CN115480061A - H-ngal用于检测腹膜炎 - Google Patents

H-ngal用于检测腹膜炎 Download PDF

Info

Publication number
CN115480061A
CN115480061A CN202110605930.XA CN202110605930A CN115480061A CN 115480061 A CN115480061 A CN 115480061A CN 202110605930 A CN202110605930 A CN 202110605930A CN 115480061 A CN115480061 A CN 115480061A
Authority
CN
China
Prior art keywords
molecule
protein
ngal
peritonitis
peritoneal dialysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110605930.XA
Other languages
English (en)
Inventor
纪永生
黄芳芳
J·E·穆诺茨-席尔瓦
蒋涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Fresenius Medical Care Holdings Inc
Original Assignee
Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Fresenius Medical Care Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fresenius Medical Care Deutschland GmbH, Fresenius Medical Care Holdings Inc filed Critical Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Priority to CN202110605930.XA priority Critical patent/CN115480061A/zh
Priority to US17/384,500 priority patent/US20220026426A1/en
Priority to PCT/US2021/043040 priority patent/WO2022020760A1/en
Priority to CN202280004351.2A priority patent/CN115715369A/zh
Priority to EP22815218.7A priority patent/EP4348253A1/en
Priority to PCT/CN2022/095940 priority patent/WO2022253173A1/en
Publication of CN115480061A publication Critical patent/CN115480061A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/16—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis with membranes
    • A61M1/1601—Control or regulation
    • A61M1/1619—Sampled collection of used dialysate, i.e. obviating the need for recovery of whole dialysate quantity for post-dialysis analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/28—Peritoneal dialysis ; Other peritoneal treatment, e.g. oxygenation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/14507—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue specially adapted for measuring characteristics of body fluids other than blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/68—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient
    • A61B5/6846—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be brought in contact with an internal body part, i.e. invasive
    • A61B5/6847—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be brought in contact with an internal body part, i.e. invasive mounted on an invasive device
    • A61B5/6866—Extracorporeal blood circuits, e.g. dialysis circuits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或腹膜炎的风险的方法，包括：检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中的H‑NGAL蛋白，如果H‑NGAL蛋白大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险。还提供了用于所述方法的测试条、试剂盒和装置以及特异性结合H‑NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H‑NGAL蛋白来诊断腹膜炎、优选快速诊断腹膜炎的组合物、测试条或试剂盒中的应用。

