CN115485287A

CN115485287A - Panx1相关疾病的治疗

Info

Publication number: CN115485287A
Application number: CN202180027091.6A
Authority: CN
Inventors: N·哈尔迪; C·洛佩兹
Original assignee: Nuritas Ltd
Current assignee: Nuritas Ltd
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-12-16
Also published as: MX2022009661A; JP2023512587A; BR112022014844A2; AU2021217787A1; EP4100041A1; US20230158100A1; WO2021156504A1; EP3862014A1; CA3167111A1; KR20220140543A

Abstract

本发明人发现SEQUENCE ID NO:1的肽(WKDEAGKPLVK)靶向PANX1。本发明还涉及用所述肽或包含所述肽的组合物治疗与PANX1相关的疾病。

Description

PANX1相关疾病的治疗

技术领域

本发明涉及在受试者中治疗或预防PANX1相关疾病。

背景技术

泛连接蛋白1(Pannexin 1，PANX1)是由PANX1基因编码的蛋白质，是泛连接蛋白家族的一员。泛连接蛋白家族是一种跨膜(TM)通道蛋白家族，有三个成员，即PANX1、PANX2和PANX3。每个家族成员包含四个α-螺旋TM结构域、两个细胞外环和一个细胞内环(图1)。蛋白质的N和C末端暴露于细胞的细胞质。该蛋白提供

的膜通道孔，允许Ca2+、K⁺、ATP和～1.2kDa分子进出细胞。PANX2和PANX3的表达主要局限于中枢神经系统(CNS)、成纤维细胞和成骨细胞。PANX1在大多数细胞类型中表达，包括肝脏、肾脏、肺胃肠道和胰腺。PANX1主要定位于细胞的质膜。

PANX1通道释放三磷酸腺苷(ATP)，在多种细胞和组织类型的许多正常病理过程中发挥作用。ATP是一种细胞外信号传导分子，提供能量驱动许多细胞过程。疾病状态(例如细胞损伤、高脂血症、缺氧、慢性炎症和/或感染)驱动细胞外(EC)ATP的产生。炎性信号EC ATP产生的增加导致PANX1通道开放的增加。这会刺激ATP细胞外排和Ca2+细胞内流(图2)。这种过多的PANX1信号传导刺激炎性小体组装，促进促炎细胞因子(例如白细胞介素(IL)-1β和IL-18)的释放。这反过来又导致半胱天冬酶激活。失调的促炎细胞因子也可以反过来激活因子，例如TFGβ、TNFα、PDGF。

PANX1影响多种疾病和病症，包括局部缺血、疼痛、纤维化、微生物感染、炎症和癌症，许多研究小组将PANX1作为疾病治疗的靶点进行了研究。研究表明，PANX1与癫痫、神经病理性疼痛、疼痛性肌肉骨骼疾病、缺血性损伤、心肌纤维化、HIV感染、人膀胱过度活动症和癌症有关(Di Wu,et al.,Acta Biochim Biophys Sin,2016)。PANX1水平升高或过度活跃也与疾病相关，包括黑色素瘤、缺血性中风、癫痫、结肠炎、偏头痛、头痛、骨关节炎癫痫等(Laird et al.,Nat Rev Drug Discov.,2018)。

Good等人(Circulation Research,2017)公开了基于PANX1抑制的顽固性高血压治疗模式。该小组研究了PANX1作为高血压药物螺内酯的体内靶点。其他小组已表明高转移癌细胞中PANX1的突变形式。在一项研究中，突变的PANX1通过促进乳腺癌细胞存活而增强ATP释放和提高转移效率(Furlow PW,Nat Cell Biol,2015)。在该研究中，PANX1抑制剂显示可减少转移。

已经研究了PANX1靶向治疗作为减轻关节疼痛的方法(Mousseu et al.,Neurophysiology Science Advances 8Aug 2018)。丙磺舒是一种治疗痛风的药物，已显示可减弱PANX1通道诱导的ATP(Silverman W.,Am J Physiol Cell Physiol,2008)。生胃酮(CBX)，一种PANX1通道抑制剂，是一种治疗胃溃疡的药物(Benefenati V,Channels.,2009)，并已进入亨廷顿舞蹈病试验。

PANX1通道已被研究作为阿片类药物戒断的治疗靶点。该小组发现，阻断PANX1可减轻戒断的严重程度，而不影响阿片类药物的镇痛作用(Burma et al.,Nature Medicine,2017)。Makarenkova HP等人认为，减少泛连接蛋白可能是神经损伤后减轻疼痛和促进再生的有效策略，并暗示PANX1信号传导通路参与炎症遏制。

Feig等人(PLoS ONE 12,2017)报告称，抗病毒药物替诺福韦(PANX1介导ATP释放的抑制剂)可通过下调肝脏和皮肤中的腺苷水平来预防肝脏和皮肤纤维化。CrespoYanguas等人(Arch Toxicol,2018)研究了PANX1在肝纤维化中的作用，并报告化学诱导的肝纤维化增加了PANX1的表达，并且PANX1消融可减弱CCL4诱导的肝纤维化。

Oritiz等人(Perspective 2020)报告了基于泛连接蛋白1的通道作为多发性硬化进展的调节剂的作用。

EP3329930和WO2018/104346公开了包含氨基酸序列WKDEAGKPLVK的肽及其在治疗代谢紊乱(例如糖尿病和以肌肉消耗或蛋白质合成减少为特征的疾病)中的用途。公开了囊性纤维化，但这不是PANX1相关的纤维化。

EP3329905公开了包含氨基酸序列WKDEAGKPLVK的肽用于抗衰老方法。还公开了包含该肽的局部组合物。

本发明提供了用于治疗或预防PANX1相关疾病的令人惊奇地靶向PANX1的药剂。

发明内容

本发明人惊奇地发现，SEQUENCE ID NO.1(WKDEAGKPLVK)的肽靶向PANX1。本发明的肽提供了调节PANX1或PANX1信号传导的方式，并可用于治疗或预防与PANX1相关的疾病或病症。在一个实施方案中，本发明的肽通过阻断或抑制PANX1或PANX1信号传导而引发其作用。

因此，在第一方面，本发明提供了包含SEQUENCE ID NO.1或SEQUENCE ID NO.1的功能性(或治疗有效)变体的肽(以下称为“肽活性剂”或“本发明的肽”)，用于治疗或预防受试者中与PANX1相关的疾病或病症的方法。

在另一个方面，本发明提供了包含含有SEQUENCE ID NO.1或SEQUENCE ID NO.1的治疗有效变体的肽的组合物，用于治疗或预防受试者中与PANX1相关的疾病或病症的方法。

合适地，所述组合物包含多种肽。

在另一方面，本发明涉及在受试者中治疗或预防与PANX1相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含SEQUENCE ID NO:1或SEQUENCE ID NO:1的功能性(或治疗有效)变体的肽(以下称为“肽活性剂”)的步骤。

功能性(或治疗有效)变体可以是SEQUENCE ID NO.1的功能性或治疗片段。

优选地，该疾病或病症选自包含纤维化、黑素瘤、肝癌、肝病、局部缺血、高血压、眼科疾病或病症、微生物感染、肌肉骨骼病症、亨廷顿舞蹈病、脓毒症和多发性硬化的组。

优选地，该疾病或病症可以选自包含炎性疾病或病症、纤维化疾病、癌症、局部缺血和心血管疾病的组。

优选地，该疾病或病症可以选自包含纤维化、黑素瘤、肝癌、局部缺血、高血压和多发性硬化的组。

该疾病可包括但不限于炎性肠病，例如克罗恩病、慢性胃肠(GI)炎症、脓毒症、肝纤维化、皮肤纤维化、肾间质纤维化(renal fibrosis)、肺纤维化、黑素瘤、乳腺癌、肝细胞癌、脑缺血、缺血性中风、疼痛、心肌细胞纤维化、微生物感染、脑炎症、高血压、神经变性疾病和周围神经疾病。

优选地，该肽的长度至多为50个氨基酸。在一个实施方案中，肽具有至多40、35、30、25、20或15个氨基酸。在一个实施方案中，肽具有11至15个氨基酸。

该肽(或功能性变体或片段)可单独施用或与提供提高治疗效果的其他共药物(co-drug)组合施用，该共药物包括但不限于在治疗与PANX1相关的疾病或病症中具有确定效果的药物。

在一个实施方案中，该肽基本上由SEQUENCE ID NO:1组成。

在一个实施方案中，该肽的变体相比于SEQUENCE ID NO:1具有1至8个修饰或改变，该修饰通常独立地选自氨基酸的插入、添加、缺失和取代(理想地为保守取代)。

在一个实施方案中，一个或多个氨基酸(例如1至5、1至4、1至3或1至2个)被D-氨基酸取代。在一个实施方案中，残基1、2、5、10、11中的一个或多个(例如2、3、4或5个残基)被D-氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸被保守氨基酸取代所取代。

在一个实施方案中，功能性或治疗变体具有序列{d}W{d}KDE{d}AGKPL{d}V{d}K(SEQUENCE ID NO.86)，其除了氨基酸1、2、5、10和11被D-型氨基酸取代之外，与SEQUENCEID NO.1相同。

在一个实施方案中，该肽被修饰。在一个实施方案中，该肽是重组肽。在一个实施方案中，该肽被环化。

优选地，通过对侧链的修饰、在肽合成过程掺入非天然氨基酸和/或其衍生物、使用交联剂以及通过与缀合配偶体缀合、通过与融合配偶体融合、与结合配偶体共价连接、脂化、聚乙二醇化(PEG化)和酰胺化对肽施加构象限制的其他方法来修饰肽。

环化肽的一个实例是(1(clac)wKE(Me)EC1GK(Me)PLVk-OH)–SEQUENCE ID NO.87。在该变体中，残基“w”和“k”是D-氨基酸，残基“E”和“P”是甲基化的，并且该肽包含n-末端和半胱氨酸残基之间的硫醚环化，其中“1(clac)”和“C1”表示循环的两端。

优选地，该变体选自SEQUENCE ID NO.2至SEQUENCE ID NO.87和SEQUENCE IDNO.90。

本发明的一个方面提供了肽，其包含选自SEQUENCE ID NO.2至SEQUENCE IDNO.87和SEQUENCE ID NO.90的序列(或由选自SEQUENCE ID NO.2至SEQUENCE ID NO.87和SEQUENCE ID NO.90的序列组成)。包含该序列的肽的长度可至多50个氨基酸。

本发明的其他方面和优选实施方案在下面阐述的其他权利要求中定义和描述。

附图说明

现在将参照附图描述本发明，其中：

图1示出了PANX1、PANX2和PANX3跨膜蛋白。

图2A、B和C示出了在正常稳态(A)、存在细胞外ATP和K+(B)增加以及存在稳态失调和炎症(C)的情况下的PANX1活性。

图3示出了本发明的肽(SEQUENCE ID NO.1的肽)与人膜蛋白的结合亲和力。针对表达5528人血浆膜蛋白的HEK293细胞筛选CY5标记肽(0.01μg/ml和0.05μg/ml)。

图4示出了SEQUENCE ID NO.1的肽可减少永生肝细胞中IL-8的分泌。HepG2细胞用肽(5ng/ml)处理24h，然后用100ng/mL LPS处理24h。所显示的数据是至少2个独立实验的平均值±SEM。(*p<0.05**p<0.01***p<0.001)

图5A和B示出了SEQUENCE ID NO.1的肽在原代人肝星状细胞中显示抗纤维化活性。(A)用肽(5nM)处理前，用TGF-β1处理刺激α-SMA表达的人星状细胞的共焦成像。(B)α-SMA表达的定量。

