CN115487539A - 使用大珠粒色谱介质的直接捕获 - Google Patents

Abstract

连续处理，其中多个相互相同的柱的子集串联连接。将工艺液体，例如粗制细胞培养收获物供应至子集的最上游柱，连续地流过串联连接的柱并且通过最下游离开子集，并流入例如下游收集容器中。一旦最上游柱的填充床被产品饱和，该柱就与子集断开连接并从串联连接中移除，并且添加替换的相同柱，使得其串联连接在子集的最下游柱的下游，并且重复该过程。

Description

使用大珠粒色谱介质的直接捕获

技术领域

本发明涉及使用包括大珠粒(large beads)的填充床的用于液相色谱的柱(例如径向流动型)直接或初级捕获(例如从粗进料中捕获产物)在优选的未澄清(即未净化)的工艺液体中存在的产物。具体而言，本发明涉及来自细胞培养物或细胞发酵收获物的生物制品的下游处理，并且涉及相关的液相色谱系统。

背景技术

关于色谱的一般背景

通常必须或期望分馏流体混合物以分离或离析出有用的或期望的组分。这可以通过使用液相色谱系统来实现。

各种大小的色谱系统用于实验室分析操作和工业规模生产操作，其中分离步骤(诸如从人血液中分馏或从药物中捕获或去除杂质)可以在批处理(batch process)中大规模进行，并且现在也可以在连续处理(continue process)中进行。

液相色谱法可简要描述为基于组分的物理或化学特性的差异来分馏混合物的组分。各种液相色谱系统用分馏或固体基质来分馏组分。一些液相色谱基质系统基于诸如分子量的物理参数来分馏混合物的组分。还有其它液相色谱系统将基于诸如离子电荷、疏水性和某些化学部分(诸如组分上的抗原决定簇或卵磷脂结合位点)的存在的化学标准来分馏混合物的组分，它们一起被表征为“亲和”部分。

液相色谱法通常使用分离柱。分离柱包含本领域公知的固定相、填料、填充床或基质介质或材料，其与待分离的样品流体的各种组分相互作用。分离介质的组成取决于被引导通过其中的流体，以便产生期望的分离。

为了制备能够有效分离生物物质的色谱柱，通常将分离材料的细颗粒尽可能紧密和均匀地填充在柱管、填充床中。通常通过用包括过滤元件的出口装置封闭柱的一端，并在压力下将颗粒的液体悬浮液从柱的另一端倒入或泵入到柱中，来实现柱的填充，或如通常所指的柱填充。尽管泵送的液体能够基本上不受阻碍地通过过滤元件，但是颗粒被过滤元件保留，从而沿着管的长度构成颗粒床。当填充柱管时，朝向管壁压出颗粒，并且颗粒床获得稳定的压实状态，其中颗粒通过由泵或顶部过滤器的压缩产生的压力而良好地分布，在整个填充过程期间都保持该状态。

本领域通常已知的第一类型分离柱是圆柱形结构，并且流体轴向流过保留在柱中的分离介质床(填料或基质)。介质床保留在柱的一端或两端上的载体(supports)或过滤器板(frits)之间。当样品(也称为“进料”)或洗脱(也称为“解吸”)流体通过分离介质床时，相关流体的成分由于它们与基质或填充材料的不同相互作用而以不同速率行进。结果，这些成分在柱的出口流中分离(即，具有不同的洗脱时间)出来。

随着对高性能低压色谱的需要，开发了水平或径向流型色谱柱。这种水平或径向流柱例如在美国专利No.4,627,918和4,676,898中描述并要求保护。在水平或径向流型柱中，样品/吸附和洗脱/解吸附流体经由分配器引入到由填充材料组成的分离介质或基质的外周或圆周壁或表面，在那里组分被分离，并且流体水平或径向向内通过分离介质到达中心或收集端口，然后在不同时间以不同速率从柱洗脱。这种水平流动柱设计具有高横截面积和非常低的有效床高度。因此，它提供了在低操作压力下处理非常高的流速的能力。

如本文所用，可互换使用的术语“水平或径向流动模式”被定义为样品(例如生物分子)或洗脱液或洗涤流体在垂直于柱的纵轴的方向上通过色谱柱的流动，而不管柱相对于工作台或支撑台或用于支撑或堆叠柱的其它设备的位置如何。

这种水平模式的色谱分离可以通过色谱柱来实现，该色谱柱被构造成具有内环和外环，其中基质材料填充在内环和外环之间，从而具有环面或环形形状。因此，床高度被计算为内环和外环之间的距离。因此色谱在柱中径向进行。

这种水平模式的柱构造导致均匀的床高度，因为入口和出口分配器是固定的。分配器和收集通道被设计成提供样品的均匀施加和穿过色谱床的水平流线。长的、垂直的、具有水平流的柱组件易于制造，便于包装和处理。此外，由于床高度沿柱长度是恒定的，所以横截面积和床体积都与柱长度成比例。因此，通过与所需的操作规模成比例地线性增加柱的长度，可以按比例放大。在任何操作规模下，压降保持恒定，并且通过柱床长度的线性递增容易实现按比例放大。

