CN115487263B - 一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法 - Google Patents

一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制6‑磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)的韭菜子提取物的制备方法及其应用，本发明从韭菜子中提取、纯化得到韭菜子提取物，并采用基于6‑磷酸葡萄糖脱氢酶抑制的抗肿瘤天然产物体外筛选模型对其活性进行评价，结果显示，本发明制备的韭菜子提取物对G6PD具有显著的抑制作用，为韭菜子提取物作为抗肿瘤药物用途及其作用机制提供了方法。

Description

一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的抗肿瘤中药提取物及其应用，该中药提取物从韭菜子中提取、纯化获得，具有抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性，可应用于抗肿瘤药物的开发。
背景技术
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)是磷酸戊糖(PPP)途径过程中的关键酶，该途径所生产的5-磷酸核糖和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)是生命物质的合成原料。5-磷酸核糖是细胞增殖分化的重要生物原料。NADPH作为供氢体(还原剂)可参与体内多种代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，药物、毒素、某些激素等生物转化，NADPH还是细胞内氧化还原稳态的关键调节因子。G6PD的活性能够直接反映氧化分支的通量，决定糖酵解与PPP之间的通量分配。高G6PD活性有望增加细胞分裂和增殖所需的脂类和DNA的生物合成。而快速增殖的细胞或癌细胞通常通过激活G6PD来增加PPP通量，最终达到满足增殖过程中的生物能量的需求。大量研究表明，G6PD基因在很多肿瘤细胞中过表达，造成肿瘤快速增殖。恶性肿瘤是三大致死疾病之一，严重危害居民健康。因此，寻找有效且副作用小的G6PD抑制剂，为开发抗癌新药奠定基础。
韭菜子为百合科植物韭菜Allium tuberosum RottL.ex Spreng.的干燥成熟种子。秋季果实成熟时采收果序，晒干，搓出种子，除去杂质。中医认为，韭菜子辛、甘，温。归肝、肾经。具有温补肝肾，壮阳固精。用于肝肾亏虚，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，白浊带下的功能。现代研究表明，韭菜子主要含有生物碱、挥发油、皂苷及蛋白质、氨基酸、油脂类成分以及腺苷、尿苷等核苷类成分，具有增强免疫、抗氧化、抗衰老、治疗牙痛等作用。虽然有研究表明不同浓度韭菜子总皂苷水解产物对Hela细胞均有细胞毒性，但并未见有文献报道韭菜子中有成分通过抑制G6PD活性发挥抗肿瘤作用。亦有专利涉及6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂通过改善抑制性肿瘤免疫微环境增强PD-L1单克隆抗体抗肿瘤效果的应用，例如中国发明专利申请202111201846.8公开了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂的医药用途，该专利中6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂为一种放疗增敏剂使用，用于提高提高PD-L1单抗治疗效果，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂选自去氢表雄酮(DHEA)、6-氨基烟酰胺(6-AN)、1-溴乙酰基-3，3-二硝基氮杂环丁烷(RRx-001)中的一种或几种，并未涉及韭菜子提取物。
比较典型的G6PD抑制剂有DHEA、6-AN、RRx-001、虎杖苷(Polydatin)等。但是DHEA被证明进入体内后会被代谢分解掉，产生活性雄激素，从而无法真正起到作用。6-AN则是具有一定副作用，包括神经损伤和导致维生素B缺乏等。RRx-001虽然是G6PD抑制剂，但经过研宄证明，其抗肿瘤机制本质上不是针对G6PD起作用，而是通过与血红蛋白(Hb)和谷胱甘肽(GSH)结合，同时产生强细胞毒性的活性氧氮类物质(RONS)来发挥抗肿瘤作用的。Polydatin的活性则是比较弱。所以，目前G6PD的抑制剂仍旧是亟待开发的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制G6PD的韭菜子提取物的制备方法及其应用。本发明选择以韭菜子为研究对象，通过对原料的处理、提取、纯化、体外活性筛选，进一步从韭菜子中获得G6PD抑制组分，为研究韭菜子抗肿瘤机理及开发抗肿瘤药物提供方法及理论依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，其具体包括如下步骤：