图6示出了PANX1信号传导介导的各种细胞过程。

图7A和B示出了当通道被激活，通道激活前(A)和激活后(B)肽的细胞内浓度。

图8示出了带有C-末端CY5标记肽(SEQUENCE ID NO.1)(红色)和早期内体标记物(绿色)的荧光共聚焦显微镜检查，EAA1证明该肽在在人骨骼肌细胞中的1小时时间过程中显示出细胞渗透进展。该肽与胞内体的共定位表明，肽与膜结合的细胞外靶结合，并在此后进行内部转运。

图9A、B和C示出了该肽(SEQUENCE ID NO.1)对ATP介导的Ca²⁺离子通量的下调。THP-1细胞的ATP处理导致FITC标记的Ca²⁺离子(A)的检测增加。用1μM的肽对THP-1细胞进行45s预孵育可阻断ATP介导的Ca²⁺离子通量(B)。不依赖于肽且存在肽的情况下，通过流式细胞术检测的FITC荧光单位的比较(C)。

图10A至D示出了通过本发明的肽在APAP急性肝损伤小鼠模型研究中对肝酶变化的预防。APAP在0小时通过IP注射施用。1.5小时后通过IV施用本发明的肽、10PANX1或盐水对照处理。每组各包括5只动物。从2.25和6小时的存活和最终出血测量所有小鼠的ALT和AST水平。在2.25小时时，与APAP/生理盐水处理相比，所有组中施用肽降低了ALT水平(A)，且优于10PANX。与生理盐水/生理盐水组相比，APAP/生理盐水组的ALT和AST均显示增加。数据为平均值±SEM。

具体实施方式

本文中提及的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献均全文引入本文作为参考，用于所有目的，就如每个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独地指出作为参考引入，并且引用其全部内容。

令人惊奇地发现，本发明的肽靶向并结合组织中的PANX1蛋白，并调节与PANX1信号传导相关的细胞过程。以此方式，本发明的肽可用于治疗与PANX1相关的疾病和病症。

PANX1(同种型1)的氨基酸序列如下：

MAIAQLATEYVFSDFLLKEPTEPKFKGLRLELAVDKMVTCIAVGLPLLLISLAFAQEISIGTQISCFSPSSFSWRQAAFVDSYCWAAVQQKNSLQSESGNLPLWLHKFFPYILLLFAILLYLPPLFWRFAAAPHICSDLKFIMEELDKVYNRAIKAAKSARDLDMRDGACSVPGVTENLGQSLWEVSESHFKYPIVEQYLKTKKNSNNLIIKYISCRLLTLIIILLACIYLGYYFSLSSLSDEFVCSIKSGILRNDSTVPDQFQCKLIAVGIFQLLSVINLVVYVLLAPVVVYTLFVPFRQKTDVLKVYEILPTFDVLHFKSEGYNDLSLYNLFLEENISEVKSYKCLKVLENIKSSGQGIDPMLLLTNLGMIKMDVVDGKTPMSAEMREEQGNQTAELQGMNIDSETKANNGEKNARQRLLDSSC(SEQUENCE ID NO.88)。

PANX1的同种型2具有以下序列：

MAIAQLATEYVFSDFLLKEPTEPKFKGLRLELAVDKMVTCIAVGLPLLLISLAFAQEISIGTQISCFSPSSFSWRQAAFVDSYCWAAVQQKNSLQSESGNLPLWLHKFFPYILLLFAILLYLPPLFWRFAAAPHICSDLKFIMEELDKVYNRAIKAAKSARDLDMRDGACSVPGVTENLGQSLWEVSESHFKYPIVEQYLKTKKNSNNLIIKYISCRLLTLIIILLACIYLGYYFSLSSLSDEFVCSIKSGILRNDSTVPDQFQCKLIAVGIFQLLSVINLVVYVLLAPVVVYTLFVPFRQKTDVLKVYEILPTFDVLHFKSEGYNDLSLYNLFLEENISEVKSYKCLKVLENIKSSGQGIDPMLLLTNLGMIKMDVVDGKTPMSAEMREEQGNQTAELQDSETKANNGEKNARQRLLDSSC(SEQUENCE ID NO.89)。

PANX1的核苷酸序列具有NCBI参考序列编号NG_027936.1

该疾病或病症与PANX1介入相关或由其介导。该疾病或病症可以是与受试者或受试者生物样品中PANX1信号传导或表达的增加相关或以此为特征。

值得注意的是，该疾病或病症可选自包含炎症、纤维化、癌症、局部缺血和心血管疾病的组。该疾病或状况可以是疼痛、与神经系统相关的疾病或病症。该疾病或病症可以是与大脑相关的疾病或病症。

炎症可以是任何类型的炎症或炎性疾病或病症，例如以慢性炎性环境为特征的炎症。炎症可以是脑部炎症、肠炎症、脑炎症、胃炎症或血管炎症。炎症可能是由损伤引起的。炎症可以包括但不限于炎症性肠病，如克罗恩病和慢性胃肠道(GI)炎症。

纤维化疾病或病症或纤维化可以是或涉及任何组织。合适的实例包括但不限于肝纤维化、肾间质纤维化(renal fibrosis)、肺纤维化、心肌细胞纤维化、心肌纤维化、骨髓纤维化、肾纤维化(kidney fibrosis)、组织纤维化和皮肤纤维化。肺纤维化可能是特发性肺纤维化。纤维化通常是由环境因素诱导的，而不是遗传性纤维化。

癌症可以包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、肝癌(包括肝细胞癌)、肺癌、膀胱癌、睾丸癌、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、结肠癌、白血病和子宫内膜癌。

心血管疾病可能包括但不限于冠心病、中风、周围血管疾病、心肌梗死、横纹肌溶解症、心肌病和动脉粥样硬化。在一个实施方案中，心血管疾病不包括动脉粥样硬化。

该疾病或症状可以是顽固性高血压。

局部缺血可包括但不限于脑缺血、缺血性中风、心脏缺血、肠缺血、肢体缺血以及由创伤或闭塞引起的局部缺血。

该疾病或病症可以是神经系统的疾病或病症，包括周围神经疾病。该疾病或病症可以是神经变性疾病，例如多发性硬化。

该疾病或病症可以是脓毒症或疼痛。疼痛可以是受试者的任何部位。疼痛可以是关节痛。

该病症可以是损伤。

该疾病或病症可以是眼科疾病或病症。

该疾病或病症可以是微生物感染，例如细菌感染、病毒感染或真菌感染。感染可以是HIV感染。

症状可以是药物戒断，如阿片类药物。

该疾病或症状可能是肌肉骨骼疾病，如腱炎或腕管综合征。

该疾病或病症可选自包含偏头痛、头痛、痉挛(seizures)、骨关节炎癫痫、病灶性癫痫、耐药性癫痫和癫痫(epilepsy)。

该疾病或病症可以是肾病或膀胱疾病，包括膀胱活动过度。病症可以是急性肾损伤。

该疾病或病症可能是胃溃疡。该疾病或症状可以是痛风。该疾病或症状可以是亨廷顿舞蹈病。

该疾病或病症可以是肝脏损伤。这可以包括与肝细胞损伤、胆汁淤积性损伤和/或浸润性损伤相关的肝病。肝细胞损伤中主要损伤肝细胞。胆汁淤积性损伤中主要损伤胆管。浸润性损伤中肝脏被非肝脏物质侵入或替代，如肿瘤或淀粉样蛋白。AST和ALT是肝脏损伤或肝细胞损伤的典型标志物。肝病可以包括病毒性肝炎、急性酒精性肝炎、NAFLD、丙型肝炎、酒精性脂肪性肝病和药物作用(例如，由于他汀类药物)中的一种或多种。

本发明提供了包含SEQUENCE ID NO.1或SEQUENCE ID NO.1的功能性(或治疗有效)变体的肽(以下称为“肽活性剂”或“本发明的肽”)，用于治疗或预防受试者中与PANX1相关的疾病或病症的方法。

本发明提供了包含含有SEQUENCE ID NO.1或SEQUENCE ID NO.1的治疗有效变体的肽的组合物，用于治疗或预防受试者中与PANX1相关的疾病或病症的方法。

值得注意的是，该组合物是人造组合物。

该组合物可以是药物组合物，并且还包含至少一种合适的药物载体。

该变体可以是SEQUENCE ID NO.1的功能性或治疗片段。

在一个实施方案中，与SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至8个氨基酸变化或修饰。在一个实施方案中，SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至7个氨基酸变化。在一个实施方案中，与SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至6个氨基酸变化。在一个实施方案中，与SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至5个氨基酸变化。在一个实施方案中，与SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至4个氨基酸变化。在一个实施方案中，与序SEQUENCEID NO:1相比，该变体具有1至3个氨基酸变化。在一个实施方案中，与SEQUENCE ID NO:1相比，该变体具有1至2个氨基酸变化。在一个实施方案中，氨基酸改变是氨基酸取代。在一个实施方案中，氨基酸取代是保守取代。在一个实施方案中，氨基酸改变是氨基酸添加。在一个实施方案中，氨基酸改变是氨基酸缺失。

本发明的变体包括：-

SEQUENCE ID NO:1的变体

SEQUENCE ID NO:1(WKDEAGKPLVK)的变体包括具有1、2或3个保守氨基酸取代，1、2至3个非保守氨基酸取代，1、2或3个氨基酸添加，1、2或3个氨基酸缺失的变体，如下所示：

一个保守氨基酸取代：

WKEEAGKPLVK(SEQ ID NO.2)；FKDEAGKPLVK(SEQ ID NO.3)；WKDEAGKPMVK(SEQ IDNO.4)；WKDEAGRPLVK(SEQ ID NO.5)；WRDEAGKPLVK(SEQ ID NO.6)；WKDEAGKPLMK(SEQ IDNO.7)；WKDQAGKPLVK(SEQ ID NO.8)；WKDEATKPLVK(SEQ ID NO.9)；

两个保守氨基酸取代：

YKNEAGKPLVK(SEQ ID NO.10)；WKNESGKPLVK(SEQ ID NO.11)；WKDEAGKTLVR(SEQID NO.12)；FKDEATKPLVK(SEQ ID NO.13)；FKDEAGKPLIK(SEQ ID NO.14)；WKDEAGKTLLK(SEQID NO.15)；WKNEAGKPVVK(SEQ ID NO.16)；WKDEAGRTLVK(SEQ ID NO.17)；

三个保守氨基酸取代：

WEDESGKPLLK(SEQ ID NO.18)；WKEEAGKPIVQ(SEQ ID NO.19)；YKNEAGKPLVR(SEQID NO.20)；WKDQATRPLVK(SEQ ID NO.21)；WKDESGKPVLK(SEQ ID NO.22)；WQDDSGKPLVK(SEQID NO.23)；WKNEAGKTLLK(SEQ ID NO.24)；WKDKAGEPLVR(SEQ ID NO.25)；

一个非保守氨基酸取代：

WKDEAGNPLVK(SEQ ID NO.26)；CKDEAGKPLVK(SEQ ID NO.27)；WKDEAGKPLGK(SEQID NO.28)；WKDENGKPLVK(SEQ ID NO.29)；WKDEARKPLVK(SEQ ID NO.30)；WKDEAGKPLVT(SEQID NO.31)；WKDEAGKRLVK(SEQ ID NO.32)；WKWEAGKPLVK(SEQ ID NO.33)；

两个非保守氨基酸取代：

WKDEAGFPTVK(SEQ ID NO.34)；WYDMAGKPLVK(SEQ ID NO.35)；WKDYEGKPLVK(SEQID NO.36)；WKREAGKPGVK(SEQ ID NO.37)；WKLEKGKPLVK(SEQ ID NO.38)；WKDEAGKPCVK(SEQID NO.39)；WKKEAPKPLVK(SEQ ID NO.40)；SKDEAGPPLVK(SEQ ID NO.41)；

