CN115487360B - 一种丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法，将高分子聚合物加入到溶剂中得到聚合物纺丝溶液A；将天然聚合物和水溶性丝胶蛋白加入到溶剂中得到天然聚合物‑SS纺丝液B；采用三通道微流体芯片，将纺丝溶液A作为一相，纺丝液B作为一相，气流作为三通道微流体芯片的另外一相；然后进行气喷纺丝，SS在微流体芯片的高速剪切下发生蛋白结构的转变，将SS蛋白的部分无规卷曲结构转变为部分β‑折叠结构，从而增加SS的可纺性和稳定性，最终得到高稳定、高机械强度和高生物相容的高分子聚合物‑天然聚合物‑SS纳米纤维复合膜；最后干燥得到丝胶蛋白基皮肤组织支架。该方法易于操作和通用，并将其成功应用在全层皮肤缺损处并实现其皮肤再生。
Description
技术领域
本发明涉及一种丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法，尤其涉及一种构建由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法。
背景技术
皮肤负责多种重要的生理功能，在伤口愈合中具有巨大的临床意义。随着伤口修复需求的不断增加，人造皮肤材料的制备成为近十年来再生医学研究的热点之一。为此，细胞外基质蛋白(弹性蛋白，蚕丝蛋白，纤维蛋白)、天然高分子聚合物(透明质酸，胶原)和多糖组分(壳聚糖，葡聚糖)已被用于设计人造皮肤。在这些材料中，ECM蛋白因其良好的生物相容性、低的免疫排斥反应、高的生物活性、强的亲水性和良好的细胞粘附性而被广泛应用。然而，高成本和较差的抗菌性能，使ECM不能成为理想的人造皮肤材料。特别是其较低的力学性能无法满足至少15MPa的强度要求。因此，在实际应用中制备具有优良抗菌性能、生物相容性、无免疫排斥、机械强度高的廉价人工皮肤材料仍然是一个巨大的挑战。
生物材料支架的ECM结构设计一直是研究的重点，如纳米纤维支架(NFS)、微孔支架、水凝胶和三维生物打印支架。其中，NFS不仅具有类似皮肤的ECM结构，而且具有超高的比表面积。NFS可显著增强与细胞/组织的相互作用，影响细胞的生物学行为，如细胞质分裂、细胞粘附、迁移和分化。因此，大规模制备价格低廉，生物活性好，机械强度高且具有生物相容性和降解性能的细胞质基质蛋白基人造皮肤材料具有重要意义。目前，大规模制备纳米纤维支架的方法主要有溶液气喷纺丝方法，微流体气喷纺丝技术。然而，细胞质基质蛋白的直接使用并不能达到人造皮肤至少不低于15MPa的机械强度的要求。因此，借简易有效、低成本微流体气喷纺丝技术将两相微流控在高速剪切力作用下使蛋白结构发生转变提高其稳定性和机械强度是非常理想的。
发明内容
本发明的目的在于为了改进现有技术的不足而提供了一种构建由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法，该方法易于操作和通用，使全层皮肤缺损处可以实现大面积皮肤再生。
本发明的技术方案为：一种丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法，其具体步骤如下：
a.将高分子聚合物加入到溶剂A中进行搅拌稀释均匀，得到一定质量浓度的聚合物纺丝溶液；将天然聚合物和水溶性丝胶蛋白SS加入到溶剂B中室温下搅拌至溶液状态，从而得到天然聚合物-SS纺丝液；
b.将步骤a得到的高分子聚合物纺丝液作为A液，天然聚合物-SS的纺丝液作为B液，然后将A液和B液分别注入到两个注射器中并固定在微流体注射泵上，将三通道微流体芯片(Y型芯片的交叉口处再接一个气流通道形成三通道微流体芯片)的Y型芯片的两个接头通过软管和A，B两个注射器进行连接；将气流接在三通道微流体芯片的第三个通道处；
c.然后通过微流体气喷纺丝技术进行纺丝，在纺丝过程中，设置一定的空气压力，调控A液和B液的流速，将三通道微流体芯片的喷嘴与接收器调至一定的距离，然后纳米纤维收集在接收器筛网上；同时Y型芯片的A液和B液在微流体芯片的高速剪切作用下发生剪切使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，得到含有由β-折叠结构的高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜，然后将纳米纤维膜在室温下真空干燥，去除残余FA，最终得到由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架。
优选步骤a中所述的高分子聚合物为醇溶性聚氨酯(APU)、聚己内酯(PCL)或者聚乙烯醇(PVA)；所述的步骤a中的溶剂A为乙醇、甲酸或者水；步骤a中所述的天然聚合物为壳聚糖或者明胶；步骤a中所述的溶剂B为甲酸或者水。
优选步骤a中聚合物纺丝溶液中高分子聚合物的质量浓度为10-15％。
优选步骤a中所述的天然聚合物-SS纺丝液的质量浓度为2-4％；其中SS和天然聚合物的质量比为1-2。