水平模式柱特别适用于与生物分子(如蛋白质或对剪切力特别敏感的其它有机或无机化合物)的分离结合使用的高性能低压色谱。这种柱类型能够用于高效和常规色谱，在制备模式中混合物的鉴定和分离，并且还提供了按比例放大至更大的柱，用于以适合于工业或生产目的量从混合物中分离组分。

色谱柱的开发旨在提供操作的简易性和具有特别商业重要性的各种附加益处。这些包括：(a)通过高压灭菌来消毒的能力；(b)由于产品从一批到下一批的遗留物较少的设计特征而改进的卫生；(c)耐溶剂的能力；(d)符合食品级FDA规定的材料；(e)改进的耐压性；(f)低成本；(g)完全或部分自动化的潜力；(h)提供一次性柱的能力；(i)线性过程升级。

在使用期间，填充床即珠粒的性能不断劣化。由于珠粒通常非常昂贵(大约1-20欧元/毫升)，至少对于工业应用，填充床应该完全用尽。优选地，多次使用相同的填充床(实际限制为200次)并且在每个下一次之前(即，在每两次连续使用之间)彻底清洁。尽管非常小心，但是由于老化，在使用覆盖许多个月的时间段(例如6或12个月)的情况下，理论上的最大使用次数几乎不匹配。由于在两次后续使用之间的清洁期间不可避免地不能完全去除任何可能的污染物，因此老化加剧。

直接捕获的特定背景

现在，通过哺乳动物细胞培养作为生物分子的说明性示例来提供更特定于直接捕获的信息。

生物-药物产品，通常是治疗性蛋白质可由多种生物体产生。目前最常用的生产方法是哺乳动物细胞培养，其中微生物生长并被设计为产生通常不能由该(例如CHO)细胞产生的额外的特殊化合物。设计的治疗产品是目标活性药物成分(也称为API)。由于许多生物化合物携带(非人)宿主的特征，由非人细胞产生的产物可引起接受者的排斥，细胞培养细胞在那里“人源化”。这通过与哺乳动物细胞融合以产生人特征来完成，并且被称为哺乳动物细胞培养。哺乳动物细胞在大容器中生长，其中小心平衡的能量-混合物(power-cocktail)，培养基，支持它们的生长。培养基含有所有的营养物以获得指数细胞生长。当细胞被良好地程序化时，其将大量产生目的化合物，并且当可能时，API分泌到周围培养基中(细胞外)。用于API生产的典型细胞培养体积是1,000-10,000升。

这些完美的小型设计的缺点是融合细胞更脆弱。必须温和处理细胞以防止破裂(即，它们必须保持存活)。破碎的细胞导致两个问题：细胞停止产生，但更重要的是它们的内部物质分泌到培养基中。宿主细胞蛋白质(HCP)和宿主细胞DNA污染培养基，这使得纯化更加困难，并且来自内部细胞的消化酶开始消化培养基中的所有蛋白，即还有靶API。在细胞培养期间，温和地进行混合，甚至均匀地用空气喷射也可以引起细胞破裂。当细胞培养物达到其生长极限时，收获培养物。在短时间内收获1,000-10,000升细胞培养物而不损伤细胞具有很大的挑战性。

工业规模的现有技术是快速澄清、离心和/或过滤细胞，从含有API的周围介质(血浆)中分离细胞团。不幸的是，离心和过滤也导致细胞破裂，从而污染血浆。未澄清/粗制的，例如，不对柱进料的工艺液体进行过滤和/或离心的装置。

几十年前，已发明了膨胀床吸附(EBA)以在不进行净化的情况下提供对粗进料的处理。该工艺有时称为“流化床吸附”。通过沉淀沉降的层析珠浆液的底部，将细胞培养物供给到床中。在沉降珠粒上方没有限制性筛或其它限制，并且允许床通过向上流的力向上膨胀。柱很高，并且当沉淀时，允许床自由膨胀，仅约1/3填充有沉淀的珠粒。然而，没有阻力导致优先路径，并且由此停滞的积聚细胞的碎片导致路径外部的污染。为了防止这种情况，通过包括金属芯来人工地使色谱珠粒更重。因此沉淀的珠粒较重，产生密度(阻力)，即动态孔径减小，迫使细胞均匀分布在底部的整个表面上并迫使珠粒留出空间以供通过。尽管这种技术在某些情况下工作良好，但是它难以控制并且通常不是非常鲁棒(robust)。

相关背景技术

US5466377A(Grandics等人，1995年公开)公开了在标准或常规的低压填充床色谱柱中使用大珠色谱颗粒，用于直接捕获来自未澄清的工艺液体的产物，作为用于下游处理来自不同类型的匀化细胞培养物、微生物细胞培养物或细菌细胞发酵收获物的生物制品的系统，所述系统使用约0.5至1微米且比哺乳动物(CHO)细胞小至少10倍的微生物。公开了直径为1.5厘米的轴型柱的使用，所述轴型柱具有大孔(60-180微米，等于0.06-0.18毫米的孔)的端板筛网、直径为100-300或300-500或500-800或800-11000微米(分别等于0.1-0.3或0.3-0.5或0.5-0.8或0.8-1.1毫米)的珠粒和9毫升的床体积。没有提供关于该柱的进一步信息。然而，从提供的柱直径和体积的数据，可以计算“床高度”，即端板筛网之间的轴向距离，并且等于5.0厘米。在实验室环境中的这种小规模操作下，通常不存此处提到的问题，例如涉及污染、老化和出于经济原因而完全用尽填充床。然而，在经济水平上进行大规模生产的尝试表明，即使使用所示范的匀浆物和小得多的细菌细胞，轴向柱型也不适合于直接捕获的工业应用。

