CN115487359B - 一种促血管生成的膀胱组织工程补片、其制法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促血管生成的新型膀胱组织工程补片、其制法及应用，所述补片包括外层膜和内层膜，所述外层膜的边缘与内层膜的边缘经热压结合在一起形成一空腔，所述空腔内填充有血管内皮生长因子以及包封血小板源性生长因子的微球；所述内层膜和微球的材质均为可降解天然高分子生物材料，所述外层膜的材质为可降解合成高分子聚合物。本发明提供了一种兼具良好机械性能和生物相容性的组织工程膀胱补片，将其应用于临床膀胱修复，既能实现形态学修补，又能展现出良好的促血管化作用。

Description

一种促血管生成的膀胱组织工程补片、其制法及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种促血管生成的新型膀胱组织工程补片、其制法及应用。
背景技术
先天疾病(如膀胱外翻)或者炎症、创伤、肿瘤等都可能引起膀胱结构和功能的缺损。临床上进行膀胱修复重建的“金标准”是肠道代膀胱，但是因为肠壁组织的固有特性，常常导致感染、结石形成、尿瘘甚至癌变等并发症。组织工程的出现为膀胱修复重建提供了新的方向。组织工程膀胱研究的基本思路是，在体外大规模扩增膀胱种子细胞，再将其种植到支架材料上，在体外构建组织工程膀胱壁，然后植入体内以进行膀胱修复和重建。
现有的组织工程膀胱补片，补片多为单层结构或者单一材料构成，应用后会出现因机械强度不够导致的膀胱破裂、因组织相容性不良导致的膀胱结石等。因为膀胱壁本身是具有多重功能的多层结构，粘膜层能够防护尿液侵蚀、粘膜下层能提供丰富的血供、肌层能够完成收缩和舒张功能、浆膜层能够有效保护膀胱内部结构，故而单层的组织工程补片就会出现机械强度不够、不适宜细胞粘附、血供的不足。在材料应用方面，天然材料多数机械强度较差，需用特殊方法制备或者改性后才能满足膀胱的机械性能要求，但是这类材料生物相容性好，并且易于降解；而人工合成材料生物相容性和降解性能都不如天然材料，但机械性能较好，不用经过特殊处理就能够达到膀胱的机械性能要求。
此外，从2006年Atlas的第一例人体组织工程膀胱替代手术开始，膀胱组织工程的临床研究发现诸多问题，其中最突出的就是组织工程膀胱血管化。研究表明，组织内毛细血管周围氧气和养分的扩散极限是200um，组织工程膀胱移植物进入体内后因为血管化不足引起缺血缺氧和代谢产物堆积，最终导致移植物萎缩及坏死。因此，实现组织工程膀胱移植物快速及有效的血管化是保障其存活，乃至后续的形态结构和生理功能的重要前提。使用大网膜孵育组织工程移植物是目前较常用的促进血管化的方法。
随着对组织生长微环境研究的深入，逐渐发现生长因子在血管化中起到重要的作用。生长因子是一类小分子多肽，通过结合细胞膜上特定的受体，诱发和促进体内的级联事件而调控细胞的行为，最终影响组织的生长。将促血管生长因子应用于组织工程膀胱的构建过程中，通过其对移植物微环境的调控来实现血管的生成和成熟具有良好的前景。
但是，现有的组织工程膀胱补片，生长因子与材料的结合存在不足之处。生长因子是一种小分子多肽或者蛋白质，性质不稳定，在体内半衰期很短，所以在应用时需特别谨慎。目前常见的加载生长因子方式有两种：第一种是物理结合，通过直接浸泡或者物理吸附的方法将生长因子加载到材料上，这种方法比较简单，但是存在加载量不确切，结合强度低的缺点，容易造成生长因子的浪费；第二种是化学结合，通过化学反应或者交联剂将生长因子加载到材料上，这种方法结合强度高，但是方法复杂，而且化学反应可能影响生长因子的生物活性。另外，目前对于组织工程膀胱血管化研究多数应用一种生长因子，比如如果只应用血管内皮生长因子(VEGF)，则生成的血管多数为不成熟的血管：血管壁薄，内皮细胞连接不紧密，容易造成血液渗漏。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种兼具良好机械性能和生物相容性的组织工程膀胱补片，将其应用于临床膀胱修复，既能实现形态学修补，又能展现出良好的促血管化作用。
为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种促血管生成的新型膀胱组织工程补片，包括外层膜和内层膜，所述外层膜的边缘与内层膜的边缘经热压结合在一起形成一空腔，所述空腔内填充有血管内皮生长因子以及包封血小板源性生长因子的微球；所述内层膜和微球的材质均为可降解天然高分子生物材料，所述外层膜的材质为可降解合成高分子聚合物。
本发明提供的促血管生成的新型膀胱组织工程补片：1、外层膜的作用在于模拟膀胱壁的浆膜层，材质为可降解合成高分子聚合物，能够有效满足膀胱的机械性能要求，避免移植后膀胱破裂的可能；内层膜的作用在于模拟膀胱壁的粘膜层，材质为可降解天然高分子生物材料，生物相容性好，它位于膀胱腔内，能为周围细胞的生长和粘附提供良好的支撑。所述双层结构复合材料膀胱补片，相较于传统单层结构或者单一材料膀胱补片，其更接近天然膀胱壁基本结构构成，且兼具两种材料的性能优势，可提供优异的机械强度和生物相容性。