优选步骤b中所述的三通道微流体芯片中Y型通道的内直径为0.5-0.7mm，外直径为0.8-1mm；三通道微流体芯片接气流的通道内直径为3.9-4.3mm，外直径为4.3-4.7mm。
优选步骤c中所述的空气压力为0.5-1MPa；步骤c中所述的A，B液两相的流速均为3-10mL/h，且A,B两相流速相同；步骤c中所述的三通道微流体芯片的喷嘴与接收器筛网的距离为20-25cm。
优选步骤c中所述的接收器筛网为聚氨酯筛网、尼龙66筛网或者金属筛网。
优选步骤c中真空干燥的温度为35-50℃；真空干燥时间为8-12h。
优选步骤c中SS的蛋白结构由无规卷曲(结晶指数为0.9)转变为β-折叠结构其结晶指数为0.99-1.02。
优选步骤c中所述的高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜的的纤维直径为86-262nm；面积(长×宽)为4(长)×4(宽)-30(长)×140(宽)cm2；高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜的拉伸强度范围在16.54-19.62MPa。
本发明开发了一种微流控气喷纺丝工艺，首次实现了一种构建由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架，其面积最大可达到(30×140cm2)，纤维直径可达到86-262nm。制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架具有优良的生物可降解、生物相容性以及高机械强度。而且该丝胶蛋白基皮肤组织支架成功地实现了创面愈合和皮肤再生。
有益效果：
1、本发明制备的高分子聚合物/天然聚合物/SS组成的纳米纤维膜定义为丝胶蛋白基皮肤组织支架具有直径大小可调，形貌可控的特点。
2、本发明制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法设备简单，操作方便，且能够实现大规模制备。
3、本发明制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架的拉伸强度经过微流控芯片的高速剪切作用下使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构得到增强，同时提高了SS的稳定性。
4、本发明制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架具有优良的生物相容性和组织相容性。
5、本发明制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架具有丰富的多孔结构和高表面积，可以促进细胞的招募。
6、本发明制备的丝胶蛋白基皮肤组织支架可以促进胶原沉积和肉芽组织的形成，有效预防全层皮肤缺损创面感染。
附图说明
图1为实施例1所使用的三通道微流体芯片实物图；
图2为实施例1制备的APU/CS/SS组成的纳米纤维膜的SEM图；
图3为实施例1制备的大面积APU/CS/SS组成的纳米纤维膜的实物图
(30×140cm2)；
图4为实施例1制备的丝胶蛋白基皮肤支架用于验证其抗菌性能的分析图；其中a.不同材料对大肠杆菌和葡萄球菌的抑菌环实验实物图，b.不同材料对大肠杆菌和葡萄球菌的抑菌环面积大小，左边是大肠杆菌，右边是葡萄球菌；
图5为实施例1制备的丝胶蛋白基皮肤支架用于验证其生物相容性性能的分析图；a.不同材料对成纤维细胞的活死染色实验，b.不同材料对成纤维细胞培养的细胞存活率；
图6为实施例1制备丝胶蛋白基皮肤支架应用于治疗大鼠创面的实物图。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅限于以下实例。
实施例1
将10g质量浓度为40wt％醇溶性聚氨酯(APU)溶液加入到含有30g醇溶剂的烧杯中进行搅拌稀释均匀，得到质量浓度为10wt％APU纺丝溶液；将0.5g的壳聚糖(CS)粉末和0.5g水溶性丝胶蛋白(SS)加入到含有49g甲酸(FA)的容器中在室温下搅拌至溶液状态，从而得到2wt％的CS/SS纺丝液。然后将10wt％的APU纺丝液作为A液，2wt％的CS/SS的纺丝液作为B液，然后将A液和B液分别注入到两个注射器中并固定在微流体注射泵上，将尺寸为4.5×2.5×0.5cm3的三通道型芯片(Y型芯片的交叉口处再接一个气流通道形成三通道微流体芯片)的Y型芯片的两个接头通过软管和A，B两个注射器进行连接(Y型的两个通道的内外直径分别为0.5mm，0.8mm)，将气流接在三通道微流体芯片的第三个通道处(气流通道内外直径为3.9mm，4.3mm)，如图1显示了该三通道微流体芯片。然后进行微流体气喷纺丝技术，在纺丝过程中，设置0.5MPa的空气压力，将A，B液两相的流速均调至为3mL/h，将三通道微流体芯片的喷嘴与接收器调至20cm的距离，然后纳米纤维收集在接收器尼龙66筛网上。