发明内容

本发明的目的是通用的，并且根据第一方面，提供一种改进的、无污染的、低压、温和作用的填充床色谱柱，其填充有用于从未澄清(或粗制)工艺液体中有效直接捕获产物(例如生物分子)的大珠粒，以及相关工艺，特别是用于来自哺乳动物CHO的生物制品或类似细胞培养物或细胞发酵收获物的下游处理(细胞培养物密度通常高于0.1或0.5或1或2和/或低于50或100百万细胞/毫升)。在第二方面，第一下游处理步骤，即所述高密度细胞培养收获物的初级捕获，是在径向流动填充床捕获柱中，直接来自细胞培养物容器，而没有任何中间、过滤或其它澄清设备，也没有任何收获物保持步骤或保持容器。从感兴趣的产物中耗尽的处理过的细胞培养液(the processed cell culture liquid,depleted from theproduct of interest)离开初级捕获柱(通常含有细胞/颗粒内容物)直接进入例如废物或收集容器中。通过去除过滤设备，实现了资金成本和设置时间的减少，而去除收获物保持容器减少了在感兴趣产物在容器中的停留时间期间用于通过宿主细胞酶活性蛋白水解攻击和自动消化感兴趣产物的可用孵育时间，因此去除容器将减少产物损伤或消化的风险。避免细胞损伤也是一个目的。其它目的可在本公开内容的其它部分找到。

根据本发明，通过应用高性能色谱柱来提供解决方案，该高性能色谱柱的特征在于填充床和通过填充床的水平或径向流动。此处，这种使用径向流的直接捕获技术也称为cTRAC(细胞耐受径向亲和层析)。应当理解，为径向流动设计的柱通常意味着填充床是环形或圆环形的，尽管也涵盖了替代设计，优选模仿径向流动型柱的流动条件的设计，例如楔形或圆锥形，其中一种过滤器板的表面积(I)比另一种(O)大，以满足功能性I/O要求。通常，待处理的液体进入填充床所通过的过滤器板，也称为入口过滤器板，与液体离开填充床所通过的过滤器板，也称为出口过滤器板相比，具有更大的表面积。因此，待处理的液体通常从入口过滤器板径向向内流向出口过滤器板。也可以避免典型的上游保持容器，使得来自细胞培养物的液体可以直接供给到色谱柱。

令人惊讶的是，本发明人发现，适当设计的、适当平衡的径向型柱可以产生额外的动态阻力，该动态阻力是在不减小孔径的情况下使液体均匀分布在整个表面积上所需的。cTRAC径向柱的特征在于入口表面积大于出口表面积。填充床为放射状、楔形或圆锥形。填充床的填充密度通过环形填充方法适当地控制，导致在整个填充床上的珠粒孔隙率的均匀分布。填充的珠粒之间的间隙体积在入口(较大表面)处与在出口(较小表面)处相比是相同的。因此，间隙孔径在整个柱中是恒定的。此外，在柱之前和工艺液体流过柱期间不需要净化和/或收获物保持步骤，离开柱的液体(通常为细胞/颗粒内容物)可以直接供给到例如废物收集容器中。如果处理例如高密度连续灌注细胞培养物，其中培养细胞例如保留在柱上游的细胞培养物内，导致具有极端细胞密度的细胞培养物，并且其中仅连续地将含有有限量的细胞物质的相对小的体积送往下游处理，则柱可以直接由细胞培养物出口供给(例如连接)/直接供给到细胞培养物出口，其中选择通过流出物将进料(部分地)再循环回到上游源(例如连续灌注细胞培养物)中，或将柱输出送入例如废物收集容器中。

这种解决方案是令人惊讶的，因为使细胞(通常5-20微米)通过填充床却没有上述问题(例如，阻塞、污染、使用经济性)总是被认为对于工业或合理应用是不可能的。一方面，较大的珠粒填充到均质基质中，在它们之间留下“开放空间”，即间隙体积，这是有益的。通过该间隙体积，细胞能够仅在有限的或甚至没有阻碍(阻力、剪切力)的情况下流动。低或甚至缺乏阻力对于细胞生存力是有益的，细胞在珠粒之间在低的或甚至没有阻碍的情况下朝向柱的出口平缓地流动。细胞行进的驱动力是液体的流动。然而，低或甚至无阻力也意味着优先路径、细胞累积和污染碎片以及完全阻塞的趋势，如在较早的EBA示例中。