三个非保守氨基酸取代：

WKHEPGKPLAK(SEQ ID NO.42)；WKDEREKPFVK(SEQ ID NO.43)；WKQEAGKPWRK(SEQID NO.44)；VKDEAKKPLVH(SEQ ID NO.45)；NWDEAGKMLVK(SEQ ID NO.46)；IKDEDGPPLVK(SEQID NO.47)；LKDEYGKPLVN(SEQ ID NO.48)；WKDRAGKELTK(SEQ ID NO.49)；

氨基酸添加

WKDEAGKPLPVK(SEQ ID NO.50)；WKGDENYAGKPLVK(SEQ ID NO.51)；LWKDEAGRKYPLVK(SEQ ID NO.52)；WKDCEGAGKPLVK(SEQ ID NO.53)；WKDEPAGKPLVVK(SEQ IDNO.54)；WKDEAGPKPLVK(SEQ ID NO.55)；WKDEAGWADKPLVK(SEQ ID NO.56)；WKNDEAGKPLVK(SEQ ID NO.57)；

氨基酸缺失

WKDAKPLVK(SEQ ID NO.58)；WKEAGKPVK(SEQ ID NO.59)；WKDEAKPLVK(SEQ IDNO.60)；WDEAGKPV(SEQ ID NO.61)；WKDEAGKPVK(SEQ ID NO.62)；WDAGKPLVK(SEQ IDNO.63)；WKDEAGKPLV(SEQ ID NO.64)；WEAGKPLV(SEQ ID NO.65)；DEAGKPLV(SEQ IDNO.90)。

SEQ ID NO:1的片段实例如下：

WKDEAG(SEQ ID NO.66)；WKDEA(SEQ ID NO.67)；KDEAGKPL(SEQ ID NO.68)；KDEAG(SEQ ID NO.69)；DEAGKPL(SEQ ID NO.70)；GKPLV(SEQ ID NO.71)；DEAGK(SEQ ID NO.72)；WKDEAGKPL(SEQ ID NO.73)；WKD(SEQ ID NO.74)；KDE(SEQ ID NO.75)；KPLVK(SEQ IDNO.76)；WKDE(SEQ ID NO.77)；AGKPL(SEQ ID NO.78)；EAG(SEQ ID NO.79)；AGK(SEQ IDNO.80)；KPL(SEQ ID NO.81)；LVK(SEQ ID NO.82)；GKP(SEQ ID NO.83)；DEA(SEQ IDNO.84)；PLV(SEQ ID NO.85)。

应当理解，该组合物可以包含多种肽、片段和/或变体。优选地，该组合物包含至少两种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少三种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少四种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少五种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少六种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少七种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少八种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少九种本发明的肽。优选地，该组合物包含至少十种本发明的肽。在一个实施方案中，组合物包含基本上所有的肽。在一个实施方案中，组合物包含基本上所有的变体。在一个实施方案中，组合物基本上不含其他肽。

图1示出了PANX1通道蛋白。该蛋白包含四个α-螺旋TM结构域、两个细胞外环和一个细胞内环。蛋白质的N和C末端暴露于细胞的细胞质。

图2示出了PANX1在正常稳态下的活性(A)。该图还示出了存在细胞外ATP和K+(B)增加时PANX1的活性。在这种环境下，通道开口会增加。炎症和稳态失调随着ATP释放和Ca2+细胞内流的增加而驱动过多的信号传导。

图6提供了由PANX1介导或PANX1介入的细胞过程和/或疾病的实例。应当理解，所有包括的内容在此都被设想在本发明中。

定义和一般偏好

除非另有特别说明，否则本文使用的以下术语除了具有本领域中该术语可能具有的任何更宽(或更窄)的含义外，还旨在具有以下含义：

除非上下文另有要求，否则本文单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。与实体相关的术语“一(a)”或“一(an)”应理解为是指一个或多个该实体。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个”和“至少一”在本文中可互换使用。

如本文所使用的，术语“包含(comprise)”或其变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为指示包括任何所列举的实体(例如，特点、元件、特征、特性、方法/过程步骤或限制)或实体组(例如，特点、元件、特征、特性、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其他实体或实体组。因此，如本文所用，术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的实体或方法/过程步骤。

如本文所用，短语“与PANX1相关的疾病”指其中PANX1或PANX1信号传导起作用的疾病或病症。疾病或病症可以是以受试者或受试者生物样品中PANX1信号传导或PANX1表达增加为特征或由其介导的疾病或病症。该增加是与健康受试者相比的。样品可以是任何生物样品，如血液、组织、细胞、器官。在一个实施方案中，PANX1在所述受试者中突变，使得与未突变的PANX1相比，PANX1信号传导和/或表达增加。这种疾病和病症是本领域已知的，并且在本文中均被设想。检测PANX1表达和信号传导的方式是本领域技术人员熟知的。

如本文所用，术语“疾病”用于定义任何损害生理功能并与特定症状相关的异常病症。该术语被广泛用于包括生理功能受损的任何紊乱、病患、异常、病理、疾病、病症或综合征，而不管病因的性质如何(或者实际上是否确立了疾病的病因基础)。因此，它包括由感染、创伤、损伤、手术、放射性消融、年龄、中毒或营养不良引起的疾病。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指在指治疗、改善或减轻疾病症状或消除(或减轻影响)其病因的干预(如给受试者施用药剂)。在这种情况下，该术语治疗(treatment)与术语“治疗(therapy)”同义。

此外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防或延迟疾病的发作或进展或者减少(或根除)其在治疗人群中的发病率的干预(例如向受试者施用药剂)。在这种情况下，术语治疗(treatment)与术语“预防(prophylaxis)”同义。

如本文所用，药剂的“有效量”或“治疗有效量”定义为可施用于受试者而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的量，与合理的益处/风险比相称，但足以提供所需效果的量，例如通过受试者病症的永久或暂时改善而体现的治疗或预防。剂量因受试者而异，取决于受试者的身体大小、年龄和个体的一般状况、给药方式和其他因素。因此，虽然不可能指定确切的有效量，但是本领域技术人员将能够使用常规实验和一般背景知识在任何个别情况下确定适当的“有效”量。在本文中，治疗结果包括消除或减轻症状、减轻疼痛或不适、延长生存期、改善活动能力和其他临床改善标志物。治疗结果不一定是完全治愈。可在生物/分子标志物、临床或观察改善方面观察到改善。在一个优选的实施方案中，本发明的方法适用于人类、大型比赛动物(马、骆驼、狗)和家养宠物(猫和狗)。

在如上定义的治疗和有效量的上下文中，术语“受试者”(在上下文允许的情况下，应理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义了任何指示需要治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人类、家畜动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、骆驼、野牛、家牛、乳牛；灵长类，例如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，例如狗和狼；猫科动物，例如猫、狮子和老虎；马科动物，例如马、毛驴(donkey)和斑马；食用动物，例如牛、猪和羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；以及啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。在优选的实施方案中，受试者是人。如本文所用，术语“马科动物”是指马科的哺乳动物，包括马、毛驴、驴(ass)、野驴和斑马。受试者可以是有需要的受试者，即需要治疗或预防疾病或病症的受试者。

“药物组合物”：本发明的另一方面涉及包含肽活性剂的药物组合物，其与一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体掺和，或与提高治疗效果的其他药物共同施用。即使本发明的肽和组合物可以单独施用，它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂掺合施用，特别是用于人类治疗。药物组合物可用于人或动物的人和兽医学用途。用于本文所述各种不同形式的药物组合物的此类合适赋形剂的实例可在由A Wade和PJ Weller编辑的“药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd Edition,(1994))”中找到。具体地，由David Osborne和Antonio Aman，Taylor&Francis编辑的“局部用药物递送制剂(Topical drug delivery formulations)”中描述了局部用药物递送制剂，其全部内容通过引用并入本文。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，例如在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985))中有所描述。第2版(1994年)”中发现。合适的载体实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂实例包括乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据预期的给药途径和标准药学实践进行选择。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖)、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

本文使用的术语“肽”是指由至多50个氨基酸组成的聚合物，例如通常通过肽键连接的5-50个氨基酸单体。本发明的肽(包括其片段和变体)和用于本发明的肽(包括其片段和变体)可以全部或部分通过化学合成或通过核酸表达产生。例如，本发明的肽和用于本发明的肽可以根据本领域已知的完善的标准液体或优选固相肽合成方法容易地制备(例如参见J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition,PierceChemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky和A.Bodanzsky,ThePractice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984))。必要时，可对本发明中使用的任何肽进行化学修饰以增加其稳定性。化学修饰的肽或肽类似物包括所述肽的任何功能性化学等价物，其特征在于其在体内或体外关于本发明实践的稳定性和/或疗效增加。术语肽类似物也指本文所述的肽的任何氨基酸衍生物。肽类似物可通过包括但不限于修饰侧链、在肽合成过程掺入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交联剂，以及对肽或其类似物施加构象限制的其他方法来生产。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，例如通过与醛反应进行还原烷基化，然后用NaBH₄还原；用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)酰胺化；用乙酸酐乙酰化；用氰酸酯对氨基进行氨基甲酰化；用2,4,6,三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯甲酰化反应；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行烷基化；以及用吡哆醛-5'-磷酸(pyridoxa-5'-phosphate)对赖氨酸进行吡啶氧化，然后用NABH₄还原。精氨酸残基的胍基可以通过与诸如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物来修饰。羧基可以通过形成o-酰基异脲进行碳二亚胺活化，然后衍生化(例如衍生化为相应的酰胺)进行修饰。巯基可以通过例如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺反应；马来酸酐或其他经取代的马来酰亚胺；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、氯化苯基汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其他汞剂形成汞衍生物；在碱性pH下用氰酸酯进行氨基甲酰化的方法进行修饰。色氨酸残基可以通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤对吲哚环进行烷基化进行修饰。通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变酪氨酸残基。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-碳乙酯基化来完成。在肽合成过程掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。肽结构修饰包括产生包含由D-氨基酸编码的反向序列的逆向逆型肽(retro-inverso peptide)。变化可以是降低对蛋白水解的易感性、降低对氧化的易感性、改变变体序列的结合亲和力(通常理想地增加亲和力)、和/或赋予或修饰相关变体/类似物肽的其他物理化学或功能性质。

应用于参考肽的术语“治疗有效变体”是指具有与参考肽基本相同的氨基酸序列的肽，并且其治疗有效，如下所定义。因此，例如，该术语应包括一个或多个氨基酸残基发生改变的变体。优选地，这种改变涉及插入、添加、缺失和/或取代6个或更少的氨基酸，优选5个或更少，4个或更少，甚至更优选3个或更少，最优选仅1个或2个氨基酸。设想用天然和修饰的氨基酸进行插入、添加和取代。变体可能具有保守的氨基酸变化，其中引入的氨基酸在结构、化学或功能上与被取代的氨基酸相似。一般而言，变体与亲本序列具有至少50％、60％、70％的氨基酸序列同一性，优选至少80％的序列同一性，更优选至少90％的序列同一性，并且理想地具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。应当注意，当在疾病的体外或体内模型中测试时，任何变体将主要具有相同的治疗效果，或可以具有提高的效果。其中五个氨基酸被D-型氨基酸取代的示例性变体如SEQUENCE ID NO:86所示。

应用于本发明的肽的“治疗有效”可与“功能性”互换使用，是指能够靶向PANX1并调节其功能的肽。确定PANX1靶向性的方式如本文所述。确定PANX1调节的方法如本文所述并且本领域已知。

术语“变体”还包括术语“片段”，因此是指氨基酸SEQUENCE ID NO.1的片段。通常，该片段具有3至10个连续的氨基酸长度。通常，片段的电荷为-5至+3。使用Cameselle,J.C.,Ribeiro,J.M.,and Sillero,A.(1986)的方法测定肽、片段或区域的电荷。推导和使用公式计算酸碱化合物的净电荷。它应用在氨基酸、蛋白质和核苷酸中(生物化学，Biochem.Educ.14,131–136)。

