒(coronavirus)例如SARS、MERS、COVID-19，水痘(chicken pox)和羅露拉菌rubeola(麻疹)、諾羅病毒(Norovirus)、或杯狀病毒(Calicivirus)、以及細菌如結核分枝桿菌(tuberculosis)、博德特氏菌百日咳(whooping cough)、和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(如肺炎)等，真菌孢子(fungi)，花粉等。當金電極阻抗元件之核酸適體分子或抗體、或醣分子與病原體如病毒或病菌結合，通過電性或電化阻抗的變化量即可偵測環境中病原體的濃度，再結合通訊模組，組合成可攜式的病原體偵測模組，透過通訊模組，將訊息發送，以利進行通知或警報。

更具體的說，所述實驗室晶片(LoC)生物感測器可以利用印刷電路板(PCB)，或玻璃基板，或矽晶圓做為感測器基板，或是微機電製程將病毒或病菌感測器尺寸縮小，並且製造時，可大量生產，除降低成本外，也可以大量佈置於監控環境，隨時監控環境的汙染程度。因模組尺寸縮小，及搭配通訊模組，未來更可能應用於穿戴裝置上，讓攜帶及使用更加便利。

1:生物氣溶膠檢測裝置

5:環境空氣

10:過濾單元

12:抽氣風扇

13:油膜/PBS容器

14:感測晶片

16:訊號讀取模組

17:微控制器

18:無線通訊模組

19:電源供應模組

24:小型泵浦

27:蠕動泵浦

28:底座

29:上蓋

31:過濾單元

33:油膜

35:PBS

51:病毒

53:探測分子

55:循環水路

57:水流方向

61:工作電極

63:反電極

65:參考電極

[第1圖]係本發明生物氣溶膠檢測模組之功能方塊圖。

[第2A圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之立體結構示意圖(未含上蓋)。

[第2B圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之立體結構示意圖(含上蓋)。

[第3圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之進氣與出氣的氣流方向示意圖。

[第4A圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之進氣風扇、小型泵浦、蠕動泵浦配置圖。

[第4B圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之第4A圖的1/4剖面圖。

[第4C圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之小型泵浦作動氣流方向示意圖。

[第5A圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之蠕動泵浦作動水流方向示意圖。

[第5B圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之蠕動泵浦作動水流方向示意圖。

[第5C圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之蠕動泵浦未作動之待測生物氣溶膠分佈示意圖。

[第5D圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之蠕動泵浦作動之待測生物氣溶膠分佈示意圖。

[第6圖]係本發明生物氣溶膠檢測裝置之感測晶片結構示意圖。

有關於本發明其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。本發明之生物氣溶膠檢測模組1主要須達到三個目標，如第1圖與第2A/2B圖與第3圖所示，第一、在一般環境下，可能含有生物氣溶膠的環境空氣5藉由抽氣風扇12被抽入經過第一過濾方式10將被測生物氣溶膠純化，被測生物氣溶膠不會受到過濾方式影響其表面生化特性。第二、透過弧形漸縮氣道的設計，流速與壓力的參數調整，產生衝擊力將空氣中的生物氣溶膠打入油膜/PBS容器13的油膜上方，讓生物氣溶膠吸附於油膜表面，然後定時透過小型泵浦24將壓力風打在油膜表面上，使油膜翻轉，在翻轉過程，待測生物氣溶膠會翻轉至油膜下，進入PBS中；第三、進入PBS中的待測生物氣溶膠，經由特殊的流道設計，配合蠕動泵浦27的驅動，讓油膜下的PBS及待測生物氣溶膠都會循環流經感測晶片14，使待測生物氣溶膠有效接觸專一性的適體或抗體，達成接近百分百的捕捉與檢測。