与较早的EBA示例类似且并行地，在填充床色谱的应用中的主要挑战是迫使进入的液体均匀地分布在整个表面上，从而防止优先路径，而不产生孔径减小，因为在填充床中，这将是静态的且将导致立即的柱堵塞。在较早报道的使用具有填充床的传统(轴向)色谱柱的尝试的情况下，柱将堵塞和/或污染。

不受理论的约束，据信本发明的令人惊讶的效果可以通过Kozeny-Karman方程来解释(即，例如Besselink:Are axial and radial flow chromatography different？；Journal of Chromatography A；1271(2013)105-114)。根据该方程，表观速度的增加导致对珠粒之间流动的阻力的增加。此外，表观速度的增加似乎与I/O比(有时称为“α”或“alpha”)成比例，I/O比与径向柱的形状直接相关。

表面积朝向径向流型柱的出口的减小导致局部流速增加，这在没有减小间隙空间的情况下导致阻力增加，这进而导致液体在整个表面上的均匀分布。尽管出口处的表面较小，但像光学透镜一样聚焦液体流，均匀分布被转移到入口处的较大表面。代替径向向内流动，通过填充床的径向向外流动可以应用于本发明的柱。

在EBA的情况下不存在但在填充床柱的情况下确实存在的另一个问题是筛网(过滤器板)，在筛网之间填充床并其将内部体积与外部流动路径分开。实验表明，只有非常薄且开放/光滑构造的过滤器板才能使细胞通过而不会破裂或造成不同的损伤。

优选的径向流动柱的薄且开放构造的过滤器板允许优异的细胞生存力。径向柱的圆柱形形式允许过滤器板较薄，因为圆柱形物体的形状稳定性是具有相同材料厚度的平面形物体的形状稳定性的许多倍。较薄的过滤器板导致更大的生存力和更少的破裂细胞。

珠粒尺寸、珠粒刚性、填充密度、入口表面积/出口表面积比(I/O比)和体积流速现在是用于支持待处理液体的均匀分布的适当动态阻力的一些可能的参数。必须针对每个单独的应用优化这些参数之间的适当平衡。那么所产生的支持均匀分布的动态阻力对于应用是不利的。

优选地，对于过滤器板，应用以下一种或多种：由不锈钢制成；电抛光表面；亲水表面；包括直接彼此叠置的至少或准确的一个或两个或三个或四个不锈钢编织丝的层或片，优选地根据平纹编织(plain weave)或斜纹编织(twilled weave)或平纹荷兰编织(plaindutch weave)或斜纹荷兰编织或反向平纹荷兰编织或反向斜纹荷兰编织或五综编织图案编织的至少一个片材，例如过滤层；这些片材提供了联合的组件，优选地是相互烧结的(也称为扩散结合)；至少一个或两个，例如每个，片材由直径与紧邻片材相差至少10％或20％，例如更大或更小的线材编织而成；片材之间的线厚度从过滤器板的一个表面到另一个表面，优选从面向和/或界定填充床的表面增加；片材的线厚度为至少25或50微米(等于0.025和0.05毫米)和/或不大于500微米(等于0.5毫米)；至少一个或两个，例如每个，片材具有与紧邻片材相差至少10％或20％的孔径，例如更大或更小；片材之间的孔径从过滤器板的一面到另一面，优选从面向和/或界定填充床的表面增加；具有最粗的线和/或最大的孔径(例如至少500微米(0.5毫米))的片材(例如增强片材)是过滤器板的优选最终的内部或最外部的片材，优选是离填充床最远的片材；厚度至少0.3或0.8或1.0毫米和/或不大于1.2或1.5毫米；孔径(这是“标称”孔径，由能够通过孔的最大刚性球体的直径定义)至少50或100和/或不大于200或500微米(分别等于0.05、0.1、0.2和0.5毫米)；优选地通过连续焊缝焊接到轴向端板；内部过滤器板的片的数量与外部过滤器板相比多一个或两个或三个；包含单一过滤层；过滤层直接暴露于填充床；在过滤层的面向填充床的一侧，不存在层，例如保护层；过滤层提供表面层；在过滤层的一侧没有层或仅有保护层，而在另一侧仅有保护或分散层，并且可能准确地有一个或两个另外的层，优选地加强层。

优选地，I/O比为至少1.5:1或2:1或2.5:1和/或不大于3:1或3.5:1或4:1或5:1或10:1。I/O是柱的外部过滤器板和内部过滤器板的半径(在图1中由箭头R1和R2示出)之间的比率。

床高度优选至少10或20和/或不大于100或150或200或300毫米。床高度(在图1中由箭头H示出)是内部过滤器板和外部过滤器板之间的距离，或者换句话说，是内部过滤器板和外部过滤器板的直径之间的差。床体积优选为至少10或25或50或100或200或250或500毫升和/或不大于10或20或150或250升。