2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，生物学功能包括：a、是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生。尤其是在低氧环境下，VEGF与内皮细胞膜上VEGF受体结合，引起受体的自身磷酸化，从而激活有丝分裂原活化蛋白激酶，实现VEGF的有丝分裂原特性，诱导内皮细胞增生。b、在低氧环境下，VEGF通过提高血浆酶原活化因子(PA)和血浆酶原活化因子抑制因子-l(PAI-1)的mRNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成。c、是最强的可增加血管通透性的物质之一，是通过细胞小囊泡器来实现的。其特点是作用迅速、持续时间短。d、在低氧环境下，VEGF可以诱导血浆蛋白溶酶原激活物和血浆溶酶原激活物抑制剂-1，以及基质胶原酶、诱导组织因子等在内皮细胞的表达，激发V3因子从内皮细胞中释放出来，从而改变细胞外基质，使其更易于血管生长。
血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一种可刺激结缔组织增生的常见肽类调节因子，由骨髓巨噬细胞合成，贮存于血小板Q颗粒中。PDGF是碱性糖蛋白，分子量为28～35kD，是由两亚基(A链和B链)通过二硫键结合而成的两条多肽链的二聚体。PDGF是一种重要的促细胞分裂剂，能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞等多种细胞的分裂和增殖，对个体发育、细胞分化具有调节作用，在创伤愈合中作用突出。
未被包封的血管内皮生长因子会先行释放，而包封以后的血小板源性生长因子由于微球的阻隔，释放缓慢，进而形成了时序递送，从而模拟体内血管生成时两种生长因子的释放顺序，有效促进血管生成。
3、微球的材质为可降解天然高分子生物材料，生物相容性好，能做到生长因子稳定缓慢释放。
进一步地，所述可降解合成高分子聚合物选自聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的任意一种。
进一步地，所述可降解天然高分子生物材料为丝素蛋白，所述可降解合成高分子聚合物为聚己内酯。
本发明所述促血管生成的新型膀胱组织工程补片的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备外层膜：将聚己内酯溶于四氢呋喃中，制成浓度为10-14.3％w/v的聚己内酯溶液，将所述聚己内酯溶液进行静电纺丝，得外层膜；
(2)制备内层膜：取丝素蛋白原液，加水稀释或聚乙二醇浓缩成浓度为5-10％w/v的丝素蛋白溶液，将所述丝素蛋白溶液进行静电纺丝，得内层膜；
(3)制备包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球：
a、取丝素蛋白原液，加水稀释成浓度为0.5-5％w/v的丝素蛋白溶液；将聚乙烯醇溶于水中，制成浓度为0.5-5％w/v的聚乙烯醇溶液；
b、先将丝素蛋白溶液与血小板源性生长因子混合，得预混液，再将预混液与聚乙烯醇溶液混合，超声使均匀，之后倒入培养皿中并置于烘箱中使干燥，得干燥薄膜；其中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:2-200ng，预混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:4；
c、取干燥薄膜，加水使溶解后离心去上清，干燥后，得包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球；
(4)制备促血管生成的新型膀胱组织工程补片：将内层膜平铺，向平铺以后的内层膜的中间区域加入包括血管内皮生长因子和包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球在内的填充料，然后在填充料表面铺入外层膜，使用热退火设备，将内层膜的边缘和外层膜的边缘热压，即得所述促血管生成的新型膀胱组织工程补片。
本发明提供的制备方法，将血管内皮生长因子和包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球巧妙地封存于两层膜边缘部分热压结合在一起形成的空腔之中。与传统的生长因子和补片材料结合方法相比，既避免了化学结合对生长因子活性的影响，同时又能保证生长因子稳定和足量的加载，避免生长因子浪费。