同时Y型芯片的A液和B液在微流体芯片的高速剪切作用下发生剪切使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，结晶指数由0.9转变为1.02，得到含有由β-折叠结构的APU/CS/SS组成的纳米纤维膜，这种纳米纤维膜的纤维直径在88-116nm之间，如图2展示了纳米纤维膜的SEM图；然后将纳米纤维膜在35℃下真空干燥8h，去除残余FA，最终得到由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架，其面积大小为30×140cm2(图3)，机械强度大小为16.54MPa。然后通过细胞实验验证丝胶蛋白基皮肤组织支架的生物相容性以及抗菌性能。图4a展示了不同材料对大肠杆菌和葡萄球菌的抑菌环实验实物图，图4b结果显示不同材料对大肠杆菌和葡萄球菌的抑菌环面积大小，其中APU/CS/SS组成的纳米纤维膜的抑菌环直径对大肠杆菌和葡萄球菌最大，表明其抑菌效果最好。图5a显示了不同材料对成纤维细胞的活死染色实验，图5b结果显示APU/CS/SS纳米纤维支架组培养的成纤维细胞的细胞存活率达到95.7％，表明其优良的细胞相容性。最后图6展示了创面愈合实验记录图，从图中可以看出APU/CS/SS纳米纤维支架治疗的大鼠创面在第10天伤口基本愈合。
实施例2
将3g聚己内酯(PCL)溶液加入到含有22g甲酸溶剂的烧杯中进行搅拌稀释均匀，得到质量浓度为12wt％PCL纺丝溶液；将1g的壳聚糖(CS)粉末和1.5g水溶性丝胶蛋白(SS)加入到含有97.5g水的容器中在室温下搅拌至溶液状态，从而得到2.5wt％的CS/SS纺丝液。然后将12wt％的PCL纺丝液作为A液，2.5wt％的CS/SS的纺丝液作为B液，然后将A液和B液分别注入到两个注射器中并固定在微流体注射泵上，将尺寸为4.5×2.5×0.5cm3的三通道型芯片(Y型芯片的交叉口处再接一个气流通道形成三通道微流体芯片)的Y型芯片的两个接头通过软管和A，B两个注射器进行连接(Y型的两个通道的内外直径分别为0.5mm，0.8mm)，将气流接在三通道微流体芯片的第三个通道处(气流通道内外尺寸为3.9mm，4.3mm)。然后进行微流体气喷纺丝技术，在纺丝过程中，设置0.75MPa的空气压力，将A，B液两相的流速均调至为5mL/h，将三通道微流体芯片的喷嘴与接收器调至23cm的距离，然后纳米纤维收集在接收器聚氨酯筛网上。同时Y型芯片的A液和B液在微流体芯片的高速剪切作用下发生剪切使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，结晶指数由0.9转变为1.0，得到含有由β-折叠结构的PCL/CS/SS组成的纳米纤维膜，这种纳米纤维膜的纤维直径在110-180nm之间；然后将纳米纤维膜在45℃下真空干燥10h，去除残余FA，最终得到由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架，其面积大小为30×140cm2，机械强度大小为18.54MPa。然后通过细胞实验验证丝胶蛋白基皮肤组织支架的生物相容性和细胞毒性，将PCL/CS/SS纳米纤维支架同成纤维细胞共培养三天，发现其在三天后存活率仍然达到96％。此外，PCL/CS/SS纳米纤维支架具有优良的生物相容性和抗菌性能，其中PCL/CS/SS组成的纳米纤维膜的抑菌环直径对大肠杆菌和葡萄球菌最大，可分别达到4.8mm和5mm，表明其抑菌效果最好。最后通过动物实验记录不同纳米纤维支架治疗大鼠创面每天的伤口大小，结果显示通过PCL/CS/SS纳米纤维支架治疗的大鼠在第10天得到完全愈合。此外，我们还通过组织分析，如血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成来验证丝胶蛋白基皮肤组织支架可以有效促进创面全层皮肤的伤口愈合。
实施例3
将3g聚乙烯醇(PVA)加入到含有17g水溶剂的烧杯中进行搅拌稀释均匀，得到质量浓度为15wt％PVA纺丝溶液；将1g的明胶和2g水溶性丝胶蛋白(SS)加入到含有72g甲酸(FA)的容器中在室温下搅拌至溶液状态，从而得到4wt％的CS/SS纺丝液。然后将15wt％的APU纺丝液作为A液，4wt％的CS/SS的纺丝液作为B液，然后将A液和B液分别注入到两个注射器中并固定在微流体注射泵上，将尺寸为4.5×2.5×0.5cm3的三通道型芯片(Y型芯片的交叉口处再接一个气流通道形成三通道微流体芯片)的Y型芯片的两个接头通过软管和A，B两个注射器进行连接(Y型的两个通道的内外直径分别为0.7mm，1mm)，将气流接在三通道微流体芯片的第三个通道处(气流通道内外尺寸为4.3mm，4.7mm)，如图1显示了该三通道微流体芯片。然后进行微流体气喷纺丝技术，在纺丝过程中，设置1MPa的空气压力，将A，B液两相的流速均调至为10mL/h，将三通道微流体芯片的喷嘴与接收器调至25cm的距离，然后纳米纤维收集在接收器金属筛网上。