在本说明书中，术语“序列同一性”应理解为包含序列同一性和相似性，即与参考序列具有70％序列同一性的变体(或同源物)是在整个序列长度上其中变体(或同源物)的任何70％对齐的残基与参考序列中的相应残基相同或保守取代的变体。序列同一性是两个不同序列之间精确匹配的字符量。因此，间隙不计算在内，测量结果是相对于两个序列中的较短者而言。

对于“序列同源性”，该术语应理解为指当变体(或同源物)的对齐残基的百分比与参考序列中的相应残基相同或保守取代，且变体(或同源物)与参考序列具有相同功能时，与参考序列具有确定百分比相似性或同一性的变体(或同源物)。

这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如，一种比对程序是BLAST，使用默认参数。这些程序的详情可在以下网址找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。

应用于片段的“C-末端结构域”是指该片段C-末端的前三个氨基酸。

应用于片段的“N-末端结构域”是指该片段N-末端的最后三个氨基酸。

参考蛋白的“同源物”应理解为指来自不同植物物种的与参考蛋白具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性的蛋白。

所述肽或组合物可适于局部、口服、直肠、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻内、阴道、口腔或舌下施用途径并通过其施用。对于口服施用，特别用于压制片剂、丸剂、片剂、胶囊剂(gellules)、滴剂和胶囊剂。优选地，这些组合物每剂量含有1mg至250mg(更优选10-100mg)的活性成分。其他施用形式包含溶液或乳剂，其可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射，并且由无菌或可灭菌溶液制备。本发明的药物组合物还可以是栓剂、阴道环、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂或撒布粉的形式。本发明的组合物可以配制用于局部递送。局部递送通常指递送至皮肤，但也可指递送至布有上皮细胞的体腔，例如肺或气道、胃肠道、口腔。特别是，在由David Osborne和Antonio Aman、Taylor&Francis编辑的局部药物递送制剂中描述了用于局部递送的制剂，其全部内容通过引用并入本文。用于递送至气道的组合物或制剂在O'Riordan等人(Respir Care,2002,Nov.47)、EP2050437、WO2005023290、US2010098660和US20070053845中有所描述。用于将活性剂递送至回肠，特别是近端回肠的组合物和制剂包括微粒和微囊，其中活性剂被包封在由聚合物或乳蛋白形成的保护性基质内，所述聚合物或乳蛋白是耐酸的，但易于在回肠的更碱性环境中溶解。EP1072600.2和EP13171757.1中描述了此类递送系统的实例。另一种经皮给药方式是使用皮肤贴剂。例如，可将活性成分掺入由聚乙二醇或液体石蜡的水乳液组成的霜剂中。还可以将活性成分以1-10％重量的浓度掺入由白色蜡或白色软石蜡基组成的药膏中，以及可能需要的稳定剂和防腐剂。每剂注射剂可含有10-1000mg(优选10-250mg)的活性成分。组合物可以配制成单位剂型，即含有单位剂量或多个单位剂量或次级单位剂量的离散份数的形式。

本领域普通技术人员可以容易地确定对受试者施用本发明组合物之一的适当剂量，而无需过度的实验。通常，医生将确定最适合个体患者的实际剂量，并且它将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄速率、药物组合、特定病症的严重程度以及个体正在接受的治疗。本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，也可以存在需要更高或更低剂量范围的个别情况，并且这些都在本发明的范围内。根据需要，药剂可以以0.01mg/kg至30mg/kg体重(例如0.1mg/kg至10mg/kg体重，更优选0.1mg/kg至1mg/kg体重)的剂量施用。在一个示例性实施方案中，将向患者施用10mg/天至300mg/天或更优选10mg/天至150mg/天的一个或多个剂量，用于治疗炎性紊乱。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法和用途涉及肽或组合物与一种或多种其他活性剂(例如市场上可获得的用于待治疗或预防疾病的现有药物或药理学增强剂)组合施用。在这种情况下，本发明的化合物可以与一种或多种其他活性剂连续、同时或顺序施用。

在本发明的一个实施方案中，肽活性剂可以以缀合物的形式施用，所述缀合物包含肽、接头和旨在增加缀合物体内半衰期的抗体分子(或抗体片段)。

“修饰的肽”：在一个实施方案中，本发明的肽(包括肽变体)可以是修饰的肽。术语“修饰的肽”与术语肽的衍生物可互换使用。在一个实施方案中，术语“修饰的肽”是指被修饰以与未修饰的肽相比表现出一种或多种以下性质的肽：增加血浆半衰期；增加肽的亲脂性；增加修饰肽的肾清除率；增加修饰的肽对蛋白水解降解的抗性，同时通常保持rpS6磷酸化活性。本文公开了修饰本发明肽以表现这些性质的各种方法，包括使肽与结合配偶体(例如白蛋白结合小分子、大聚合物、长寿命血浆蛋白、或者抗体或抗体片段)缀合，环化，添加N-或C-末端或侧链、保护基团，用D-异构体取代L-氨基酸，氨基酸修饰，增加血浆蛋白结合，增加白蛋白结合。修饰的肽包括但不限于用本文所定义的一个或多个基团取代或与结合配偶体缀合或环化的肽。通常，对肽进行修饰以增加其在动物体内的半衰期。下面提供了各种修饰方法。

在一个实施方案中，所述修饰可以是使本发明的肽和/或组合物具有增加的渗透细胞的能力的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的半衰期的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的活性的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的选择性的任何修饰。

在一个实施方案中，所述基团是保护基团。保护基团可以是N-末端保护基、C-末端保护基或侧链保护基。该肽可以具有一个或多个这些保护基团。

本领域技术人员知道使氨基酸与这些保护基团反应的合适技术。这些基团可以通过本领域已知的制备方法加入，例如US2014120141第[0104]至[0107]段中概述的方法。这些基团可以保留在肽上，也可以去除。可以在合成过程中加入保护基团。

在本发明的一个实施方案中，肽可以被选自一个或多个直链或支链、长链或短链、饱和或不饱和的基团取代，被羟基、氨基、氨酰基、硫酸盐或硫化物基团取代或未取代，具有1至29个碳原子。N-酰基衍生物包括衍生自乙酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、异硬脂酸、反油酸、2-乙基己酸、椰子油脂肪酸、牛油脂肪酸、硬化牛油脂肪酸、棕榈仁脂肪酸、羊毛脂脂肪酸或类似酸的酰基。这些可以是被取代的或未被取代的。当被取代时，它们优选被羟基或含有例如但不限于SO3H、SH或S-S基团的硫基取代。

在本发明的一个实施方案中，所述肽是R1-X-R2。

R1和/或R2基团分别与肽序列的氨基末端(N末端)和羧基末端(C末端)结合。

在一个实施方案中，肽是R1-X。或者，肽是X-R2。

优选地，R1是H、C1-4烷基、乙酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；

X是本发明的肽；

R2是OH或NH2。

在一个实施方案中，R1选自由H、非环状取代或未取代的脂族基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和R5-CO-形成的组，其中R5选自由H、非环状取代或未取代的脂族基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基以及取代或未取代的杂芳烷基形成的组；

R2选自由-NR3R4、-OR3和-SR3形成的组，其中R3和R4独立地选自由H、非环状取代或未取代的脂族基团、取代或未别取代的脂环基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的芳烷基形成的组；并且条件是R1和R2不是α-氨基酸。

根据另一个优选实施方案，R2是-NR3R4、-OR3或-SR3，其中R3和R4独立地选自由H、取代或未取代的C1-C24烷基、取代或未取代的C2-C24烯基、叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、取代或未取代的C2-C24炔基、取代或未取代的C3-C24环烷基、取代或未取代的C5-C24环烯基、取代或未取代的C8-C24环炔基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C7-C24芳烷基、取代或未取代的3-10元杂环以及具有2-24个碳原子和1-3个非碳原子的取代或未取代的杂芳烷基(其中烷基链具有1-6个碳原子)形成的组。任选地，R3和R4可以通过饱和或不饱和碳-碳键结合，与氮原子形成环。更优选R2是-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立地选自由H、取代或未取代的C1-C24烷基、取代或未取代的C2-C24烯基、取代或未取代的C2-C24炔基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C6-C15芳基和取代或未取代的3-10元杂环基、具有3-10元环和1-6个碳原子烷基链的取代或未取代的杂芳烷基形成的组。更优选地，R3和R4选自由H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基形成的组。更优选R3是H，R4选自由H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基形成的组。根据更优选的实施方案，R2选自-OH和-NH₂。

根据本发明的另一个实施方案，R1选自由H、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基形成的组，R2是-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立地选自H、甲基、乙基、己基、十二烷基和十六烷基，优选R2是-OH或-NH₂。更优选地，R1是乙酰基或棕榈酰基，R2是-NH2。

在一个优选的实施方案中，酰基与肽的至少一个氨基酸的N-末端结合。

在本发明的一个实施方案中，肽被修饰以包含侧链保护基团。侧链保护基团可以是包含苄基或基于苄基的基团、基于叔丁基的基团、苄氧羰基(Z)基团和烯丙氧羰基(alloc)保护基团的组中的一个或多个基团。侧链保护基团可以衍生自非手性氨基酸，例如非手性甘氨酸。使用非手性氨基酸有助于稳定所得肽，也有利于本发明的简便合成途径。优选地，所述肽还包含修饰的C-末端，优选酰胺化的C-末端。非手性残基可以是α-氨基异丁酸(甲基丙氨酸)。应当理解，所使用的特定侧链保护基团将取决于肽的序列和所使用的N-末端保护基团的类型。

在本发明的一个实施方案中，肽与一种或多种聚乙二醇聚合物或其他化合物(例如分子量增加化合物)缀合、连接或融合。分子量增加化合物是将增加所得缀合物的分子量的任何化合物，通常增加10％至90％或20％至50％，并且可以具有200至20,000(优选500至10,000)的分子量。分子量增加化合物可以是PEG、任何水溶性(两亲性或亲水性)聚合物部分、PEG的均聚物或共聚物、PEG(mPEG)和聚氧乙烯甘油(POG)的单甲基取代的聚合物、聚氨基酸(例如聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸，特别是L构象的那些)、药理学上无活性的蛋白质(例如白蛋白)、明胶、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸和葡聚糖。聚合物部分可以是直链或支链的，其分子量可以是500-40000Da、5000-10000Da、10000-5000Da。该化合物可以是任何合适的细胞渗透化合物，例如tat肽、Penetratin、pep-1。该化合物可以是抗体分子。该化合物可以是亲脂性部分或聚合物部分。

亲脂性取代基和聚合物取代基是本领域已知的。亲脂性取代基包括酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子，它们形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分。亲脂性部分可包括具有4至30个C原子，优选8至12个C原子的烃链。它可以是直链或支链的，饱和或不饱和的。烃链可以被进一步取代。它可以是环烷烃或杂环烷烃。

该肽可以在N-末端、C-末端或两者都进行修饰。聚合物或化合物优选与氨基、羧基或硫基连接，并且可以通过任何氨基酸残基的侧链的N-末端或C-末端连接。聚合物或化合物可以与任何合适残基的侧链缀合。

聚合物或化合物可以通过间隔物缀合。间隔物可以是天然或非天然氨基酸、琥珀酸、赖氨酰、谷氨酰、天冬氨酰、甘氨酰、β-丙氨酰、γ-氨基丁酰。聚合物或化合物可以通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺缀合。本领域技术人员知道制备所述缀合物的合适方法。

例如，肽可以通过共价结合到聚合物上进行化学修饰，以增加其循环半衰期。示例性的聚合物和将这种聚合物连接到肽上的方法在例如美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546中有所说明。其他示例性聚合物包括聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。