内部过滤器板的直径(以毫米为单位)优选为：至少10或15或20和/或不大于80或100或150或300，例如23或50或60或100。

可替代地，代替用于容纳珠粒的完整的环形或圆环形的床，使用其一段(即图13)。

在由内部过滤器板界定的典型的圆柱形空间中，优选地设置芯构件，芯构件的外壁与内部过滤器板界定内部流动通道。

优选地，界定在外部筛板外部的外部流动通道具有至少0.5毫米和/或不大于2或3或5或10毫米的宽度。优选地，内部流动通道具有至少0.5毫米和/或不大于2或3或5或10毫米的宽度，更优选地等于外部流动通道宽度乘以I/O比率(也称为“I/O-宽度”)和/或其宽度比外部流动通道宽度宽至少0.5或1或2和/或不超过5或10毫米。在锥形芯构件的情况下，内部流动通道宽度优选地在一个轴向端部处为至少0.5和/或不大于1或2毫米，并且在相对的纵向端部处为至少1或接近I/O宽度和/或不大于3或4或6毫米(“纵向”平行于柱的轴向方向)和/或比窄轴向端部宽至少1或2和/或不超过3或5或10毫米。

优选地，本发明应用于连续处理，其中两个、三个或更多个，例如五个，优选彼此相同的柱的子集串联连接，优选不超过5或10个。对于该过程，完整集合所需的柱数等于子集的柱数加上一柱、两柱、三柱或更多柱，优选地与子集的柱相同。将工艺液体，例如粗制细胞培养收获物，供应至该子集的最上游柱，连续流经串联连接的柱，并且例如从目标产物耗尽的培养物和细胞，通过最下游离开子集，并且流入例如下游收集容器，例如废物收集容器。一旦经过足够的时间或预定量的时间，例如最上游柱的填充床已经捕获预定量的产物的时间，例如变得充满产物，最上游柱就从子集断开连接并且从串联连接移除，并且添加优选地包含新的或重置的填充床的替换的相同的柱，使得其串联连接在子集的最下游柱的下游，并且重复该过程。在用来自工艺液体的靶使子集的最上游柱饱和所需的时间期间，最近从子组断开的饱和柱被离线处理以重置填充床(例如，洗涤、洗脱/解吸、清除和制备床)以变得可用于添加到子集中以再次变得饱和。具有低流阻的柱允许以高得多的速度进行该离线过程，可能高达通过子集的流速的10倍。这产生了时间推移，造成所需的最少柱数量的减少，并且由此减少了整套设备的总体积。该循环重复多次，以便在时间过去之后重复地从串联连接的柱的子集中移除最上游柱并且将最下游柱添加到串联连接的柱的子集中，以便在整个过程期间子集的柱的数量保持相同。通常，从串联连接中移除的柱使其填充床被处理，例如被清洁，以变成重置的，并且因此适于返回到串联连接，最初作为最下游的柱，并且随后随着其它重置柱被添加在下游而连续地获得上游排序。重置过程优选地在从串联连接中移除两个连续的柱之间经过的时间内开始和完成，使得柱仅被尽可能短暂地从串联连接中移除，并且需要最少可能数量的柱。优选地，作为连续处理的一部分的柱的数量是串联连接的柱(作为子集)的数量加上重置过程中的单个柱加上可能的一个或两个备用柱。

子集的柱优选地相互连接，使得工艺液体对于所有柱都沿相同的方向(即径向向内或向外)流过填充床，然而在替代方案中，至少一个柱使其填充床沿与子集的至少一个或两个其它柱相反的方向被流过。例如，在子集中，最上游柱使其填充床沿径向向内方向被流过，而同一子集中更下游的柱使其填充床沿径向向外方向被流过。

对于相同体积产率的捕获产物，与批处理相比，连续处理需要较小体积的珠粒，例如至少小25％或50％或75％。

与该连续处理相关的每个柱的填充床体积优选为至少25或100或250毫升和/或不大于10或20或100升。

这种连续处理的目的是显著减少生态足迹、安装时间、处理时间、废料、在洁净室中的花费时间和空间。

柱，优选地连续处理中的子集，可以用于从工艺液体中去除例如生长速率限制的污染物，其中污染物是填充床的目标，并且离开柱或子集的液体例如作为供给细胞培养物的培养基。

对于连续处理，非常重要的是，离开更上游的柱的工艺液体仍然没有污染物，例如，损伤的细胞或细胞内容物，诸如蛋白质或DNA。这可以通过设计出口过滤器板使得细胞可以不受损伤地通过它来提供。对于连续和批次过程，优选地设计入口和/或出口过滤器板，使得细胞可以不受损伤地通过它。

珠粒优选具有至少200和/或不大于500或1000微米(等于0.2和1.0毫米)的直径和/或是亲水的。

在一个实施例中，本发明涉及一种液相色谱柱，其利用通过其中的样品材料的水平或径向流动，包括以下中的一种或多种：外壳，所述外壳在其中限定腔室并且包括至少一个优选地可移除的轴向/纵向端部；第一(外部)和第二(内部)轴向/纵向延伸的多孔过滤器板或膜，位于所述外壳的所述腔室内；优选地为颗粒状的色谱分离材料床或填料，位于所述外壳的所述腔室内，并位于所述多孔过滤器板中间，第一或外部所述多孔过滤器板与外壳壁相邻，并与所述壁一起限定圆柱形的环型外部流动通道，第二或内部所述多孔过滤器板与可任选的芯构件相邻，并与所述芯构件一起限定圆柱形的环型内部流动通道；分配装置，可操作地连接到所述外部流动通道；收集装置，可操作地连接到所述内部流动通道；供应通道(也称为液体入口)，可操作地连接到分配装置，和排出通道(也称为液体出口)，可操作地连接到收集装置；所述分配装置和所述外部流动通道被构造成在所述床中沿基本水平的方向横跨所述床的轴向/纵向长度均匀地引导待分离的相关材料。