第一道過濾10的方式較佳實施例分別為兩層，第一層為過濾空氣中較大的灰塵顆粒，大顆粒的過濾物為一般肉眼可見之灰塵、沙粒其大小約為數百微米以上的顆粒，使用一般市售的濾棉進行第一層過濾，第二層過濾為過濾空氣中的微細顆粒，微細顆粒為粉塵、塵蟎或花粉等數微米至數十微米大小的顆粒，若以受檢對象為病菌，其尺寸約為1-2um；或流感病毒，其尺寸約為80-120nm，為達到檢測的精確性，方法就是採用適合的過濾裝置，由於本發明方向為捕捉空 氣中的病菌或流感病毒，然而病菌或流感病毒在空氣中可能不伴隨著水珠，因此必須在晶片表面上提供乾燥轉換成溼潤的機制，以利病菌或病毒透過該機制進而加速病菌或流感病毒與感測晶片表面的適體結合，如第1圖所示，本發明使用一抽氣模組、二道過濾裝置、檢測晶片、訊號讀取模組進行生物氣溶膠的感測。

如第3圖與第4A,4B,4C圖所示，本發明主要利用抽氣風扇11將環境空氣產生強制對流，使環境空氣更有效率地進入此檢測裝置，空氣進入設計風道後會接觸油膜，其大部分微生物或病毒會在此沾附於油膜表面，為使油膜表面微生物或病毒穿過油膜與PBS接觸，油膜上方需有強正壓吹下，使油膜進行翻轉，如第4A,4B,4C圖所示，此處利用小型泵浦(small pump)24將強正壓從上方進氣使得油膜可以進行翻轉，此處使用油膜的目的是要讓PBS長時間處於開放空間中，不會揮發而減少其容積，進而影響待測目標的檢測精準度，油膜較佳的實施例為各類的礦物油、沙拉油，或其他不會殺死生物氣溶膠的油，也不會與PBS或其添加物，如赤血鹽/黃血鹽，或其他氧化還原離子(redox)反應，可以維持數個月不會有太多揮發。這個創新的方法，可以免除自動給水裝置補充PBS於容器內，使油膜/PBS的厚度維持在固定的容積以內，同時確保PBS或其添加物的濃度維持接近恆定。油膜的厚度設計在0.1mm到3mm，較佳的範圍為0.5-1mm。油膜的厚度要足夠，才能讓吹開油膜進行翻轉完畢，快速(例如0.5秒到5秒內)恢復油膜的完整覆蓋PBS。

絕大多數有害於人類或動物的病毒或病菌等病原體，為親水性，所以收集到油膜上，經過吹氣到油膜上，造成油膜翻轉，讓病原體接觸PBS，病原體就會親水進入PBS內，達到有效收集空氣中病原體進入PBS內的功效。

在某些實施例中，小型泵浦(small pump)將強正壓從上方進氣使得油 膜可以進行翻轉的功效，也直接由抽氣風扇來取代，其方法就是抽氣風扇可一大段時間工作於慢速的抽氣收集氣溶膠於油膜上，另一段時間工作於高速的抽氣，產生強正壓同時也將油膜進行翻轉的功效。

由於空氣中的有害生物氣溶膠相對濃度不高，因此傳統檢測的方法，三種最常見的有效採樣方法是過濾，衝擊器和撞擊器，就是增加收集的機會，並且一旦收集到就加以固定，本發明利用油膜來收集，該油膜對於目標物具有吸附作用，但同時也可能將穿過第一道過濾的雜質吸附。因此，當這些目標物與雜質都被翻轉進入油膜下的PBS內，目標生物氣溶膠翻轉至PBS後，利用蠕動泵27加上封閉循環的水流道55，如第4A,4B,4C圖與第5A,5B圖所示，使目標生物氣溶膠不斷在水流道57中循環，每一次流經感測晶片14就有機會被工作電極上的DNA適體或抗體、或醣分子等探測分子53捕捉，如第5C,5D圖所示，流速的調整適當，可以讓PBS流動，但不會讓已經跟專一性適體或抗體等探針分子結合的目標生物氣溶膠脫離。如此一來，基本上PBS內的目標生物氣溶膠最終都會與工作電極上的DNA適體專一性的結合，因此透過讀取電路的訊號可以定量得知PBS中的目標生物氣溶膠的濃度，進而推算空氣中的生物氣溶膠濃度。