可以对本发明的肽进行一种或多种修饰，以操纵储存稳定性、药代动力学和/或肽的生物活性的任何方面，例如效力、选择性和药物相互作用。肽可能经受的化学修饰包括但不限于聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物中的一种或多种与肽的缀合。蛋白质在Cys残基处的PEG缀合在例如Goodson,R.J.&Katre,N.V.(1990)Bio/Technology 8,343和Kogan,T.P.(1992)SyntheticComm.22,2417中有所披露。

修饰的肽还可以包括其中一个或多个残基被修饰(即通过磷酸化、硫酸化、酰化、聚乙二醇化等)的序列和包含相对于亲本序列的一个或多个修饰残基的突变体。氨基酸序列也可以用能够直接或间接提供可检测信号的标记修饰，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。荧光标记包括例如Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、荧光素(例如FluorX、DTAF和FITC)、罗丹明(例如TRITC)、碱性槐黄(auramine)、Texas红、AMCA蓝和Lucifer黄。优选的同位素标记包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和286Re。优选的酶标记包括过氧化物酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶(参见例如美国专利号3,654,090；3,850,752和4,016,043)。酶可以通过与桥接分子例如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应而缀合。酶标记可以通过目视检测，或可以通过量热法、分光光度法、荧光分光光度法、安培法或气体定量法进行测量。其他标记系统，例如抗生物素蛋白/生物素、酪胺酸信号放大(TSA^TM)，均是本领域已知的并且是市场上可获得的(参见例如ABC kit,Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,Calif.；

Life Science Products,Inc.,Boston,Mass.)。

在一个实施方案中，肽、变体和/或组合物被修饰以增加药物性能的能力。在一个实施方案中，肽、变体和/或组合物被修饰以增加稳定性、渗透性、保持效力、避免毒性和/或增加半衰期。可以是如上所述所述的修饰。例如，为了保护N和C末端，该修饰可以是修饰的氨基酸、环化、氨基酸的替换和/或与大分子或大聚合物或长寿命血浆蛋白的缀合。延长半衰期的策略可如Strohl,et al(BioDrugs,2015)、Schlapschy,et al(Protein Eng DesSel.2013)、Podust,VN,et al(Protein Eng Des Sel.2013)、Zhang,L et al(Curr MedChem.2012)、Gaberc-Porekar,V,et al(Curr Opin Drug Discov Devel.2008)所述。实例包括使用聚乙二醇化、脂化(脂肪酸与肽侧链共价结合)、与Fc结构域和人血清白蛋白融合、与亲水性氨基酸聚合物(例如XTEN或PAS)融合和/或与半衰期延长蛋白融合。

文献中描述了修饰肽以延长肽的体内半衰期，例如：

改善肽和蛋白药物血浆半衰期的策略(Werle M,Bernkop-Schnürch A.AminoAcids.2006Jun；30(4):351-67)。

由于长效肽和蛋白质药物的明显优势，延长此类化合物血浆半衰期的策略被高度需求。血浆半衰期短通常是由于肾清除快以及体循环过程中发生酶降解所致。肽/蛋白的修饰可延长血浆半衰期。通过缩短生长抑素的总氨基酸量并用D:-氨基酸取代L:-类似物氨基酸，与仅几分钟的生长抑素相比，衍生物奥曲肽的血浆半衰期为1.5小时。与天然蛋白相比，INF-α-2b的PEG(2,40K)缀合物的血浆半衰期延长了330倍。该文章旨在综述延长血浆半衰期的可能策略，例如N-和C-末端修饰或聚乙二醇化，以及评估药物修饰有效性的方法。此外，提供了关于人血、肝脏和肾脏的最重要的蛋白水解酶及其切割特异性和抑制剂的基础数据，以预测肽和蛋白质药物在体循环过程中的酶切割。

优化肽ADME性质的策略方法(Li Di AAPS J.2015Jan；17(1):134–143)。

稳定化肽免受蛋白水解的策略

有许多方法能够通过结构修饰提高肽稳定性。一些方法不仅改善了稳定性，还提高了其他ADME特性，例如环化可以增加稳定性和渗透性；与大分子缀合可改善稳定性并降低肾清除率。在改善肽的稳定性和ADME特性的同时，保持效力和避免毒性非常重要。

·保护N-和C-末端

血液/血浆、肝脏或肾脏中的许多蛋白水解酶是外肽酶、氨肽酶和羧肽酶，它们从N-和C-末端分解肽序列。N-或/和C-末端的修饰通常可以改善肽的稳定性。许多实例已经报告，N-乙酰化和C-酰胺化增加了对蛋白水解的抗性。

·用D-氨基酸取代L-氨基酸

用非天然D-氨基酸取代天然L-氨基酸降低了蛋白水解酶的底物识别和结合亲和力，并增加稳定性。一个实例是加压素，它含有L-Arg，在人体内的半衰期为10-35min。D-Arg类似物，去氨加压素，在健康人体志愿者中的半衰期为3.7h。在癌症相关蛋白尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的双环肽抑制剂研究中，用D-丝氨酸取代特定甘氨酸不仅使效力提高了1.8倍，还使小鼠血浆中的稳定性增加了4倍。

·氨基酸修饰

天然氨基酸的修饰可以通过引入空间位阻或破坏酶的识别来改善肽的稳定性。例如，促性腺激素释放激素的半衰期非常短(数分钟)，而布舍瑞林(buserelin)(其中一个Gly被叔丁基-D-丝氨酸取代，另一个Gly被乙基酰胺取代)在人体内的半衰期则长得多。

·环化

本发明的肽可以被环化。环化引入了构象限制，降低了肽的灵活性，增加了稳定性和渗透性。根据功能基团，肽可以头尾环化、头/尾侧链环化或侧链-侧链环化。环化通常通过内酰胺化、内酯化和硫桥来完成。二硫桥产生折叠和构象限制，可改善效力、选择性和稳定性。许多富含二硫键的肽已经上市或处于临床前或临床开发阶段，例如利那洛肽、来匹卢定和齐可诺肽。在一个实施方案中，肽在肽的氨基和羧基端之间环化。在一个实施方案中，肽在氨基端和侧链之间环化。在一个实施方案中，肽在羧基端和侧链之间环化。在一个实施方案中，肽在侧链之间环化。在一个实施方案中，环肽选自同型环肽、环状异肽、环状缩肽或单环或二环肽。肽的环化方法在如下文献有所描述：

生物制药应用的肽与蛋白质设计(Jensen,Knud(2009-09-01).Peptide andProtein Design for Biopharmaceutical Applications.John Wiley&Sons.ISBN9780470749715)；

TLC化学方法在植物环肽检测中的应用(Wenyan,Xu；Jun,Tang；Changjiu,Ji；Wenjun,He；Ninghua,Tan(2008)."Application of a TLC chemical method todetection of cyclotides in plants".Science Bulletin.53(11):1671–1674.doi:10.1007/s11434-008-0178-8)；

2,5-二酮丙拉嗪：合成、反应、药物化学及生物活性天然产物(Borthwick AD(May2012)."2,5-Diketopiperazines:Synthesis,Reactions,Medicinal Chemistry,andBioactive Natural Products".Chemical Reviews.112(7):3641–3716.doi:10.1021/cr200398y.PMID 22575049)；

石竹科植物线性前体中环状肽的两步生物合成涉及丝氨酸蛋白酶样酶的环化(Barber,Carla J.S.；Pujara,Pareshkumar T.；Reed,Darwin W.；Chiwocha,Shiela；Zhang,Haixia；Covello,Patrick S.(2013)."The Two-step Biosynthesis of CyclicPeptides from Linear Precursors in aMember of the Plant FamilyCaryophyllaceae Involves Cyclization by a Serine Protease-like Enzyme".Journal of Biological Chemistry.288(18):12500–12510.doi:10.1074/jbc.M112.437947.PMC 3642298.PMID 23486480)；

独立于非核糖体肽合成酶合成的前体产生环肽的各种机制(Wenyan Xu；et al.(2011)."Various mechanisms in cyclopeptide production from precursorssynthesized independently of non-ribosomal peptide synthetases".ActaBiochimica et Biophysica Sinica.43(10):757–762.doi:10.1093/abbs/gmr062.PMC3180235.PMID 21764803)；

植物环肽及其可能的生物合成机制(Wenyan Xu；et al."Plant Cyclopeptidesand Possible Biosynthetic Mechanisms")；

无缝蛋白质将其松散端固定(David J.Craik(17March 2006)."SeamlessProteins Tie Up Their Loose Ends".Science.311(5767):1563–7.doi:10.1126/science.1125248.PMID16543448)。

·与大分子缀合

与大分子(例如聚乙二醇(PEG)、白蛋白)缀合是改善肽稳定性和降低肾清除率的有效策略。

肾清除率

许多肽表现出有前景的体外药理活性，但由于体内半衰期非常短(数分钟)而未能证明体内疗效。肽的快速清除和半衰期短阻碍了它们开发为成功的药物。肽从体循环中快速清除的主要原因是酶的蛋白水解或/和肾清除。肾小球的孔径为～8nm，MW<2–25kDa的亲水肽易于通过肾小球快速滤过。由于肽不易通过肾小管重吸收，因此它们常常具有较高肾清除率和较短的半衰期。肽清除的其他次要途径是蛋白酶体和肝脏的内吞和降解。比较动物模型中的全身清除率和肾清除率，可提供关于肾清除率是否可能是主要清除途径的有用信息。

对于肾功能损伤患者，可能需要调整肽类药物的剂量，以避免蓄积和较高的药物暴露量，因为对肾功能障碍患者的不当剂量可能导致毒性或无效治疗。已经开发了几种降低肽肾清除率和延长半衰期的策略。接下来将对这些进行概述。

·增加血浆蛋白结合

当肽与膜蛋白或血清蛋白结合时，其肾清除率降低。一个实例是环肽类药物奥曲肽(一种用于内分泌肿瘤的治疗)，由于与脂蛋白结合(未结合部分0.65)，其在人体中具有约100分钟的半衰期。

·与白蛋白结合小分子共价连接

将白蛋白结合小分子共价附接到肽上，可以通过高度结合的小分子与白蛋白间接相互作用，降低肾小球滤过率，改善蛋白水解稳定性，并延长半衰期。

·与大聚合物缀合

将肽与大的合成或天然聚合物或碳水化合物缀合，可以增加其分子量和流体动力学体积，从而降低其肾清除率。用于肽缀合的常见聚合物有PEG、聚唾液酸(PSA)和羟乙基淀粉(HES)。

·与长寿血浆蛋白融合

血浆蛋白(例如白蛋白和免疫球蛋白(IgG)片段)在人体内的半衰期较长，为19–21天。由于MW较高(67–150kDa)，这些蛋白的肾清除率低，并且它们与新生的Fc受体(FcRn)的结合减少了血管上皮通过胞饮作用进行的清除。肽与白蛋白或IgG片段的共价连接可降低肾清除率并延长半衰期。

融合蛋白延长生物制品半衰期以制造更好的生物制品的策略(Fusion Proteinsfor Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters WilliamR.Strohl BioDrugs.2015；29(4):215–239)；

PAS化：PEG化的生物替代方法，延长药物活性蛋白的血浆半衰期(Schlapschy,M,Binder,U,Borger,C et al.PASYlation:a biological alternative to PEGylation forextending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins.ProteinEng Des Sel.2013；26(8):489-501)；

通过与XTEN蛋白聚合物化学缀合来延长生物活性肽的体内半衰期(Podust,VN,Sim,BC,Kothari,D et al.Extension of in vivo half-life of biologically activepeptides via chemical conjugation to XTEN protein polymer.Protein Eng DesSel.2013；26(11):743-53)；

通过脂化法将多肽转化为药物前导物(Zhang,L,Bulaj,G.Converting Peptidesinto Drug Leads by Lipidation.Curr Med Chem.2012；19(11):1602-18)；

治疗性蛋白PEG化的障碍与陷阱(Gaberc-Porekar,V,Zore,I,Podobnik,B etal.Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins.Curr OpinDrug Discov Devel.2008；11(2):242-50)；