此外，所述多孔过滤器板相对于彼此同轴地定位。实际上，所述第一多孔过滤器板具有比所述第二多孔过滤器板更大的横截面，并且如果应用所述芯构件，则所述芯构件位于所述外壳腔室的中心，与所述第一和第二过滤器板同轴。

优选地，以下进一步特征中的一个或多个适用于本发明的柱：轴向端部中的一个被供应通道(或液体入口)和排出通道(或液体出口)穿过；排出通道与第一和/或第二过滤器板同轴；外部流动通道与外壳中心和/或排放通道径向地间隔开；外壳具有基本上圆柱形的壁；第一和第二过滤器板是可移除地容纳在外壳中的料筒的一部分；在一个轴向端处，第一和第二过滤器板通过端壁连接，该端壁在所述轴向端处封闭第一和第二过滤器板之间的空间，且可能具有用于排出通道或芯构件的通路，和/或在相对的轴向端处，内部流动通道由连接到第二过滤器板的端壁封闭；外部和/或内部流动通道基本上延伸腔室的整个高度；在腔室内的操作位置中，填充床从与轴向端壁相对的端部延伸超过轴向延伸的外壳壁；流出通道，连接到内部流动通道、收集空间、排出通道中的一个或多个，在芯构件内部优选地沿芯构件的纵向延伸，和/或在腔室内在芯构件的轴向/纵向端部处流出；芯构件基本上延伸腔室的整个高度；芯构件贯穿轴向端部；芯构件从轴向端部突出；轴向端部具有被芯构件穿透的中心孔；芯构件利用其轴向/纵向自由端与相关联的轴向端部保持间隙和/或朝向所述轴向端部渐缩至窄尺寸；分配装置包括径向向外的变窄部分，优选地，芯构件围绕分配空间，优选地在轴向端部段与包含填料的空间之间，外部流动通道优选地连接到所述分配空间，更优选地通到所述分配空间；优选地由于芯构件的渐缩，内部流动通道的横截面积优选地沿着轴向方向连续地增加；一个轴向端部，优选与芯构件的轴向自由端相关联的轴向端部，包含装置，例如可封闭的填充端口，以便为过滤器板之间的空间提供填充材料，用于柱填充的目的，同时柱被完全组装(例如，根据WO2007136247(Raedts)的填充系统)；在芯构件与轴向端部和连接第一和第二过滤器板的料筒或端壁中的至少一个之间存在密封件；柱具有约一升或五升或十升容量的便于使用的外部尺寸，可能甚至高达一百升。

优选地，本发明涉及以下一种或多种：具有限定的珠粒大小的吸附珠粒的均质填充床基质，以在整个填充床上产生孔隙率受控的基质，使得其能够使浓缩的未澄清哺乳动物(或任何其他)细胞培养收获物不受阻碍地通过；细胞培养收获物细胞直径约为珠粒直径的0.1-10％；平均珠粒直径为约120-500μm；CHO细胞通常为约5-15或20μm；细胞培养物细胞在多孔基质内的均匀分布是由阻力增加引起的流动集中产生的，如Kozeny Carman方程所解释，如径向填充床所表示的；径向填充床柱从入口行进到出口的速度增加，或当以相反方向行进时的速度减小，产生了驱动细胞的集中/均匀分布而不减少填充床内的珠粒基质之间的孔隙率的阻力；多柱(半)连续操作，其中向串联连接的柱的子集连续地加载细胞培养收获物。

当操作和处理例如高密度“连续灌注”细胞培养物时，大多数培养物细胞保留在柱上游的细胞培养物内，导致细胞培养物具有极端细胞密度，并且其中仅连续地将含有有限量的细胞物质的相对小的体积送到下游处理。柱可以直接供给，例如连接，到细胞培养物出口，其中选择进行产物的初步捕获同时将柱流出物送到收集容器或经由流出物将进料(部分地)再循环回到上游源，可替代地，柱可以填充有大珠粒吸附剂，其被设计为从连续灌注细胞培养物捕获/去除例如限制生长速率的污染物同时将清洁的培养基再循环回到细胞培养物中。