(1)药材提取：将粉碎后的韭菜子、或盐韭菜子用8～12倍量10％～40％乙醇溶液浸泡1～2h，随后在400-500W条件下，超声提取1～2次，每次30～60min，过滤，收集滤液得提取液；
(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液在40～60℃温度下减压浓缩干燥，得韭菜子粗提物JCZ-E；
(3)纯化制备：取上述韭菜子粗提物JCZ-E加入10倍量超纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取所得水层部位用大孔吸附树脂吸附4h，然后依次用3倍柱体积的不同浓度的乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液；
(4)浓缩干燥：将上述收集的洗脱液分别在40～60℃下减压浓缩干燥即得韭菜子不同洗脱部位的提取物；定量称取不同洗脱部位提取物，加浓度为0～10％二甲基亚砜复溶于35％乙醇中，4℃保存。
进一步地，步骤(4)中分别采用15％、35％、55％、75％的乙醇进行梯度洗脱，得到对应的洗脱液。
进一步地，步骤(4)中分别采用35％、55％的乙醇进行洗脱，得到对应的洗脱液。
本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的韭菜子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明选择以韭菜子为研究对象，通过对原料的处理、提取、纯化、体外活性筛选，进一步从韭菜子中获得G6PD抑制组分，为研究韭菜子抗肿瘤机理及开发抗肿瘤药物提供方法及理论依据。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)药材提取：将粉碎后的韭菜子用8倍量25％乙醇溶液浸泡1.5h，随后在500W条件下超声提取2次，每次45min，过滤，收集滤液得提取液；
(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液在60℃温度下减压浓缩干燥，得韭菜子粗提物JCZ-E；
(3)纯化制备：取上述韭菜子粗提物JCZ-E加入10倍量超纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取所得水层部位用AB-8大孔吸附树脂吸附4h，然后依次用3倍柱体积的水、15％、35％、55％、75％、95％乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液；
(4)浓缩干燥：将上述收集的洗脱液60℃下减压浓缩干燥即得韭菜子不同洗脱部位的提取物——JCZ-1、JCZ-2、JCZ-3、JCZ-4、JCZ-5、JCZ-6。定量称取不同洗脱部位提取物，加5％ DMSO复溶于35％乙醇中，4℃保存待用；
(5)G6PD抑制剂筛选：采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)酶活测定的方法。在一定温度、pH条件下，G6PD催化6-磷酸葡萄糖(G6P)反应过程中伴随将无紫外吸收的氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)转化成有紫外吸收的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，通过测定每分钟340nm波长处吸光度值的变化，计算NADPH的生产速率。可根据NADPH生产速率的变化判定样品对酶的激活/抑制能力。
(6)通过计算得到韭菜子粗提物及不同洗脱部位提取物对G6PD活性抑制的IC50值见表1，其中JCZ-3和JCZ-4，即35％洗脱部位和55％洗脱部位G6PD抑制活性较其他部位强。
表1 G6PD活性筛选结果
样品 JCZ-E JCZ-1 JCZ-2 JCZ-3 JCZ-4 JCZ-5 JCZ-6
IC50(mg/ml) 6.84 — 3.41 0.91 1.08 3.22 —
注：“—”表示未检测到抑制作用。
实施例2
本实施例提供了一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)药材提取：将粉碎后的韭菜子用10倍量30％乙醇溶液浸泡2h，随后在400W条件下超声提取2次，每次30min，过滤，收集滤液得提取液；
(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液在60℃温度下减压浓缩干燥，得韭菜子粗提物JCZ-E；
(3)纯化制备：取上述韭菜子粗提物JCZ-E加入10倍量超纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取所得水层部位用AB-8大孔吸附树脂吸附4h，然后依次用3倍柱体积的水、15％、35％、55％、75％、95％乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液；
(4)浓缩干燥：将上述收集的洗脱液60℃下减压浓缩干燥即得韭菜子不同洗脱部位的提取物——JCZ-1、JCZ-2、JCZ-3、JCZ-4、JCZ-5、JCZ-6。定量称取不同洗脱部位提取物，加10％ DMSO复溶于35％乙醇中，4℃保存待用；