更具體而言，如第5C圖所示，目標生物氣溶膠例如病毒51非常小，因為擴散的運動方式，屬於隨機行動，很難有機會移動到工作電極的探測分子53附近，並與該探測分子53結合，也就是濃縮質傳乃是必要的手段來提昇偵測的靈敏度，如第5D圖所示，給予溶液很小的循環流動速度，讓病毒51的移動成為有方向的移動，特別是垂直朝向工作電極，並且讓流速很小，或是流動一段時間，靜止一段時間，給予穩定結合的機會，也同時進行訊號量測與處理。

因此本發明無需上面介紹的生物氣溶膠的常用取樣方法，必須依賴 於捕獲顆粒的實驗室分析。本發明可以有效達成直接對採樣點提供敏感的檢測，識別和量化。

就感測晶片量測的實施例，可以選用各種常見的量測方法，例如光學(Optical)包含表面等離振子法(surface plasmon resonance,SPR)，比色(colorimetric)法，化學發光法(chemiluminescence,CL)，熒光法(fluorescence)，表面增強拉曼散射法(surface-enhanced Raman scattering,SERS)和干涉法(interferometry)。

感測晶片量測的實施例也可採用電學(Electrical)法，當目標物與抗體或適體之間的結合引起或改變電信號時，即可偵測目標物的濃度。根據其檢測機理可分為電化學法，或壓電換能器法，或場效電晶體(FET)法。也可使用奈米孔(nanopore)，(參考Niedzwiecki,D.J.,Iyer,R.,Borer,P.N.,and Movileanu,L.(2013).Sampling a biomarker of the human immunodeficiency virus across a synthetic nanopore.ACS Nano 7,3341-3350.)，其中電化學法所述訊號處理單元主要選自電化學感測電路、安培法、方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)、差式脈波伏安法(Differential Pulse Voltammetry,DPV)、計時安培法(chronoamperometry)、間歇脈衝安培法(intermittent pulse amperometry,IPA)、快速掃描循環伏安法(fast-scan cyclic voltammogram,FSCV)、電化學阻抗頻譜法(Electrochemical Impedance Spectrum,EIS)或其組合。

對於上述類型的感測晶片，某些實施例可以在感測電極上方修飾添加使用奈米材料來支持用於捕獲目標物的適體或抗體，並且有些奈米材料還參與信號轉換，這樣通常可增加感測器的靈敏度。這些奈米材料包含奈米磁珠、奈米金、碳管、石墨烯、ZnO等。這些奈米材料進一步結合硫氨酸(thionine,THI)或 普魯士藍(Prussian Blue,PB)，以增強電化學檢測時的氧化還原反應。

本發明特別以使用電化阻抗頻譜法(electro impedance EIS)實施例來說明，該感測晶片可由金工作電極，溶液PBS添加赤血鹽/黃血鹽5mM或其他氧化還原離子，例如六氨合釕(II)/(III)(Hexaammineruthenium(II)/(III))，可以延長期使用與保存時間。採用法拉第電流量測方法，以確保其靈敏度可達到0.1pg/mL等級甚至更好的檢測限(LOD)。

在某些實施例中也可以使用電化阻抗頻譜法(electro impedance EIS)，但使用非法拉第的量測方法，也就是讓金電極成為梳狀交叉結構，正負電極之間的間距為10-50微米。則病菌與病毒的濃度與阻抗變化成一正比。