长寿命多肽的进化多肽半衰期延长技术和新兴的混合方法(By Dr RonaldV.Swanson-Long live peptides evolution of peptide half-life extensiontechnologies and emerging hybrid approaches.From Drug Discovery World on lineSpring 2014)。

聚乙二醇化

亲水性聚合物聚乙二醇长链附接至目标分子上，聚乙二醇化最初被认为是一种修饰，以防止免疫系统识别外源蛋白，从而使其能够用作治疗药物。一旦形成，针对未修饰药物的抗体可以快速中和并清除蛋白质药物。出乎意料的是，聚乙二醇化即使在没有抗药物抗体1的情况下也能改善蛋白质的药代动力学。简单地通过使药物分子更大，聚乙二醇化导致药物被肾脏过滤得更慢。随后，增加大小或流体动力学半径导致肾清除率降低和半衰期增加的经验观察结果成为蛋白质和肽类药物聚乙二醇化的主要依据。聚乙二醇化对分子有各种作用，包括使蛋白质或肽更具水溶性，并保护它们免受蛋白水解酶的降解。聚乙二醇化还会影响治疗蛋白与其同源细胞受体的结合，通常会降低亲和力。PEG聚合物在大小、结构和附接模式上的变化会影响附接药物的生物活性。

第一代聚乙二醇化方法充满了挑战。然而，聚乙二醇化的化学反应非常简单。该过程涉及将聚乙二醇链共价附接到蛋白质或肽的活性侧链上。例如，PEG很容易附接到蛋白质或肽2表面赖氨酸的-氨基上。该反应依赖于pH值。在高pH(8.0或更高)下，赖氨酸侧链氨基通过N-羟基琥珀酰亚胺共价附接到PEG上。这种方法通常会产生一个含有不同数目的PEG链的产物家族，这些PEG链附接在蛋白质的不同位点，而不是单一的离散产物3。首批获得批准的聚乙二醇化药物是牛培加酶(PEG化牛腺苷脱氨酶)作为用于严重联合免疫缺陷的酶替代疗法，以及培门冬酶(PEG化天冬酰胺酶)用于治疗急性淋巴细胞白血病1。这些药物是各种聚乙二醇化物质的复杂混合物，但与天然酶相比，治疗特性有所改善，包括血清半衰期增加和蛋白质免疫原性降低。由于PEG固有的多分散性，难以实现质量和批次间再现性。尽管存在这种限制，但两种PEG化干扰素(聚乙二醇干扰素α-2b和聚乙二醇干扰素α-2a)是许多单PEG化位置异构体的异质群体，已获得FDA批准用于治疗丙型肝炎。这些药物分别于2001年和2002年上市。

对基本的聚乙二醇化技术进行了各种改进和变化。第二代聚乙二醇化工艺引入了支化结构的使用以及PEG附接的替代化学反应。特别地，带有半胱氨酸反应性基团(例如马来酰亚胺或碘乙酰胺)的PEG可使聚乙二醇化靶向肽或蛋白质中的单个残基，从而降低最终产物的异质性，但由于PEG本身的多分散性而无法消除异质性。

虽然聚乙二醇化的最初依据是为了降低免疫原性；然而，已有一些免疫原性聚乙二醇化蛋白的实例。一个实例是聚乙二醇化尿酸氧化酶，一种降低痛风患者血浆尿酸水平的酶。在临床试验中，相对较高百分比的痛风患者对治疗无反应，并产生针对PEG的特异性抗体，但对尿酸酶蛋白2无特异性抗体。通常也被认为是非免疫原性的聚乙二醇化脂质体，在一些研究中被发现具有免疫原性。聚乙二醇化脂质体引发强烈的抗PEG免疫球蛋白M(IgM)反应。此外，多次注射PEG-葡糖苷酸酶可引发产生特异性抗PEG IgM抗体，从而加速PEG修饰蛋白质从体内清除。

使用PEG作为改性剂的一个主要潜在缺点是其不可生物降解。美国食品及药品监督管理局(FDA)已批准将PEG用作药物载体，包括可注射、局部、直肠和鼻腔制剂。PEG的毒性很小，可通过肾脏(对于PEG<30kDa)或粪便(对于PEG>20kDa)1从体内完整清除。对动物重复施用某些聚乙二醇化蛋白导致观察到肾小管细胞空泡化。最近，在与大(≥40kd)PEG缀合的蛋白的毒性研究中也看到脉络丛上皮细胞空泡化。脉络丛上皮细胞产生脑脊液并形成血CSF屏障。细胞空泡化的长期负面后果尚不清楚，但对于一些潜在的疗法来说，这确实是一个不良后果。一种可能的替代是用可生物降解的聚合物代替PEG。聚合物，例如羟乙基淀粉(HES)是一种可能的替代。HES无毒，可生物降解，并可用作血液扩张物。HES化过程在通过增加肽的流体动力学半径来降低肾清除率方面的作用类似于PEG化，但由于生物可降解性，可能赋予较低的蓄积倾向。然而，与PEG一样，HES和其他提出的可生物降解聚合物PEG替代品是多分散的，使得最终产物和代谢产物的表征变得困难。减轻这两个问题的一种新兴解决方案是使用确定的多肽作为聚合物组分；本文稍后将讨论这种方法。

脂化

增加肽半衰期的第二种主要化学修饰方法是脂化，其中涉及脂肪酸与肽侧链4的共价结合。最初设想并开发脂化作为一种延长胰岛素半衰期的方法，其半衰期延长的基本机制与聚乙二醇化相同，即增加流体动力学半径以减少肾滤过。然而，脂质部分本身相对较小，这种作用是通过脂质部分与循环白蛋白的非共价结合间接介导的。白蛋白是人血清(35-50g/L)中的一种大(67KDa)且高度丰富的蛋白质，其天然功能是在全身转运包括脂质在内的分子。与血浆蛋白的结合也可以通过空间位阻保护肽免受肽酶的攻击，这也类似于聚乙二醇化。脂化的一个后果是它降低了肽的水溶性，但是对肽和脂肪酸之间接头进行工程改造可以调节这一点，例如通过在接头内使用谷氨酸盐或微型PEG。接头工程和脂质部分的变化会影响自聚集，从而通过减缓生物分布促成半衰期增加，而不依赖于白蛋白5。

继胰岛素6的开创性工作之后，已探索了各种肽的脂化，特别是糖尿病空间内的肽，包括人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽和GLP-1R/胰高血糖素受体协同激动剂等。目前，FDA批准了两种用于人类的脂化肽类药物。这些都是长效抗糖尿病药，即GLP-1类似物利拉鲁肽和地特胰岛素。

聚乙二醇化和脂化之间潜在的药理学相关差异在于，治疗活性肽与大得多的PEG共价连接，而较小的脂肪酰基肽缀合物与平衡状态下存在的较大白蛋白、结合和未结合形式非共价连接。这可能导致生物分布上的差异，这可能导致不同的药理学，因为接近位于不同组织中的受体可能引发不同的效果。在某些情况下，可能需要更有限的生物分布，而在其他情况下，更大的组织渗透可能很重要。Santi等人开发了有趣的PEG方法变体来解决这一问题，其中利用了具有可预测切割速率的可释放PEG缀合物7。

聚乙二醇化和脂化均通过空间位阻屏蔽赋予对蛋白酶和肽酶的防护，并通过增加流体动力学半径直接或间接延长循环半衰期。这两种方法都利用化学缀合，并且具有灵活性，因为它们不知道用于产生所修饰的肽的方式，无论是生物产生还是合成产生。使用合成肽的优点是，它们可以掺入非天然氨基酸，这些非天然氨基酸被设计成旨在解决许多特定问题，包括由于已知的蛋白水解切割倾向性而导致的不稳定性。如果活性或效力高度依赖于游离末端或修饰的残基(例如C末端酰胺)，则它们在选择附接位点方面也可以更灵活，这一点至关重要。

经典遗传融合：Fc和HSA

与长寿命血清蛋白的经典遗传融合提供了延长半衰期的替代方法，不同于与PEG或脂质的化学缀合。传统上将两种主要蛋白质用作融合配偶体：抗体Fc结构域和人血清白蛋白(HAS)。Fc融合涉及肽、蛋白质或受体外域与抗体Fc部分的融合。Fc和白蛋白融合体不仅通过增加肽类药物的大小延长了半衰期，还利用了机体的自然循环机制：新生Fc受体FcRn。这些蛋白与FcRn的pH依赖性结合可防止融合蛋白在内体中降解。基于这些蛋白的融合体的半衰期可在3-16天范围内，比典型的PEG化或脂化肽长得多。与抗体Fc融合可以改善肽或蛋白药物的溶解度和稳定性。肽Fc融合的一个实例是度拉糖肽，一种目前处于后期临床试验的GLP-1受体激动剂。人血清白蛋白是另一种常用的融合配偶体，是脂肪酰化肽利用的同一种蛋白质。阿必鲁肽是基于该平台的GLP-1受体激动剂。Fc和白蛋白之间的一个主要区别是Fc的二聚体性质与HAS的单体结构相比，导致融合肽以二聚体或单体形式存在，具体取决于融合配偶体的选择。如果靶受体间隔足够近或它们本身是二聚体，则肽Fc融合体的二聚体性质可以产生亲合力作用。取决于靶，这可能是可取的，也可能不可取。

设计的多肽融合体：XTEN和PAS

重组融合概念的一个有趣变化是开发了设计的低复杂性序列作为融合配偶体，基本上是非结构化的亲水性氨基酸聚合物，是PEG的功能类似物。多肽平台固有的生物降解性使其作为PEG的潜在更良性替代而具有吸引力。另一个优点是重组分子的精确分子结构，这与PEG的多分散性相反。与需要保持融合配偶体三维折叠的HSA和Fc肽融合体不同，在许多情况下，与非结构化配偶体的重组融合体可以经受更高的温度或苛刻的条件，如HPLC纯化。

这类多肽中最高级的称为XTEN(Amunix)，全长864个氨基酸，包含六种氨基酸(A、E、G、P、S和T)。由于聚合物具有可生物降解的性质，因此其比通常使用的40kDa PEG大得多，并赋予了相应的更长半衰期。XTEN与肽类药物的融合致使半衰期比天然分子延长60至130倍。两种完全重组生产的XTEN化产品已进入临床，即VRS-859(艾塞那肽-XTEN)和VRS-317(人生长激素-XTEN)。在Ia期研究中，发现VRS-859在二型糖尿病病患者中耐受良好且有效。与之前研究的rhGH产品相比，VRS-317报告了更好的药代动力学和药效学特性，并有可能每月给药一次。

基于类似概念考虑的第二种聚合物是PAS(XL-蛋白GmbH)9。一种无规卷曲聚合物，包含限制性更强的三种不带电的小氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的组。PAS和带高负电荷的XTEN的生物物理特性的差异是否可以促成生物分布和/或体内活性的差异尚不清楚，但随着这些多肽被纳入更多治疗药物以及对融合体行为进行表征，将会揭示这种差异。

所有的肽蛋白融合体，无论其配偶体是Fc、HSA、XTEN还是PAS，通常是由基因编码的，因此受到类似的限制。一个限制是仅掺入天然存在的氨基酸，不同于采用化学缀合的方法，该方法允许使用掺入非天然氨基酸的合成肽。尽管通过扩展遗传密码来克服这一限制的方法正在由Ambrx或Sutro等公司开发，但它们尚未得到广泛应用。第二个限制是肽的N-或C-末端需要与配偶体融合。肽末端常常涉及受体相互作用，与一个或两个末端的遗传融合会极大地削弱活性。由于PEG或脂质缀合位点可以位于肽上的任何位置，因此可以对其进行优化，以最大限度地提高所得治疗药物的生物活性。