当用于初级捕获时，将柱更换为清洁的柱以允许回收产物。可替代地，捕获污染物的饱和柱可以被更换为清洁的柱，以允许清洁被污染的柱。

因此，该方法也被设计为连续处理。

附图说明

附图被并入并形成说明书的一部分，其示出了本发明的实施例，并且与说明一起用于解释本发明的原理。显示如下：

图1-3是柱的示例的截面侧视图；

图4是图3的柱的顶视图；

图5是从下方的部分被切掉的另一柱的透视图；

图6和13是连续处理的两个示例，其中应用了串联的三个柱的子集；

图7a、图7b、图7c、图7d、图8a、图8b和图8c显示了过滤器板层的织纹图案；

图9是现有技术过滤器板的透视分解图；

图10-11是现有技术过滤器板的截面侧视图；

图12是环形滤床的透视图；

使用以下附图标记：柱1；圆柱形外壳壁2；轴向外壳端板3；第一密封件4；液体入口5；液体出口6；填充床7；内部流动通道8；填充床填充开口9；连接器10；用于填充床的填充管11；第二密封件12；第三密封件13；外部流动通道14；芯15；内部过滤器板16；外部过滤器板17；轴向床端板18；分配空间19；收集器空间20；流出通道21；液体出口22；珠粒高度H；外部过滤器板半径R1；内部过滤器板半径R2；轴向箭头A(图3)。径向方向垂直于轴向方向。

具体实施方式

图1-5中所示的每个液相色谱柱包括：圆柱形的外壳，在其中限定腔室，并且包括圆形的可移除的轴向端板3；圆柱形的第一(外部)多孔过滤器板17和第二(内部)多孔过滤器板16或膜；位于所述多孔过滤器板中间的颗粒色谱分离材料的床7或填料；可选地轴向延伸的芯15。轴向延伸的圆柱形外壳壁2、第一过滤器板17和第二过滤器板16以及芯15是同轴的。

第一或外过滤器板17与轴向延伸的圆柱形外壳壁2相邻，并且与所述壁一起限定圆柱形环型外部流动通道14，例如0.5毫米宽。第二或内部过滤器板16与芯构件15相邻，并与所述芯构件一起限定圆柱形或圆锥形的环形内部流动通道8，例如1.0毫米宽。在图1中，没有芯构件15。

在一个实施例中，轴向顶部端板3被供应通道5和排出通道6两者穿透。这些通道与过滤器板同轴。

第一和第二过滤器板可以是可移除地包含在外壳中的料筒的一部分。

在两个轴向端处，第一和第二过滤器板通过径向延伸的端壁18连接，从而封闭第一过滤器板17和第二过滤器板16之间的空间，以捕获提供过滤器床的环形填料。

滤床7加上芯15几乎完全填充外壳1。在滤床7的顶面18和轴向端板3的底面之间存在分配空间19，外部流动通道14通到该分配空间中。该分配空间可能沿径向向外的方向逐渐变细，并在这样变窄的径向外圆周处与周向延伸的外部流动通道14汇合。环绕芯15的周向内部流动通道8沿轴向方向从一个轴向床端板18沿着芯体15渐缩到相对的轴向床端板，并且在芯的下端处与限定在芯下端与外壳的底端3或端壁18之间的收集空间20汇合。内部流动通道8的这种锥形形状提供了宽的和窄的轴向端，这是由于芯的轴向锥度。分配空间19和内部流动通道8的锥形优化了流动特性。流出通道21纵向延伸穿过芯15(图2)并且连接到液体出口6和收集空间20。

图3示出了一个实施例，其中，通过液体入口5进入的液体的一部分在不经过外部过滤器板17的情况下离开柱1，而是经由外部流动通道14流到液体出口22，因此在未被处理的情况下离开柱1。在一个替代实施例中，可以没有这种液体出口22，并且外部流动通道14可以在其远离空间19的轴向端部处被密封，例如通过将壁18连接到轴向外壳端板3。

滤床7的底端包含位于中心的可封闭的填充端口9，以向过滤器板16、17之间的空间提供用于柱填充目的填充材料。例如，如果滤床7以不同的方式填充材料，则可以没有该填充端口9和相关的密封件及部件10和11。

O形环型密封件被用来将芯部密封到轴向端板和滤床上，并且将盖子密封到轴向延伸的外壳壁上。

图7a示出平纹编织(PL)，图7b示出斜纹编织(TL)，图7c示出平纹荷兰编织(PDW)，图7d示出斜纹荷兰编织(TDW)。图8a示出反向平纹荷兰编织(PZ)，图8b示出反向斜纹荷兰编织(KPZ)，图8c示出五综编织(FHD)。图9示出了四层(从顶部到底部：保护层、过滤层、分配层、单加强层)，图10示出了五层(双加强层)，图11示出了六层(三加强层)过滤器板。与图9-11的过滤器板相比，本发明的过滤器板通过如下获得：在图9的情况下，通过取消最顶层和最底层中的一个或两个(如图中所见)。在图10或图11的情况下，通过取消顶层(保护层)和一个、两个或所有加强层中的至少一个。图12示出了取自环面形床过滤器的床区段。

该柱如下操作：流体通过供应通道引入分配空间，并从那里径向向外流向入口通道。在入口通道中，流体轴向向下流动，以均匀地分布在外部过滤器板的整个表面上。然后，通过外部过滤器板，流体径向向内流过填料以到达内部过滤器板。随后，流体在内部过滤器板的整个表面上均匀分布地流动穿过内部过滤器板，到达出口通道中。流体沿芯的外表面轴向向下流动通过出口通道，被收集在收集空间中。流体从那里流入排出通道。如果芯包含排出通道，例如如图5所示，则流体轴向向上流动通过芯。