就飛沫傳染的病毒與病菌的結構而言，其相關組成的蛋白質，都可能出現於受病毒或病菌感染的宿主身上，並且可能會出現於宿主的飛沫中，因此使用多合一的感測器，可以增加感測的靈敏度與精準度。例如針對冠狀病毒，如SARS，SARS-COV-2，MERS等，其病毒結構的蛋白質包含穗狀糖蛋白(Spike glycoprotein)，包膜蛋白(Envelope protein)，跨膜糖蛋白(TransMembrane glycoprotein)，核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein)等，因此在多合一的感測器晶片的工作電極上可佈植固定的探測分子，並選自針對穗狀糖蛋白(Spike glycoprotein)，包膜蛋白(Envelope protein)，跨膜糖蛋白(TransMembrane glycoprotein)，核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein)，的抗體或適體，或是針對ssRNA的核苷酸分子。其中，例如針對穗狀糖蛋白(Spike glycoprotein)的抗體，可以是IgA,IgM,IgG其中一者，或IgG，IgM兩者或IgA,IgG兩者，或是IgA,IgM,IgG三者。

本發明的裝置可以推算空氣目標生物氣溶膠的濃度Ct

Ct=(M/V)/E

其中，E=CR1 X CR2 x CR3生物氣溶膠感測系統捕捉與收集效率

捕捉率Capture Ratio的計算包含：1.空氣雜質過濾捕捉率CR1；2.衝擊式油膜與翻轉油膜進入PBS的捕捉率CR2；3.循環流動或PWM擾動，捕捉率CR3；目標物收集質量M=C x Vpbs(ng)；PBS容積Vpbs(mL)；感測晶片感測到目標物的濃度C(ng/mL)；收集氣體容積V=Q x T；抽氣幫浦流量Q(L/min)；抽氣時間T(min)。

本發明在偵測到病原體後，更換相關耗材的步驟如下：

(1)去除抽氣風扇前的過濾紙

(2)去除感測晶片

(3)去除PBS儲槽，PBS/油膜等模組。

(4)消毒：將剩餘的模組與裝備，使用酒精擦拭或噴塗，或使用紫外光，進行照射，以殺死殘留的病原體，紫外光的殺病原體功效，參考“Far-UVC light：A new tool to control the spread of airborne-mediated microbial diseases”Scientific RePortS｜(2018)8：2752｜DOI：10.1038/s41598-018-21058-w

(5)更換新的PBS儲槽，PBS/油膜等模組

(6)更換新的感測晶片。

(7)裝上新的過濾紙於抽氣風扇前。

實施例1--流感病毒的偵測

人類的許多呼吸道病毒來源於動物。例如，現在有八種副粘病毒(paramyxoviruses)，四種冠狀病毒和四種正粘病毒(orthomxoviruses)引起人類經常性流行，但一度限於其他宿主。在過去的十年中，同一病毒家族的幾個成員已經 跳過了從動物到人類的物種屏障。幸運的是，這些病毒尚未在人類中建立，因為它們缺乏人與人之間持續傳播的能力。然而，多次暴發顯示我們對病毒可傳播的原因缺乏了解。部分原因是流感病毒人畜共患病和流行病發生頻率相對較高，流感研究界已開始調查通過氣溶膠或哺乳動物呼吸道飛沫驅動病毒傳播的病毒基因和生物學特性。在這裡，我們總結了最近關於H5，H7和H9亞型人畜共患流感病毒以及H1，H2和H3亞型流感病毒空中傳播所需基因和表型特徵的發現。

流感偵測主要是以Hemoglutin抗原為主，所以製造上可使用H1-H16的Aptamer來製作感測晶片，基本只要每種H型抗原單獨製作，或六合一，只要生產三種型式即可涵蓋所有流感病毒的種類與變異組合。如第6圖所示，為二合一感測晶片，包含兩個工作電極61，兩個反電極63，共用一個參考電極65，設置二種不同H型抗原的適體，例如針對H1，和H3亞型流感病毒；或是三合一感測晶片，設置三種不同H型抗原的適體，例如H1，H2和H3亞型流感病毒；或是H5，H7和H9亞型人畜共患流感病毒。或是在四合一感測晶片H1，H3，H5，H9；或是在六合一感測晶片，設置六種不同H型抗原的適體，例如H1，H2和H3亞型流感病毒、H5，H7和H9亞型人畜共患流感病毒。