(5)G6PD抑制剂筛选：采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)酶活测定的方法。在一定温度、pH条件下，G6PD催化6-磷酸葡萄糖(G6P)反应过程中伴随将无紫外吸收的氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)转化成有紫外吸收的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，通过测定每分钟340nm波长处吸光度值的变化，计算NADPH的生产速率。可根据NADPH生产速率的变化判定样品对酶的激活/抑制能力。
(6)通过计算得到韭菜子粗提物及不同洗脱部位提取物对G6PD活性抑制的IC50值见表2，其中JCZ-3和JCZ-4，即35％洗脱部位和55％洗脱部位G6PD抑制活性较其他部位强。
表2 G6PD活性筛选结果
样品 JCZ-E JCZ-1 JCZ-2 JCZ-3 JCZ-4 JCZ-5 JCZ-6
IC50(mg/ml) 6.76 — 3.47 0.90 1.03 3.18 —
注：“—”表示未检测到抑制作用。
实施例3
本实施例提供了一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)药材提取：将粉碎后的韭菜子用12倍量35％乙醇溶液浸泡1h，随后在500W条件下超声提取1次，每次60min，过滤，收集滤液得提取液；
(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液在60℃温度下减压浓缩干燥，得韭菜子粗提物JCZ-E；
(3)纯化制备：取上述韭菜子粗提物JCZ-E加入10倍量超纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取所得水层部位用D101大孔吸附树脂吸附4h，然后依次用3倍柱体积的水、15％、35％、55％、75％、95％乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液；
(4)浓缩干燥：将上述收集的洗脱液60℃下减压浓缩干燥即得韭菜子不同洗脱部位的提取物——JCZ-1、JCZ-2、JCZ-3、JCZ-4、JCZ-5、JCZ-6。定量称取不同洗脱部位提取物，加10％ DMSO复溶于35％乙醇中，4℃保存待用；
(5)G6PD抑制剂筛选：采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)酶活测定的方法。在一定温度、pH条件下，G6PD催化6-磷酸葡萄糖(G6P)反应过程中伴随将无紫外吸收的氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)转化成有紫外吸收的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，通过测定每分钟340nm波长处吸光度值的变化，计算NADPH的生产速率。可根据NADPH生产速率的变化判定样品对酶的激活/抑制能力。
(6)通过计算得到韭菜子粗提物及不同洗脱部位提取物对G6PD活性抑制的IC50值见表3，其中JCZ-3和JCZ-4，即35％洗脱部位和55％洗脱部位G6PD抑制活性较其他部位强。
表3 G6PD活性筛选结果
样品 JCZ-E JCZ-1 JCZ-2 JCZ-3 JCZ-4 JCZ-5 JCZ-6
IC50(mg/ml) 6.81 — 3.53 0.93 1.05 3.24 —
注：“—”表示未检测到抑制作用。
上述实施例仅是对本发明的优选方式进行举例说明，并不包括所有的发明实施范围。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。

Claims (2)

1.一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）药材提取：将粉碎后的韭菜子、或盐韭菜子用8~12倍量10%~40%乙醇溶液浸泡1~2h，随后在400-500W条件下，超声提取1~2次，每次30~60 min，过滤，收集滤液得提取液；
（2）浓缩干燥：将上述过滤后的提取液在40~60 ℃温度下减压浓缩干燥，得韭菜子粗提物JCZ-E；
（3）纯化制备：取上述韭菜子粗提物JCZ-E加入10倍量超纯水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取所得水层部位用大孔吸附树脂吸附4 h，然后依次用3倍柱体积的35%、55%的乙醇进行洗脱，得到对应的洗脱液，分别收集洗脱液；
（4）浓缩干燥：将上述收集的洗脱液分别在40~60 ℃下减压浓缩干燥即得韭菜子不同洗脱部位的提取物；定量称取不同洗脱部位提取物，加浓度为0~10%二甲基亚砜（DMSO）复溶于35%乙醇中，4℃保存。
2.权利要求1所述的制备方法制备得到的韭菜子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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