进一步地，步骤(1)中，所述聚己内酯溶液的浓度为14.3％w/v；所述静电纺丝中，设置电压13kV，推进器速度2.5ml/h，注射器出口直径18G，旋转轴表面速度0～10m/s；
进一步地，步骤(2)中，所述丝素蛋白溶液的浓度为10％w/v；所述静电纺丝中，设置电压19kV，推进器速度0.7ml/h，注射器出口直径21G，旋转轴表面速度0～10m/s。
进一步地，步骤(a)中，所述丝素蛋白溶液的浓度为5％w/v，所述聚乙烯醇溶液的浓度为5％w/v；
和/或，步骤(b)中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:200ng；所述干燥的温度为60℃，所述干燥的时间为24h；所述超声为25％振幅作用30s；
和/或，步骤(c)中，所述离心为11000rpm、4℃离心20min。
进一步地，步骤(4)中，所述热退火设备的温度设定为60℃。
本发明所述促血管生成的新型膀胱组织工程补片在制备膀胱修复材料中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的促血管生成的新型膀胱组织工程补片，使用可降解合成高分子聚合物和可降解天然高分子生物材料构建复合双层支架，兼具两者的性能优势。外层为坚韧的可降解合成高分子聚合物静电纺丝层，能够有效满足膀胱的机械性能要求，避免移植后膀胱破裂的可能。内层为生物相容性好的可降解天然高分子生物材料静电纺丝层，它位于膀胱腔内，能为周围细胞的生长和粘附提供良好的支撑。
2、本发明提供的促血管生成的新型膀胱组织工程补片，将血管内皮生长因子和包封血小板源性生长因子的微球巧妙地封存于两层膜边缘部分热压结合在一起形成的空腔之中。与传统的生长因子和补片材料结合方法相比，既避免了化学结合对生长因子活性的影响，同时又能保证生长因子稳定和足量的加载，避免生长因子浪费。
3、本发明提供的促血管生成的新型膀胱组织工程补片，引入了血管内皮生长因子和包封血小板源性生长因子的微球构建的生长因子时序释放系统，血管内皮生长因子先行释放，释放时间10天左右，其通过静电纺丝膜的孔隙或者随着静电纺丝膜材料的降解快速渗透到周围组织中，在血管生成的起始阶段发挥重要作用；血小板源性生长因子由于包封于微球中，释放缓慢，释放时间30天以上，在血管生成的成熟阶段发挥作用，两者时序性释放促进血管生成效果显著。传统使用大网膜包埋促血管化需要先将补片放入研究对象大网膜内，7天后再次手术取出被大网膜包裹好的补片，之后再进行器官修补手术。此过程需要对研究对象多进行二次手术操作，需要更多的时间成本，并且创伤较大。而采用本发明加载生长因子的补片，则无需补片大网膜包埋和取出，在节省时间的同时也避免研究对象二次创伤的发生。将其应用于临床膀胱重建或者创伤膀胱修复，能够迅速建立移植物血供，并且为破损的膀胱提供强韧的力学支撑，简单快捷，适合量产应用。
附图说明
图1：包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球形态；
图2：5％包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球包封率；
图3：5％包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球血小板源性生长因子累计释放；
图4：本发明实施例1促血管生成的新型膀胱组织工程补片的结构示意图；
图5：本发明实施例1促血管生成的新型膀胱组织工程补片的截面示意图；
图6：本发明实施例1补片的live/dead检测；
图7：本发明实施例1补片的CCK8检测；
图4～图5中：1-外层膜；2-内层膜；3-包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球；4-血管内皮生长因子；5-血小板源性生长因子；6-空腔；
图6中：A:本发明膀胱组织工程补片组；B:对照组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种促血管生成的新型膀胱组织工程补片，如图4～5所示，包括外层膜1和内层膜2，外层膜1的边缘与内层膜2的边缘经热压结合在一起形成一空腔6，空腔6内填充有血管内皮生长因子4以及包封血小板源性生长因子5的微球3；内层膜2和微球3的材质均为丝素蛋白，外层膜1的材质为聚己内酯；
本实施例提供的促血管生成的新型膀胱组织工程补片的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备外层膜：将聚己内酯溶于四氢呋喃中，制成浓度为14.3％w/v的聚己内酯溶液，将所述聚己内酯溶液注入10ml注射器中，接入静电纺丝设备，设置电压13kV，推进器速度2.5ml/h，注射器出口直径18G，样品收集到旋转轴上，旋转轴表面速度0～10m/s，得厚度500um、纤维平均直径250nm的外层膜；