同时Y型芯片的A液和B液在微流体芯片的高速剪切作用下发生剪切使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，结晶指数由0.9转变为0.99，得到含有由β-折叠结构的PVA/明胶/SS组成的纳米纤维膜，这种纳米纤维膜的纤维直径在160-262nm之间；然后将纳米纤维膜在50℃下真空干燥12h，去除残余FA，最终得到由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架，其面积大小为4×4cm2，机械强度大小为19.62MPa。然后通过细胞实验验证丝胶蛋白基皮肤组织支架的生物相容性和细胞毒性，将PVA/明胶/SS纳米纤维支架同成纤维细胞共培养三天，发现其在三天后存活率仍然达到98％。此外，PVA/明胶/SS纳米纤维支架具有优良的生物相容性和抗菌性能，其中PVA/明胶/SS组成的纳米纤维膜的抑菌环直径对大肠杆菌和葡萄球菌最大，可分别达到4.9mm和5.2mm，表明其抑菌效果最好。最后通过动物实验记录不同纳米纤维支架治疗大鼠创面每天的伤口大小，结果显示通过PVA/明胶/SS纳米纤维支架治疗的大鼠在第10天得到完全愈合。此外，我们还通过组织分析，如血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成来验证丝胶蛋白基皮肤组织支架可以有效促进创面全层皮肤的伤口愈合。
Claims (8)
1.一种丝胶蛋白基皮肤组织支架的制备方法，其具体步骤如下：
a.将高分子聚合物加入到溶剂A中进行搅拌稀释均匀，得到一定质量浓度的聚合物纺丝溶液；将天然聚合物和水溶性丝胶蛋白SS加入到溶剂B中搅拌至溶液状态，从而得到天然聚合物-SS纺丝液；其中所述的高分子聚合物为醇溶性聚氨酯、聚己内酯或者聚乙烯醇；所述的天然聚合物为壳聚糖或者明胶；
b.将步骤a得到的高分子聚合物纺丝液作为A液，天然聚合物-SS的纺丝液作为B液，然后将A液和B液分别注入到两个注射器中并固定在微流体注射泵上，将三通道微流体芯片的Y型芯片的两个接头通过软管和A，B两个注射器进行连接；将气流接在三通道微流体芯片的第三个通道处；
c.然后通过微流体气喷纺丝技术进行纺丝，在纺丝过程中，设置一定的空气压力，调控A液和B液的流速，将三通道微流体芯片的喷嘴与接收器调至一定的距离，然后纳米纤维收集在接收器筛网上；同时Y型芯片的A液和B液在微流体芯片的高速剪切作用下发生剪切使SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，得到含有由β-折叠结构的高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜，然后将纳米纤维膜真空干燥，得到由无规卷曲向β-折叠结构转变的丝胶蛋白基皮肤组织支架；
其中步骤a中聚合物纺丝溶液中高分子聚合物的质量浓度为10-15%；步骤a中所述的天然聚合物-SS纺丝液的质量浓度为2-4%；其中SS和天然聚合物的质量比为1-2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤a所述的溶剂A为乙醇、甲酸或者水；步骤a中所述的溶剂B为甲酸或者水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中所述的三通道微流体芯片中Y型通道的内直径为0.5-0.7 mm，外直径为0.8-1mm；三通道微流体芯片接气流的通道内直径为3.9-4.3 mm，外直径为4.3-4.7 mm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中所述的空气压力为0.5-1 MPa；步骤c中所述的A，B液两相的流速均为3-10mL/h，且A,B两相流速相同；步骤c中所述的三通道微流体芯片的喷嘴与接收器筛网的距离为20-25 cm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中所述的接收器筛网为聚氨酯筛网、尼龙66筛网或者金属筛网。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中真空干燥的温度为35-50 ℃；真空干燥时间为8-12 h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中SS的蛋白结构由无规卷曲转变为β-折叠结构，其结晶指数为0.99-1.02。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中所述的高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜的纤维直径为86-262 nm；面积长×宽为4×4 - 30×140 cm2；高分子聚合物-天然聚合物-SS组成的纳米纤维膜的拉伸强度范围在16.54-19.62 MPa。
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