Description

H-NGAL用于检测腹膜炎
发明领域
本发明涉及腹膜炎诊断，特别地，涉及通过检测腹膜透析透出液中的同型二聚体中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(homodimer Neutrophil gelatinase-associated1ipocalin，H-NGAL)以在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL)是参与先天免疫的蛋白质，其在血液和尿液中以三种形式存在：主要由肾小管细胞释放的25-kD的单体，主要由中性粒细胞合成的45-kD同型二聚体(H-NGAL)，以及与基质金属蛋白酶9(MMP-9)结合的135-kD的异源二聚体。
已知NGAL是急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的标志物(Linjun Cai etal.，“Assays of urine levels ofHNL/NGAL in patients undergoing cardiac surgeryand the impactof antibody configuration on their clinical performances”，Clinica Chimica Acta 403(2009)121-125，DOI：10.1016/j.cca.2009.01.030；LinjunCai et al.，“The origin of multiple molecular forms in urine of HNL/NAGL”，ClinJ Am Soc Nephrol5：2229-2235，2010，DOI：10.2215/CJN.00980110)，并且涉及慢性肾病的病理学过程。
白介素-6(IL-6)是多种细胞产生的多功能蛋白质。在发生腹膜炎时、腹膜炎期间、甚至在腹膜炎之后的腹膜透析透出液(peritoneal dialysis effluent，PDE)中增加。
腹膜炎是腹膜透析患者中常见病症，是导致腹膜透析患者死亡和腹膜透析失败的主要原因之一。早期发现和治疗一般导致腹膜透析相关性腹膜炎预后良好。一般采用白细胞计数实验室培养(3-7天)和影像学检查等检测腹膜炎，并根据培养结果调整抗生素治疗。这些检测腹膜炎的方法需要专业设施，时间较长。本领域需要新的能够方便检测腹膜炎、特别是能够快速诊断腹膜炎的手段，以尽早发现并治疗腹膜炎，从而改善腹膜透析治疗。
发明内容
本发明提供了一种诊断腹膜透析对象中的腹膜炎、特别是快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的方法，包括：检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL，如果H-NGAL大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险；任选地，所述方法还包括检测所述腹膜透析透出液中的IL-6，如果IL-6大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险。通过快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险，可以尽早地发现腹膜炎，从而实现早期诊断和治疗。
本发明还提供了一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和任选存在的吸收垫，其中所述NC膜包含检测线和质控线，其中：所述结合垫包含特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，任选是经标记的；所述检测线包含检测H-NGAL蛋白与所述第一分子形成的复合物的固定化的物质，所述质控线包含结合所述第一分子的固定化的物质。任选地，所述结合垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三分子，任选是经标记的，以及所述NC膜还包含另一检测线，其包含检测IL-6蛋白与第三分子形成的复合物的固定化的物质；以及任选地，所述质控线可以包含结合所述第三分子的固定化的物质。快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的测试条可以居家使用，快速便捷地诊断腹膜炎或腹膜炎风险，从而实现早期诊断和治疗腹膜炎。
本发明还提供了一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、生物素化垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：所述生物素化垫包含生物素标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，所述金标垫包含胶体金标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，所述检测线包含链霉亲和素，所述质控线包含特异性结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的分子，其中任选地，所述第一分子和第二分子是不相同的。
本发明还提供了一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和任选存在的吸收垫，其中：所述结合垫包含特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，任选是经标记的，所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，所述检测线包含检测H-NGAL蛋白和所述经标记的第一分子和/或第二分子形成的复合物的固定化的物质，所述质控线包含结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的物质，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的。任选地，所述结合垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合IL-6蛋白的第四分子，任选是经标记的，并且所述硝酸纤维素膜还包含另一检测线，其包含检测IL-6蛋白与第三分子和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质；以及任选地，所述质控线可以包含结合所述第三分子和/或第四分子的固定化的物质，其中任选所述第三分子和第四分子是不相同的。
本发明还提供了一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的试剂盒，其包含检测H-NGAL蛋白的手段，和任选地包括检测IL-6蛋白的手段。任选地，所述试剂盒还包括参照比色卡，根据检测结果与参照比色卡的比较来确定结果是阴性或阳性。
本发明还提供了一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或腹膜炎风险的装置，其包括：用于检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白的部件和任选地检测IL-6蛋白的部件。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。本发明还提供了用于诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的体外检测。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
本发明还提供了特异性结合IL-6蛋白的分子在制备用于与特异性结合H-NGAL蛋白的分子联合检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于与特异性结合IL-6蛋白的分子联合检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子用于通过检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合用于通过检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断腹膜炎、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险。