將感測晶片的工作電極通過在0.5M H₂SO₄中以0.1V/s的速度在-0.2和+1.2V之間循環電勢對金工作電極進行電化學處理，直到獲得可再現的循環伏安圖。隨後在100μL磷酸鹽緩衝液(PBS：10mM磷酸鹽緩衝液，5mMMgCl₂)中加入0.5μM具有低聚乙二醇間隔基的硫醇化適體探針(HS-(CH₂CH₂O)₁₈-GGACCAGTTGTCTTTCGGTCTCTACCCCAGCCCGT)，pH 7.4在95℃下孵育10分鐘，然後冷卻至室溫。然後，將HS-A20S溶液與1μL and tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)儲備溶液(100mM)混合。將混合 物保持1小時以還原二硫醇鍵。然後將乾淨的金電極浸入上述溶液中，並在室溫下保持12小時。電極用PBS漂洗，浸入MCH水溶液(1mM)中4h。使用前，將功能化電極用PBS徹底沖洗3次。

所有電化學測量均在室溫下在EIS訊號讀取電路上進行，使用由適體修飾的金電極作為工作電極(WE)，Ag/AgCl參考電極(RE)，以及金電極(CE)作為對電極。將適體功能化的電極與病毒樣品(H1N1，B和H7N9)在含有1M NaCl/5mM K₃Fe(CN)₆/5mM K₄Fe(CN)₆的PB溶液中於室溫下孵育30分鐘後，然後以0.03Hz至200kHz的頻率範圍內的10mV振幅收集EIS。

實施例2--新冠病毒SARS-CoV-2免疫感測器

SARS-CoV-2的結構；由刺突蛋白組成；它包括兩個區域S1和S2，其中S1用於宿主細胞受體結合，S2用於膜融合。刺突蛋白是用抗體和疫苗中和的典型靶標。據報導，SARS-CoV-2可以感染人類呼吸道上皮細胞的速度是以前的冠狀病毒株的100-1000倍，並且可以通過與人類ACE2受體相互作用來感染。

核衣殼蛋白是SARS-CoV-2中含量最豐富的蛋白。N蛋白是一種高度免疫原性的磷蛋白，很少發生變化。SARS-CoV-2的N蛋白通常在診斷分析中用作標記。

核衣殼蛋白是SARS-CoV-2中含量最豐富的蛋白。N蛋白是一種高度免疫原性的磷蛋白，很少發生變化。SARS-CoV-2的N蛋白通常在診斷分析中用作標記。

儘管IgG抗體可確認持續存在，甚至過去的感染，但IgA抗體卻被描述為急性呼吸道感染的早期標誌物。在最近的一項研究中(Okba等人，doi：10.1101/2020.03.18.20038059；2020年3月)，證實了特異性IgA檢測對急性SARS-CoV-2感 染的早期診斷具有附加價值。ELISA的良好敏感性和特異性也已被證明。SARS-CoV-2 ELISA中使用的抗原(IgA和IgG)，即刺突蛋白S1域，對SARS-CoV-2抗體的血清學檢測比對保守性較高的N蛋白-或全長S蛋白更具特異性。

通過將金電極(Au)在含有1mM 16 MHDA的乙醇溶液中浸泡24小時來形成MHDA的自組裝單層(SAM)。SAM形成後，在5mM EDC，15mM NHS和PBS溶液的混合物中於室溫下處理Au/MHDA電極20分鐘，以活化MHDA的羧酸基團。隨後，通過將修飾的電極在含有100μg/mL儲備液的0.1M PBS溶液(pH 7.4)中於37℃孵育約1小時，將COVID-19的抗體IgG與IgM共價固定在Au/MHA電極上。