融合合成肽和半衰期延长蛋白的杂交方法

尽管遗传融合历来提供了更长半衰期的潜力，但它们缺乏利用化学缀合、聚乙二醇化和脂化的方法在附接位点的灵活性和非天然氨基酸的掺入或肽主链的修饰方面所提供的优势。La Jolla的Scripps研究机构的研究人员首次尝试将遗传融合与化学缀合的优势融合，以延长半衰期，这项技术后来成为生物技术公司CovX10,11的基础。使用催化性醛缩酶抗体，这些研究人员开发了一个平台，通过该平台，抗体的活性位点赖氨酸与掺入到肽或小分子中的β-二酮形成可逆共价烯胺键。所得的复合体被称为CovXBody^TM。这种方法不是通过基因融合，而是通过化学连接，将肽类药物或小分子的功能特性与抗体的长血清半衰期相结合。在对该技术进行初始验证后，研究人员扩大了CovX-Body^TM原型的使用范围，基于整合素靶向拟肽药效团。至少有三种基于这种架构的分子已经进入临床开发阶段：Glp-1R激动剂CVX-096；血管生成素-2结合肽CVX-060；和血小板反应蛋白模拟物CVX-045。

目前，XTEN多肽也被用于化学缀合模式，使其更直接地类似于PEG。使用这种方法制备的第一个XTEN化肽的实例是GLP2-2G-XTEN，其中使用马来酰亚胺-硫醇化学反应将肽与XTEN蛋白聚合物化学缀合。化学缀合的GLP2-2GXTEN分子在大鼠中表现出与重组融合的GLP2-2G-XTEN相当的体外活性、体外血浆稳定性和药代动力学。

在完全设计的XTEN或PAS多肽序列中，诸如赖氨酸或半胱氨酸侧链等反应性基团的数量和间隔可以通过位点导向的变化来精确控制，这是由于组成多肽序列的氨基酸组受到限制。这为可能利用Fc或白蛋白(其序列天然含有许多反应性基团)的方法提供了额外的灵活度，并与依赖高度专门化活性位点中的反应性残基的CovX技术形成对比。此外，由于缺乏XTEN或PAS的三级结构，因此在偶联和缀合物纯化中使用的条件和化学反应提供了更多灵活性。

总之，不断出现杂合肽半衰期延长方法，其结合了化学缀合和遗传融合方法的优势并克服了其各自的局限性。这些方法能够产生基于重组多肽的配偶体的分子，其赋予更长的半衰期，但使治疗肽部分不受仅由天然L-氨基酸组成或者仅配置为在N-或C-末端融合的线性、单向多肽的限制，从而为广泛的长效肽基药物打开了大门。

范例

现在将参考具体实施例描述本发明。这些仅仅是示例性的，仅用于说明性目的：它们并不旨在以任何方式限制所要求专利的范围或所描述的发明。这些实施例构成了目前考虑的实施本发明的最佳模式。

实施例1

肽受体/靶蛋白的确定

方法

CY5标记的肽(SEQUENCE ID NO.1；(0.01和0.05μg/ml)针对与表达5528人质膜蛋白的固定HEK293细胞的结合进行了筛选。通过两次重复筛选，选择初始命中并在更特定的验证分析中进行筛选。

结果

图3示出了本发明的肽对人膜蛋白的结合亲和力。确定了三个高选择性靶点：Panx1、SLC35F2和TACR1。根据生物学、组织分布和肽与多种同种型的结合情况，得出PANX1是该肽的主要靶点的结论。

实施例2

本发明的肽减少永生肝细胞中的IL-8分泌

方法

HepG2细胞用肽(5ng/ml)处理24h，然后用100ng/mL LPS处理24h。数据显示至少两个独立实验的平均值±SEM。(*p<0.05**p<0.01***p<0.001)

结果

如图4所示，本发明的肽减少了IL-8分泌。

肝纤维化的标志是炎性标志物(例如IL-8)的分泌增加。降低该标志物的表达证明了该肽能够在这种疾病环境中有效。

实施例3

在人原代肝星状细胞中的抗纤维化活性

方法

用TGF-β1处理人星状细胞以刺激α-SMA(平滑肌作用；纤维化的主要标志物)的表达，然后用肽(5nM；SEQUENCE ID NO.1)处理。对细胞进行共焦成像。

结果

图5示出了处理前后人星状细胞的共聚焦成像。α-SMA表达减少是该肽具有抗纤维化活性的证据。在等量摩尔剂量下，该肽的表现优于Elafibranor。

实施例4

PANX1激活后的细胞内肽浓度

方法

将本发明的肽(SEQUENCE ID NO.1)加入细胞(Caco2)中。通过增加细胞外钙水平在细胞中激活PANX1通道。在激活前后测量肽的细胞内浓度。

结果

在某些生理条件下，即细胞外ATP或钙增加时，泛连接蛋白通道被激活，允许更多的信号传导分子内流。图7显示当通道被激活时，肽的细胞内浓度增加。这是在激活或疾病条件下，肽将优选与通道相互作用的证据。图7中的绿色染料是膜染料，而红色染料是标记的肽。

实施例5

Retrogenix Panx1初始确定

进行了一系列成像研究，以确定肽(SEQUENCE ID NO.1)与靶细胞类型相互作用的动力学和性质。需要这些实验来确定肽靶是细胞内蛋白还是细胞外蛋白。根据图8中的代表性图像，确定该肽系列确实是细胞渗透的，并且在人骨骼肌细胞(HSKMC细胞)中孵育60分钟后显示显著的细胞内蓄积(红色荧光)。用未标记的CY5染料进行的对照染色应不会在该细胞类型中吸收。虽然这一初始研究证实了肽靶是细胞内的，但与早期内体标志物EEA1染料的共染色和共定位证明，该肽似乎位于负责将细胞外膜结合蛋白转运到细胞内部中的这些细胞内细胞器中。与诸如高尔基体和线粒体等其他内部细胞器标志物的类似共染色证明没有重叠。

为了证实培养物中肽的胞外膜结合，进行了受体筛选(Retrogenix)。使用Retrogenix的细胞微阵列技术筛选CY5标记肽(pep_HTWCFL，SEQUENCE ID NO.1的CY5标记版本)的特定细胞表面靶相互作用。

使用不同孵育条件对试验肽与固定的、未转染的HEK293细胞的结合水平进行的研究表明，0.01g/ml的试验肽在固定细胞上孵育30分钟是合适的筛选条件。在此条件下，筛选试验肽与固定的人HEK293细胞结合，分别表达5528个全长人质膜蛋白和分泌蛋白。该初始筛选显示有43个主要命中。

然后，重新表达每一个主要命中以及两个对照受体(CD20(MS4A1)和EGFR)，并使用0.01μg/ml和0.05μg/ml试验肽、等浓度的对照肽以及其他阳性和阴性对照处理进行重新检测。发现了试验肽的九种特异性相互作用。其中包括PANX1(来自两个独立的表达克隆)、SLC35F2和TACR1。

在随后的活细胞微阵列实验中，试验肽显示出与TACR1(P物质受体)和SLC35F2的特异性相互作用，为这些可能是功能相关的相互作用提供了更有力的证据。在固定细胞上，从两个独立的表达克隆中观察到，PANX1对背景显示出最大的信号。固定细胞和活细胞之间的实验差异可以解释在活细胞上观察到的信号缺失。

图3展示了主要命中的结合配偶体和强度。

实施例6

Panx1钙结合

使用Ca²⁺通量分析和流式细胞术研究了Panx-1与肽(SEQUENCE ID NO.1)的结合。Panx-1在调控细胞膜Ca²⁺离子和ATP平衡方面发挥重要作用。可以利用这种关系来监测Panx1的活性。阻断Panx1应导致细胞内Ca²⁺通量显著降低，以响应ATP刺激。

THP-1细胞与FITC荧光染料孵育30分钟，以标记细胞内Ca²⁺离子。然后用ATP刺激细胞以驱动细胞中的钙通量，然后通过流式细胞术检测荧光的增加。在ATP刺激前，将细胞与1μM剂量的肽一起孵育，以研究是否观察到钙通量下降，这种下降是由肽与Panx1结合引起的，从而抑制ATP介导的钙通量。

这些结果如图9(A)至图9(C)所示。

实施例7

APAP(扑热息痛)肝损伤研究

已证明Panx1对肽(SEQUENCE ID NO.1)的作用机制至关重要，发明人研究了肽(及其变体H-{d}W{d}KDE{d}AGKPL{d}V{d}K-OH(SEQ ID NO.86)和DEAGKPLV(SEQ ID NO.90)是否对APAP(N-乙酰基-对氨基苯酚；扑热息痛)诱导的肝损伤模型具有治疗作用。Panx1与肝病的发病机制有很大关系，并且在APAP用药过量时会强烈上调。

一项初步研究表明，与生理盐水对照组相比，200mpk的APAP显著增加了C57BL/6小鼠中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，这是APAP诱导的肝损伤的生化标志。因此，将被认为是肝损伤试验中使用的最佳浓度。

8周龄雄性C57BL/6小鼠在施用APAP(200mg/kg)或生理盐水前禁食过夜(～16h)。初始给药APAP后1.5小时，以10mg/kg的剂量静脉内(IV)施用肽和10PANX1(在高剂量下有效的10Panx1的药理学抑制剂)，并在2.25小时和6小时测量相同肝酶的水平。

根据预处理时间(APAP或盐水注射后1.5小时)给药治疗。每组有8-10只小鼠，包括3-4只用于PK分析，5-6只用于疗效终点。施用途径：试验样为IV，APAP(200mg/kg)为IP。

在早期时间点，与APAP/生理盐水对照相比，所有肽均可将ALT水平降低高达80％，且显著优于诱导ALT降低41％的10PANX。在2.25小时在AST水平中观察到类似趋势。到6小时，APAP/生理盐水组的ALT和AST水平分别增加了4倍和2倍。在此时间点，10PANX的活性很大程度上保持稳定，导致两种肝酶在45％至52％之间无显著降低。在肽处理小鼠中测得的AST和ALT水平在6小时时增加，与APAP对照动物一致。这表明了该肽的药代动力学特征，该肽在最初2小时似乎表现出强效功能性，然后可能发生代谢，这与在小鼠中持续至少3倍时间长的10PANX不同(图10)。

序列表

<110> 努里塔斯有限公司

<120> PANX1相关疾病的治疗

<130> P22JM1WN00642IE

<140>

<141>

<150> EP20156088.5

<151> 2020-02-07

<160> 90

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

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<223> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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<211> 11

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<220>

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<212> PRT

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<223> 肽

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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<223> 肽

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Leu Trp Lys Asp Glu Ala Gly Arg Lys Tyr Pro Leu Val Lys

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Lys Asp Glu Ala Gly Pro Lys Pro Leu Val Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Lys Asp Glu Ala Gly Trp Ala Asp Lys Pro Leu Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Lys Asn Asp Glu Ala Gly Lys Pro Leu Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Lys Asp Ala Lys Pro Leu Val Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 59

Trp Lys Glu Ala Gly Lys Pro Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Lys Asp Glu Ala Lys Pro Leu Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Trp Asp Glu Ala Gly Lys Pro Val

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 62

Trp Lys Asp Glu Ala Gly Lys Pro Val Lys

1 5 10

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 63

Trp Asp Ala Gly Lys Pro Leu Val Lys

1 5

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 64

Trp Lys Asp Glu Ala Gly Lys Pro Leu Val

1 5 10

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 65

Trp Glu Ala Gly Lys Pro Leu Val

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 66

Trp Lys Asp Glu Ala Gly

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 67

Trp Lys Asp Glu Ala

1 5

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 68

Lys Asp Glu Ala Gly Lys Pro Leu

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Lys Asp Glu Ala Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Asp Glu Ala Gly Lys Pro Leu

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Gly Lys Pro Leu Val

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Asp Glu Ala Gly Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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000