(2)制备内层膜：取丝素蛋白原液，使用聚乙二醇浓缩至浓度为10％w/v，注入10ml注射器中，接入静电纺丝设备，设置电压19kV，推进器速度0.7ml/h，注射器出口直径21G，样品收集到旋转轴上，旋转轴表面速度0～10m/s，得厚度500um、纤维平均直径180nm的内层膜；
(3)制备包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球：
a、取丝素蛋白原液，加水稀释成浓度为5％w/v的丝素蛋白溶液；将聚乙烯醇溶于水中，制成浓度为5％w/v的聚乙烯醇溶液；
b、先将丝素蛋白溶液与血小板源性生长因子混合，得预混液，再将预混液与聚乙烯醇溶液混合，超声25％振幅作用30s，之后倒入培养皿中并置于60℃烘箱中使干燥24h，得干燥薄膜；其中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:200ng，预混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:4；
c、小心将干燥的膜从培养皿内揭下，置入50ml离心管中并加入20ml去离子水，将离心管置于摇床上室温摇晃30min使其充分溶解。将离心管放入离心机11000rpm、4℃离心20min去上清，再加入5ml去离子水将微球重悬，然后冷冻干燥24h，得到包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球粉末；
(4)制备促血管生成的新型膀胱组织工程补片：将内层膜平铺，向平铺以后的内层膜的中间区域加入包括10ul血管内皮生长因子和10ul包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球的水溶液(微球的浓度为50mg/ml)在内的填充料，然后在填充料表面铺入外层膜，使用热退火设备，温度设定为60℃，将内层膜的边缘和外层膜的边缘热压，即得所述促血管生成的新型膀胱组织工程补片。
实施例2
本实施例提供一种促血管生成的新型膀胱组织工程补片，与实施例1的区别在于，制备方法包括如下步骤：
(1)制备外层膜：将聚己内酯溶于四氢呋喃中，制成浓度为10％w/v的聚己内酯溶液，将所述聚己内酯溶液注入10ml注射器中，接入静电纺丝设备，设置电压13kV，推进器速度2.5ml/h，注射器出口直径18G，样品收集到旋转轴上，旋转轴表面速度0～10m/s，得厚度500um、纤维平均直径250nm的外层膜；
(2)制备内层膜：取丝素蛋白原液，加水稀释至浓度为5％w/v，注入10ml注射器中，接入静电纺丝设备，设置电压19kV，推进器速度0.7ml/h，注射器出口直径21G，样品收集到旋转轴上，旋转轴表面速度0～10m/s，得厚度500um、纤维平均直径180nm的内层膜；
(3)制备包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球：
a、取丝素蛋白原液，加水稀释成浓度为0.5％w/v的丝素蛋白溶液；将聚乙烯醇溶于水中，制成浓度为0.5％w/v的聚乙烯醇溶液；
b、先将丝素蛋白溶液与血小板源性生长因子混合，得预混液，再将预混液与聚乙烯醇溶液混合，超声25％振幅作用30s，之后倒入培养皿中并置于60℃烘箱中使干燥24h，得干燥薄膜；其中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:2ng，预混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:4；
c、小心将干燥的膜从培养皿内揭下，置入50ml离心管中并加入20ml去离子水，将离心管置于摇床上室温摇晃30min使其充分溶解。将离心管放入离心机11000rpm、4℃离心20min去上清，再加入5ml去离子水将微球重悬，然后冷冻干燥24h，得到包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球粉末；
(4)制备促血管生成的新型膀胱组织工程补片：将内层膜平铺，向平铺以后的内层膜的中间区域加入包括10ul血管内皮生长因子和10ul包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球的水溶液(微球的浓度为50mg/ml)在内的填充料，然后在填充料表面铺入外层膜，使用热退火设备，温度设定为60℃，将内层膜的边缘和外层膜的边缘热压，即得所述促血管生成的新型膀胱组织工程补片。
本发明各实施例制备的包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球形态圆整，粒度分布均匀，见图1，包封率高，达到99％以上，见图2。