所有電化學測量均在室溫下在EIS訊號讀取電路上進行，使用由適體修飾的金電極作為工作電極(WE)，Ag/AgCl參考電極(RE)，以及金電極(CE)作為對電極。將COVID-19的抗體IgG與IgM修飾過的工作電極與病毒或其S蛋白或N蛋白在含有1M NaCl/5mM K₃Fe(CN)₆/5mM K₄Fe(CN)₆的PB溶液中於室溫下孵育10分鐘後，然後以0.03Hz至200kHz的頻率範圍內的10mV振幅收集EIS。

實施例3--新冠病毒SARS-CoV-2適體感測器

51-nt 3髮夾結構的CoV2-RBD-1C適體(5’-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3’)。這個適體對於RBD的K_d值為5.8±0.8nM。

67-nt髮夾結構的CoV2-RBD-4C(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT-3’)。這個適體對於RBD的K_d值為19.9±2.6nM。

本實施例使用NG-THI-AuNPs奈米複合材料來修飾工作電極，NG-THI-AuNPs奈米複合材料的合成過程如下：將總共2mg NG與2mL超純水在圓底燒瓶中混合，然後超聲處理30分鐘以形成穩定的NG溶液。之後，將2mL的THI溶液(2mg/mL)加入上述燒瓶中，然後劇烈攪拌24h。由於苯環之間的π-π堆積相互作用，THI分子將非共價結合到NG表面。通過離心和洗滌數次除去未整合的THI分子，以獲得NG-THI奈米複合材料。然後將合成後的奈米複合材料分散在2mL水中。然後將直徑約15nm的10mL AuNPs溶液添加至上述分散體中並攪拌過夜以促進AuNPs與NG的氨基完全整合。根據文獻製備了AuNPs(Guo and Wang，2007)。最後，在洗滌和離心後，獲得NG-THI-AuNPs奈米複合材料，並在4℃下儲存以備進一步使用。

在SARS-CoV-2病毒適體感測晶片的製備過程中，將10μLNG-THI-AuNPs奈米複合材料塗覆在相應的工作電極。將修改後的設備在50℃的烤箱中放置半小時。然後將10μL新冠病毒適體滴到NG-THI-AuNPs修飾電極的表面上，然後用1mL TE緩衝液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.4)中除去未結合的適體。新冠病毒適體的濃度優化為28μg/mL。由於適體已經在5'端被巰基修飾，這有助於它們通過Au-S鍵與AuNPs結合。接下來，使用10μL 1mM MCH溶液封閉任何非特異性結合位點。在室溫下孵育1小時後，用1mL TE緩衝液將修飾的適體感測晶片洗滌3次。製備的好的適體感測晶片，使用時，可裝入本發明的生物氣溶膠檢測裝置，並連接讀取電路模組，使用DPV量測PB溶液中SARS-CoV-2病毒的濃度，並反算空氣中SARS-CoV-2病毒的濃度。

實施例4--SARS病毒感測器。

對SARS病毒的核衣殼蛋白(nucleocapsid protein)具有專一性 的適體可參考韓國專利KR20120139512，或是Cho,S.J.,Woo,H.M.,Kim,K.S.,Oh,J.W.,and Jeong,Y.J.(2011).Novel system for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer.J.Biosci.Bioeng.112,535-540.所提出的兩種DNA適體，第一種

GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA,

第二種

GCAATGGTACGGTACTTCCCCGTAGATCGAGGGAGCGCATTAAGGTATACGCCCTTCCCATCTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA

為了讓該適體能容易固定於工作電極的金表面，因此5'末端用6位碳連接體上的硫醇修飾，

5'-HS-(CH₂)₆-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-(CH₂)₂-3’

5'-HS-(CH₂)₆-GCAATGGTACGGTACTTCCCCGTAGATCGAGGGAGCGCATTAAGGTATACGCCCTTCCCATCTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-(CH₂)₂-3’