另外的实施例也由所附权利要求覆盖。例如，引入流体的流动方向可以相反，为此，供应、排出、入口和出口元件互换。不同的实施例也属于本发明。此处公开的实施例中的不同特征可以以不同的方式组合，并且一些特征的不同方面被认为是相互可互换的。所有描述的或在附图中公开的特征同样地或以任意组合提供本发明的主题，也独立于权利要求或它们的引用中它们的布置。附图、说明书和权利要求书包含许多组合的特征。技术人员将单独地考虑这些并且将它们组合到另外的实施例。

结论：优选地，液相色谱柱，利用优选地沿向内方向穿过其中的样品材料的水平或径向流动，包括：外壳，外壳，所述外壳在其中限定腔室；第一和第二轴向或纵向延伸的多孔过滤器板，位于所述外壳的所述腔室内；优选地为颗粒状的色谱分离材料的床或填料，位于所述外壳的所述腔室内，并位于所述多孔过滤器板中间，第一所述多孔过滤器板与所述外壳和外部流动通道相邻，第二所述多孔过滤器板与可任选的芯构件和内部流动通道相邻；所述床为圆环形状；分配装置，可操作地连接到所述外部流动通道；收集装置，可操作地连接到所述内部流动通道，所述分配装置和所述外部流动通道被构造成在所述床中沿基本水平的方向横跨所述床的纵向长度均匀地引导待分离的相关材料，优选地，所述多孔过滤器板相对于彼此同轴地定位，所述第一多孔过滤器板具有比所述第二多孔过滤器板更大的截面，并且所述芯构件位于所述外壳腔室的中心。

Claims (15)

1.一种使用包括珠粒的填充床的液相色谱柱处理工艺液体的方法，所述工艺液体含有被所述珠粒捕获的生物物质，其中，作为第一处理步骤，在例如细胞培养容器的工艺液体产生源的下游，工艺液体直接从所述源供给至所述柱而没有任何中间过滤或其它澄清设备，也不存在任何收获保持步骤或保持容器，并且通过所述柱耗尽的感兴趣产物的工艺液体在径向流过所述柱之后离开所述柱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，应用柱集合，其中至少两个柱的子集串联连接，并且所述工艺液体被供应至所述子集的最上游柱，连续地流过串联连接的柱并且通过最下游柱离开所述子集，并且在时间过去之后，例如，如果所述最上游柱被产物饱和，则所述最上游柱与所述子集断开连接并且从串联连接移除，并且将来自所述集合的替换柱添加至所述子集，使得其串联连接在所述子集的最下游柱的下游，并且重复该过程，并且优选地，从所述子集移除的柱被离线处理以重置填充床，以变得可用于所述子集而再次变得饱和。

3.根据权利要求2所述的方法，所述子集中的柱优选地相互连接，使得所述工艺液体对于柱而言沿一个方向(即，径向向内或向外)流过所述填充床，并且对于所述子集中的另一柱而言沿相反方向流过所述填充床。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述工艺液体是浓缩的粗制CHO细胞培养收获物，所述CHO细胞直径约为珠粒直径的0.1-10％，所述珠粒直径约为120-500μm，所述珠粒是亲水性的。

5.一种液相色谱柱，被设计为被工艺液体径向流过，并且包括填充床，所述填充床被设计为从所述工艺液体中捕获产物，所述床保持在入口过滤器板与出口过滤器板之间。

6.根据权利要求5所述的柱，其中，所述入口过滤器板和/或出口过滤器板包括准确的三个相互扩散结合的编织线层，过滤层直接暴露于环形填充床，提供相对面的层是加强层，在其之间的层是分散层或加强层。

7.根据权利要求5或6所述的柱，过滤器板的过滤层根据平纹荷兰编织进行编织。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的柱，I/O比为至少1.5:1和/或不大于4:1。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的柱，床高度为至少10毫米和/或不大于200毫米。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的柱，床体积为至少10毫升和/或不大于20升。

11.根据权利要求5-10中任一项所述的柱，内部过滤器板的直径为至少10毫米和/或低于150毫米。

12.根据权利要求5-11中任一项所述的柱，在由所述内部过滤器板界定的空间中，定位有芯构件，所述芯构件的外壁与所述内部过滤器板一起界定内部流动通道。

13.根据权利要求5至12中任一项所述的柱，在外部过滤器板外界定的外部流动通道具有至少0.5毫米的宽度，并且所述内部流动通道具有等于所述外部流动通道宽度乘以I/O比的宽度。

14.根据权利要求5-13中任一项所述的柱，所述内部过滤器板和外部过滤器板由准确的三层不锈钢的编织线制成，所述三层不锈钢的编织线直接彼此叠置，并且提供至少100微米的孔径，床高度为至少20毫米且低于150毫米，亲水珠粒的尺寸在200微米和1毫米之间，并且I/O低于5:1。

15.一种使用用于液相色谱的包括珠粒的填充床的柱处理工艺液体的方法，优选地根据权利要求1-4中任一项所述的方法和/或使用根据权利要求5-14中任一项所述柱。

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