使用Elisa试剂盒检测5％包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球1d、3d、7d、14d、21d的累积释放量并绘制累积释放曲线，见图3，从曲线可看出第1d存在血小板源性生长因子的爆发性释放，之后呈现缓慢持续的释放。
live/dead染色是检验材料生物相容性的常用方法。通过染色，活细胞呈现绿色荧光，死细胞呈现红色荧光。本发明实施例制备的膀胱组织工程补片组和对照组分别使用补片浸提液和正常培养基培养细胞。在第1d、3d、5d分别染色，可见膀胱组织工程补片组细胞绝大多数都是活细胞，与对照组无明显差别，见图6，说明补片细胞毒性小，生物相容性好。
CCK8检测也是检验材料生物相容性的常用方法。它的原理是使用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8)对培养细胞的增值活性进行检测，细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色越浅。颜色的深浅通过酶标仪来检测吸光度。补片组和对照组分别使用补片浸提液和正常培养基培养细胞。在第0d、1d、3d、5d、7d分别检测吸光度，可见补片组细胞增殖速度良好，与对照组无明显差别，见图7，说明该补片细胞毒性小，适于细胞生长增殖，生物相容性好。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.促血管生成的膀胱组织工程补片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备外层膜：将聚己内酯溶于四氢呋喃中，制成浓度为10-14.3％w/v的聚己内酯溶液，将所述聚己内酯溶液进行静电纺丝，得外层膜；
(2)制备内层膜：取丝素蛋白原液，加水稀释或聚乙二醇浓缩成浓度为5-10％w/v的丝素蛋白溶液，将所述丝素蛋白溶液进行静电纺丝，得内层膜；
(3)制备包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球：
a、取丝素蛋白原液，加水稀释成浓度为0.5-5％w/v的丝素蛋白溶液；将聚乙烯醇溶于水中，制成浓度为0.5-5％w/v的聚乙烯醇溶液；
b、先将丝素蛋白溶液与血小板源性生长因子混合，得预混液，再将预混液与聚乙烯醇溶液混合，超声使均匀，之后倒入培养皿中并置于烘箱中使干燥，得干燥薄膜；其中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:2-200ng，预混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:4；
c、取干燥薄膜，加水使溶解后离心去上清，干燥后，得包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球；
(4)制备促血管生成的膀胱组织工程补片：将内层膜平铺，向平铺以后的内层膜的中间区域加入包括血管内皮生长因子和包封血小板源性生长因子的丝素蛋白微球在内的填充料，然后在填充料表面铺入外层膜，使用热退火设备，将内层膜的边缘和外层膜的边缘热压，即得所述促血管生成的膀胱组织工程补片。
2.根据权利要求1所述促血管生成的膀胱组织工程补片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚己内酯溶液的浓度为14.3％w/v；所述静电纺丝中，设置电压13kV，推进器速度2.5ml/h，注射器出口直径18G，旋转轴表面速度0～10m/s。
3.根据权利要求1所述促血管生成的膀胱组织工程补片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述丝素蛋白溶液的浓度为10％w/v；所述静电纺丝中，设置电压19kV，推进器速度0.7ml/h，注射器出口直径21G，旋转轴表面速度0～10m/s。
4.根据权利要求1所述促血管生成的膀胱组织工程补片的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述丝素蛋白溶液的浓度为5％w/v，所述聚乙烯醇溶液的浓度为5％w/v；
和/或，步骤(b)中，丝素蛋白溶液的体积与血小板源性生长因子的质量之比为1mL:200ng；所述干燥的温度为60℃，所述干燥的时间为24h；所述超声为25％振幅作用30s；
和/或，步骤(c)中，所述离心为11000rpm、4℃离心20min。
5.根据权利要求1所述促血管生成的膀胱组织工程补片的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述热退火设备的温度设定为60℃。
6.权利要求1-5任一项所述的制备方法所得的促血管生成的膀胱组织工程补片在制备膀胱修复材料中的应用。
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