感測晶片的製備與EIS量測可參考實施例1。

實施例5--諾羅病毒(Norovirus)的偵測

諾羅病毒(Norovirus),or或杯狀病毒(Calicivirus)是病毒性胃腸炎的最常見原因，也稱為冬季嘔吐病。每年的爆發使數百名工作人員和成千上萬的病人數日無法工作，並導致全世界發達國家醫院的整個病房關閉。

諾羅病毒(Norovirus)，衣殼蛋白質(Capsid protein)如下所示

5'-HS-(CH₂)₆-GTCTGTAGTAGGGAGGATGGTCCGGGGCCCCGAGACGACGTTATCAGGC-3'

本實施例使用PB-PEDOT-AuNPs奈米複合材料來修飾工作電極，PB-PEDOT-AuNPs奈米複合材料的合成程序如下，PB-PEDOT奈米複合材料是通過在Fe^{3 +}離子存在下EDOT的氧化聚合而合成的。PB-PEDOT奈米複合材料具有核殼結構，可以顯著提高PB的穩定性和導電性。簡要地說，首先將50μLEDOT溶解在5mL乙醇溶液中，然後轉移到25mL 0.1M HCl中以形成穩定溶液。同時，將13.2mg K₃[Fe(CN)6]和10.8mg FeCl₃．6H2O添加到10mL的0.1M HCl溶液中，然後超聲處理30分鐘。在劇烈攪拌下將獲得的兩種溶液混合在一起。隨著反應的進行，混合物的顏色逐漸變成深藍色，表明形成了PB-PEDOT奈米複合材料。離心並洗滌後，將混合物在烘箱中乾燥。最終，將10mL AuNPs溶液添加到2mL PB-PEDOT中懸浮液(1mg/mL)攪拌過夜，形成PB-PEDOTAuNPs奈米複合材料。

在複合適體感測晶片的製備過程中，將10μLPB-PEDOT-AuNPs奈米複合材料塗覆在相應的工作電極。將修改後的設備在50℃的烤箱中放置半小時。然後將另外10μL諾羅病毒(Norovirus)，衣殼蛋白質適體引入PBPEDOT-AuNPs修飾電極上，然後用1mL TE緩衝液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.4)中除去未結合的適體。諾羅病毒衣殼蛋白質適體的濃度優化為47μg/mL。由於適體已經在5'端被巰基修飾，這有助於它們通過Au-S鍵與AuNPs結合。接下來，使用10μL 1mM MCH溶液封閉任何非特異性結合位點。在室溫下孵育1小時後，用1mL TE緩衝液將修飾的適體感測晶片洗滌3次。製備的好的適體感測晶 片，使用時，可裝入本發明的生物氣溶膠檢測裝置，並連接讀取電路模組，使用DPV量測PB溶液中SARS-CoV-2病毒的濃度，並反算空氣中SARS-CoV-2病毒的濃度。

對於飛機上或是任何密閉空間，如何確保通風系統可以快速將病毒或是病菌帶走，確實需要有病毒捉器來進行感測回饋。然則空氣中，是否有核衣殼蛋白或是病毒本身，就需要來偵測，至少可以確定，核衣殼蛋白沒有傳染性。但是可幫助確定空氣中是否有被病毒感染，引申來說，其實所有具有傳染性的病原體，除了偵測病原體本身的數量，病原體各部位的蛋白質都可能在宿主的體內產生於血液中，鼻腔，咽喉，肺部等等。

本發明已透過上述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此一技術領域具有通常知識者，在瞭解本發明前述的技術特徵及實施例，並在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之請求項所界定者為準。

1:生物氣溶膠檢測裝置

5:環境空氣

10:過濾單元

12:抽氣風扇

13:油膜/PBS容器

14:感測晶片

16:訊號讀取模組

17:微控制器

18:無線通訊模組

19:電源供應模組

Claims (10)