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000

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 76

Lys Pro Leu Val Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 77

Trp Lys Asp Glu

1

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

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Ala Gly Lys Pro Leu

1 5

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<400> 79

000

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<400> 80

000

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000

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<400> 82

000

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000

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000

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000

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<223> /备注=“人工序列的说明：合成肽”

<220>

<221> MOD_RES

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<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> D-Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> D-Lys

<400> 86

Xaa Xaa Asp Glu Xaa Gly Lys Pro Leu Xaa Xaa

1 5 10

<210> 87

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /备注=“人工序列的说明：合成肽”

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(5)

<223> /备注=“该序列在n-末端和第5位的Cys残基之间包含硫醚环化”

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> D-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Glu(Me)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Pro(Me)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> D-Lys

<220>

<221> source

<223> 备注=“C-端 OH”

<400> 87

Xaa Lys Glu Xaa Cys Gly Lys Xaa Leu Val Xaa

1 5 10

<210> 88

<211> 426

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 88

Met Ala Ile Ala Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Val Phe Ser Asp Phe Leu

1 5 10 15

Leu Lys Glu Pro Thr Glu Pro Lys Phe Lys Gly Leu Arg Leu Glu Leu

20 25 30

Ala Val Asp Lys Met Val Thr Cys Ile Ala Val Gly Leu Pro Leu Leu

35 40 45

Leu Ile Ser Leu Ala Phe Ala Gln Glu Ile Ser Ile Gly Thr Gln Ile

50 55 60

Ser Cys Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Trp Arg Gln Ala Ala Phe Val

65 70 75 80

Asp Ser Tyr Cys Trp Ala Ala Val Gln Gln Lys Asn Ser Leu Gln Ser

85 90 95

Glu Ser Gly Asn Leu Pro Leu Trp Leu His Lys Phe Phe Pro Tyr Ile

100 105 110

Leu Leu Leu Phe Ala Ile Leu Leu Tyr Leu Pro Pro Leu Phe Trp Arg

115 120 125

Phe Ala Ala Ala Pro His Ile Cys Ser Asp Leu Lys Phe Ile Met Glu

130 135 140

Glu Leu Asp Lys Val Tyr Asn Arg Ala Ile Lys Ala Ala Lys Ser Ala

145 150 155 160

Arg Asp Leu Asp Met Arg Asp Gly Ala Cys Ser Val Pro Gly Val Thr

165 170 175

Glu Asn Leu Gly Gln Ser Leu Trp Glu Val Ser Glu Ser His Phe Lys

180 185 190

Tyr Pro Ile Val Glu Gln Tyr Leu Lys Thr Lys Lys Asn Ser Asn Asn

195 200 205

Leu Ile Ile Lys Tyr Ile Ser Cys Arg Leu Leu Thr Leu Ile Ile Ile

210 215 220

Leu Leu Ala Cys Ile Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Ser Asp Glu Phe Val Cys Ser Ile Lys Ser Gly Ile Leu Arg Asn Asp

245 250 255

Ser Thr Val Pro Asp Gln Phe Gln Cys Lys Leu Ile Ala Val Gly Ile

260 265 270

Phe Gln Leu Leu Ser Val Ile Asn Leu Val Val Tyr Val Leu Leu Ala

275 280 285

Pro Val Val Val Tyr Thr Leu Phe Val Pro Phe Arg Gln Lys Thr Asp

290 295 300

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Pro Thr Phe Asp Val Leu His Phe

305 310 315 320

Lys Ser Glu Gly Tyr Asn Asp Leu Ser Leu Tyr Asn Leu Phe Leu Glu

325 330 335

Glu Asn Ile Ser Glu Val Lys Ser Tyr Lys Cys Leu Lys Val Leu Glu

340 345 350

Asn Ile Lys Ser Ser Gly Gln Gly Ile Asp Pro Met Leu Leu Leu Thr

355 360 365

Asn Leu Gly Met Ile Lys Met Asp Val Val Asp Gly Lys Thr Pro Met

370 375 380

Ser Ala Glu Met Arg Glu Glu Gln Gly Asn Gln Thr Ala Glu Leu Gln

385 390 395 400

Gly Met Asn Ile Asp Ser Glu Thr Lys Ala Asn Asn Gly Glu Lys Asn

405 410 415

Ala Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ser Cys

420 425

<210> 89

<211> 422

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 89

Met Ala Ile Ala Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Val Phe Ser Asp Phe Leu

1 5 10 15

Leu Lys Glu Pro Thr Glu Pro Lys Phe Lys Gly Leu Arg Leu Glu Leu

20 25 30

Ala Val Asp Lys Met Val Thr Cys Ile Ala Val Gly Leu Pro Leu Leu

35 40 45

Leu Ile Ser Leu Ala Phe Ala Gln Glu Ile Ser Ile Gly Thr Gln Ile

50 55 60

Ser Cys Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Trp Arg Gln Ala Ala Phe Val

65 70 75 80

Asp Ser Tyr Cys Trp Ala Ala Val Gln Gln Lys Asn Ser Leu Gln Ser

85 90 95

Glu Ser Gly Asn Leu Pro Leu Trp Leu His Lys Phe Phe Pro Tyr Ile

100 105 110

Leu Leu Leu Phe Ala Ile Leu Leu Tyr Leu Pro Pro Leu Phe Trp Arg

115 120 125

Phe Ala Ala Ala Pro His Ile Cys Ser Asp Leu Lys Phe Ile Met Glu

130 135 140

Glu Leu Asp Lys Val Tyr Asn Arg Ala Ile Lys Ala Ala Lys Ser Ala

145 150 155 160

Arg Asp Leu Asp Met Arg Asp Gly Ala Cys Ser Val Pro Gly Val Thr

165 170 175

Glu Asn Leu Gly Gln Ser Leu Trp Glu Val Ser Glu Ser His Phe Lys

180 185 190

Tyr Pro Ile Val Glu Gln Tyr Leu Lys Thr Lys Lys Asn Ser Asn Asn

195 200 205

Leu Ile Ile Lys Tyr Ile Ser Cys Arg Leu Leu Thr Leu Ile Ile Ile

210 215 220

Leu Leu Ala Cys Ile Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Ser Asp Glu Phe Val Cys Ser Ile Lys Ser Gly Ile Leu Arg Asn Asp

245 250 255

Ser Thr Val Pro Asp Gln Phe Gln Cys Lys Leu Ile Ala Val Gly Ile

260 265 270

Phe Gln Leu Leu Ser Val Ile Asn Leu Val Val Tyr Val Leu Leu Ala

275 280 285

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290 295 300

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Pro Thr Phe Asp Val Leu His Phe

305 310 315 320

Lys Ser Glu Gly Tyr Asn Asp Leu Ser Leu Tyr Asn Leu Phe Leu Glu

325 330 335

Glu Asn Ile Ser Glu Val Lys Ser Tyr Lys Cys Leu Lys Val Leu Glu

340 345 350

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355 360 365

Asn Leu Gly Met Ile Lys Met Asp Val Val Asp Gly Lys Thr Pro Met

370 375 380

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405 410 415

Leu Leu Asp Ser Ser Cys

420

<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQUENCE ID NO. 90

<400> 1

Asp Glu Ala Gly Lys Pro Leu Val

1 5

Claims

1.一种肽，其具有至多50个氨基酸且包含SEQUENCE ID NO:1或SEQUENCE ID NO:1的治疗有效变体，用于治疗或预防受试者中与PANX1相关的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症选自包含纤维化、黑素瘤、肝癌、肝病、膀胱癌、局部缺血、高血压、眼科疾病或病症、微生物感染、肌肉骨骼病症、亨廷顿舞蹈病、脓毒症和多发性硬化的组。

2.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是纤维化，其中纤维化选自包含肝纤维化、皮肤纤维化、肾间质纤维化、肺纤维化、心肌细胞纤维化、心肌纤维化、骨髓纤维化、肾纤维化、组织纤维化和皮肤纤维化的组。

3.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是局部缺血，其中所述局部缺血选自包含脑缺血、缺血性中风、心脏缺血、肠缺血、肢体缺血和由创伤或闭塞引起的局部缺血的组。

4.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是肝癌、膀胱癌或黑素瘤。

5.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是眼科疾病或病症。

6.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是微生物感染。

7.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是肌肉骨骼病症。

8.根据权利要求7所用的肽，其中所述肌肉骨骼病症是腱炎或腕管综合征。

9.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是亨廷顿舞蹈病。

10.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是脓毒症。

11.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是多发性硬化。

12.根据权利要求1所用的肽，其中与PANX1相关的所述疾病或病症是肝病，其中所述肝病是与肝细胞损伤、胆汁淤积性损伤或浸润性损伤相关的肝病。

13.根据权利要求12所用的肽，其中所述肝病选自包含病毒性肝炎、急性酒精性肝炎、丙型肝炎、酒精性脂肪性肝病以及与肝炎相关的肝病的组。

14.根据前述权利要求中任一项所用的肽，其中所述肽由SEQUENCE ID NO.1组成。

15.根据权利要求1至14中任一项所用的肽，其中所述治疗有效变体与SEQUENCE IDNO:1相比包含1至8个修饰，其中所述修饰或每个修饰选自氨基酸的插入、添加、缺失和取代。

16.根据权利要求1至14中任一项所用的肽，其中所述治疗有效变体与SEQUENCE IDNO:1相比包含1至5个修饰，其中所述修饰或每个修饰选自氨基酸的插入、添加、缺失和取代。

17.根据权利要求16所用的肽，其中所述治疗有效变体与SEQUENCE ID NO:1相比包含1至2个修饰，其中所述修饰或每个修饰选自氨基酸的插入、添加、缺失和取代。

18.根据权利要求16或17所用的肽，其中所述修饰包括用D-型氨基酸取代SEQUENCE IDNO:1的一个或多个氨基酸。

19.根据权利要求18所用的肽，其中所述修饰包括用D-型氨基酸取代选自SEQUENCE IDNO:1的残基1、2、5、10和11中的至少两个残基。

20.根据权利要求18或19中任一项所用的肽，其中所述修饰包括用D-型氨基酸取代选自SEQUENCE ID NO:1的残基1、2、5、10和11中的至少三个或四个残基。

21.根据前述权利要求中任一项所用的肽，其中所述肽变体选自SEQUENCE ID NO.2至SEQUENCE ID NO.87和SEQUENCE ID NO.90。

22.根据权利要求21所用的肽，其中所述肽变体是SEQUENCE ID NO.86或SEQUENCE IDNO.87。

23.根据前述权利要求中任一项所用的肽，其中所述肽被修饰。

24.根据权利要求23所用的肽，其中通过对侧链的修饰、在肽合成过程掺入非天然氨基酸和/或其衍生物、使用交联剂以及通过与缀合配偶体缀合、通过与融合配偶体融合、与结合配偶体共价连接、脂化、聚乙二醇化和酰胺化对所述肽施加构象限制的其他方法来修饰所述肽。

25.根据前述权利要求中任一项所用的肽，其中所述肽被环化。

26.一种组合物，其包含具有至多50个氨基酸且包含SEQUENCE ID NO:1或SEQUENCE IDNO:1的治疗有效变体的肽，用于在受试者中治疗或预防与PANX1相关的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症选自包含纤维化、黑素瘤、肝癌、肝病、膀胱癌、局部缺血、高血压、眼科疾病或病症、微生物感染、肌肉骨骼病症、亨廷顿舞蹈病、脓毒症和多发性硬化的组。

27.在受试者中治疗或预防与PANX1相关的疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的肽的步骤，所述肽具有至多50个氨基酸且包含SEQUENCE ID NO:1或SEQUENCE IDNO:1的治疗有效变体，其中所述疾病或病症选自包含纤维化、黑素瘤、肝癌、肝病、膀胱癌、局部缺血、高血压、眼科疾病或病症、微生物感染、肌肉骨骼病症、亨廷顿舞蹈病、脓毒症和多发性硬化的组。