1. 一種生物氣溶膠檢測裝置，包含：

   一收集模組，係包含：一抽氣風扇，一弧形漸縮氣道，一小型泵浦，一油水容器，內裝油層/磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate-buffered saline，PBS)，一蠕動泵浦；該抽氣風扇進氣口設置一過濾單元，將吸入空氣初步過濾，並經由該弧形漸縮氣道產生衝擊力將空氣中的生物氣溶膠收集到油水容器的油層上方，讓生物氣溶膠吸附於油層表面，然後定時透過小型泵浦將壓力風打在油層表面上，使油層翻轉，在翻轉過程，待測生物氣溶膠會翻轉至油層下，進入PBS中；

   一檢測模組，係包含：一感測晶片單元，一訊號處理單元、一微控制器單元，各單元電性相連；該感測晶片單元上固著至少一專一性的探測分子，以專一性檢測進入PBS中特定的生物氣溶膠；

   一電源，供應該收集模組與該檢測模組所需電力；

   其中進入PBS中的待測生物氣溶膠，經由循環的流道設計，配合蠕動泵浦的驅動，讓油層下的PBS及待測生物氣溶膠都會循環流經感測晶片單元，使待測生物氣溶膠有效接觸專一性的適體或抗體，達成接近百分百的捕捉與檢測。
2. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的生物氣溶膠包含病毒、病菌、真菌(fungi)、花粉(pollen)至少其中之一。
3. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的檢測模組，進一步包含無線通訊模組，或顯示單元。
4. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的PBS內含氧化還原離子選自赤血鹽/黃血鹽、六氨合釕(II)/(III)(Hexaammineruthenium(II)/(III))。
5. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的探測分子選自適體、抗體、或醣分子。
6. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的工作電極進一步修飾奈米材料選自奈米磁珠、奈米金、碳管、石墨烯、ZnO，以及這些奈米材料進一步結合硫氨酸(thionine)或普魯士藍(Prussian Blue)。
7. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的感測晶片單元的檢測方式為光學(Optical)法，選自表面等離振子法(surface plasmon resonance,SPR)，比色(colorimetric)法，化學發光法(chemiluminescence,CL)，熒光法(fluorescence)，表面增強拉曼散射法(surface-enhanced Raman scattering,SERS)和干涉法(interferometry)。
8. 依據申請專利範圍第1項的檢測裝置，其中的感測晶片單元的檢測方式為電學(Electrical)法，當目標物與抗體或適體之間的結合引起或改變電信號時，即可偵測目標物的濃度，選自電化學法，壓電換能器法，場效電晶體(FET)法，奈米孔(nanopore)。
9. 依據申請專利範圍第8項的檢測裝置，其中的電化學法的訊號處理單元主要選自安培法、方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)、差式脈波伏安法(Differential Pulse Voltammetry,DPV)、計時安培法(chronoamperometry)、間歇脈衝安培法(intermittent pulse amperometry,IPA)、快速掃描循環伏安法(fast-scan cyclic voltammogram,FSCV)、電化學阻抗頻譜法(Electrochemical Impedance Spectrum,EIS)或其組合。
10. 一種生物氣溶膠檢測的方法，係使用一生物氣溶膠檢測裝置，包含以下步驟：

    步驟一、過濾，將通過的待測空氣去除非目標生物氣溶膠；

    步驟二、抽氣，將環境空氣利用進氣風扇吸入裝置；

    步驟三、捕捉收集，將生物氣溶膠衝擊至裝置內油膜/磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate-buffered saline，PBS)，讓生物氣溶膠附著油膜，或是穿越油膜，直接進入PBS中；

    步驟四、生物氣溶膠轉水溶膠，利用檢測裝置之漸縮流道產生衝擊力，或是小型幫浦吹開油膜翻轉油膜上方捕捉的氣溶膠至PBS中，變成水溶膠；

    步驟五、濃縮質傳，利用循環流道的設計，將PBS內的水溶膠全數流動到感測晶片與晶片上的探測分子捕捉結合；

    步驟六、檢測，利用感測晶片上的探測分子捕捉結合，產生的訊號改變，進行目標生物氣溶膠的濃度偵測。

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