本发明还提供了特异性结合IL-6蛋白的分子用于与特异性结合H-NGAL蛋白的分子联合检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子用于与特异性结合IL-6蛋白的分子联合检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析患者的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条具有500pg/mL的H-NGAL截断值。
本发明还提供了特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜炎或患有腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条具有500pg/mL的H-NGAL截断值以及200pg/mL的IL-6截断值。
附图简述
图1：侧向流夹心免疫检测原理
图2：示例的参照比色卡
图3：装配的测试条示意图
图4：胶体金免疫层析测试条结构示意图
图5：免疫层析测试条示意图
图6-8：试纸条检测结果示意图
发明详述
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，ColdSpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
本发明提供了一种在腹膜透析患者中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的方法、产品和装置，以使得可以快速方便地诊断腹膜炎或腹膜炎风险，从而进行相应治疗或预防。使用本发明的方法、产品和装置，可以在患者发生腹膜炎后快速诊断，提供腹膜透析相关性腹膜炎的辅助诊断。快速诊断腹膜炎或腹膜炎风险的方法、产品和装置可以居家应用，快速并便捷地进行诊断，从而早期发现和治疗腹膜炎。
在一个方面，本发明提供了一种诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或腹膜炎风险的方法，包括：检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白，如果H-NGAL蛋白大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险。在进一步的实施方案中，所述方法还包括检测所述腹膜透析透出液中的IL-6蛋白，如果IL-6蛋白大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险。
如本文所用，“对象”或“患者”可互换使用，包括人和非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、羊、牛、狗、猫、兔等，特别是人。
如本文所用，“截断值”、“截止值”或“cutoff值”可互换使用，有时也称为“阳性判断值”。
腹膜透析是将腹膜透析液注入对象腹腔进行透析的过程，透析后从腹腔取出透析液即腹膜透析透出液。腹膜透析包括持续非卧床腹膜透析(简称CAPD)和自动腹膜透析(简称APD)两种类型。持续非卧床腹膜透析是每隔几个小时手动更换腹内的透析液，达到透析的目的。自动腹膜透析是需要借助外界小型机器的腹膜透析，通过预先设置，机器可自动往腹腔内灌注较大体积的透析液，再将其逐渐引流出体外的过程，无需手动更换透析液，可在夜间进行治疗。例如，在各个国家都有《腹膜透析标准操作规程》或类似的行业文件，其中一般会对腹膜透析的处方制定和调整及腹膜透析操作有详细的教导。
通常，对象根据医生判断和所开具的处方，每隔若干小时使用处方所规定体积的透析液进行透析，例如每隔2、3、4、5、6、7、或8小时，使用约1、2、3、4、5、6、7、或8升透析液。在本文中，如果没有特别指出或根据上下文可以另外确定，则默认是CAPD，且单次所用透析液体积为约2升。
根据国际腹膜透析学会指南推荐(ISPD GUIDELINES/RECOMMENDATIONS，Peritoneal Dialysis International，Vol.36，pp.481-508)，通常，对于白天不进行液体交换的APD患者，当出现腹痛的时候没有液体可引出。在这种情况下，应灌入1L腹透液并留腹至少1-2小时，然后引流并检查透出液的混浊度及进行相关检测和培养。在某些可疑感染的病例，或者那些流出液清亮但是有全身或腹部症状的患者，应该做第二次腹透液交换并留腹至少两个小时，再进行送检。本文中对于APD患者对象的透出液样品获取，参照所推荐的方法。
如本文所用，“腹膜透析透出液”(PDE)是指按照腹膜透析标准操作流程进行稳定CAPD或APD透析的患者，使用腹膜透析液进行腹膜透析后，即进行CAPD或APD后，从腹腔引流出的未经其它处理的液体。在一个实施方案中，所述腹膜透析透出液通过使腹膜透析液(例如2升透析液)留腹时间至少2小时后获得。在一个实施方案中，PDE流出后直接用于检测所述H-NGAL和/或IL-6。
如本文所用，“腹膜炎”是由于例如细菌/真菌感染、化学刺激或损伤所引起的一种腹膜炎症，主要表现为腹痛、腹肌紧张以及恶心、呕吐、发热，严重时可致血压下降和全身中毒性反应，如未能及时治疗可死于中毒性休克。
根据国际腹膜透析学会指南推荐(ISPD GUIDELINES/RECOMMENDATIONS，Peritoneal Dialysis International，Vol.36，pp.481-508)，如果对象在以下3条中符合2条即可确诊腹膜炎：(1)与腹膜炎一致的临床特征，即腹痛和/或透析透出液混浊；(2)透析透出液白细胞计数＞100/μL或＞0.1×109/L(至少2小时的留腹时间(dwell time))和(3)透析透出液培养阳性。
如本文所用，“快速诊断”是指在例如40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、8分钟、6分钟、4分钟、2分钟、或1分钟内甚至更短的时间内，能够诊断腹膜炎或腹膜炎风险。“早期诊断”是指在对象发生腹膜炎之后早期例如0-4天、0-3天、0-2天、0-1天、0-24小时、0-18小时、0-12小时、0-11小时、0-10小时、0-9小时、0-8小时、0-7小时、0-6小时、0-5小时、0-4小时、0-3小时、0-2小时、0-1小时内甚至更短的时间内能够诊断腹膜炎或腹膜炎风险。
H-NGAL蛋白是指中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的45-kD同型二聚体形式。NGAL是25kDa糖基化单链单体(人NGAL的GenBank ID：CAA67574.1)，是结合转运小亲脂分子的脂质运载蛋白家族成员。NGAL由活化的嗜中性粒细胞以及肾小管上皮细胞、心肌细胞、子宫、前列腺、唾液腺等组织释放，可在血清和尿液中检出。NGAL可形成二聚体，包括45kDa的二硫键连接的同型二聚体以及与金属蛋白酶9(MMP9，明胶酶B)的135kDa的异源二聚体。在一个实施方案中，所述NGAL是人NGAL，以及所述同型二聚体H-NGAL是人H-NGAL。
IL-6属于gp130细胞因子家族。IL-6优选是从编码212个氨基酸的产物、更优选地在212个氨基酸的肽的N-末端切割的184个氨基酸的IL-6肽的单个基因产生的蛋白(SongM，Kellum JA.Interleukin-6.Crit Care Med 2005；33(Suppl12)：463-465；212个氨基酸长的IL-6前体的NCBI序列登录号NP_000591)。在一个实施方案中，所述IL-6是人IL-6。本文中，IL-6优选涵盖IL-6变体，优选人IL-6的变体。在一个实施方案中，所述IL-6变体是在对象例如人可天然出现的变体，例如等位基因变体、物种变体等。本领域技术人员知道如何识别和确认IL-6及其变体。
在一个实施方案中，H-NGAL蛋白的截断值为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000pg/mL，优选500pg/mL。
在一个实施方案中，IL-6蛋白的截断值为50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000pg/mL，优选200pg/mL。
在本文中，检测H-NGAL和/或IL-6蛋白可以使用本领域已知的任何检测H-NGAL和/或IL-6蛋白的合适方法，例如化学发光、生化方法、免疫学技术(包括例如酶联免疫吸附法(ELISA)、AlphaLISA、免疫印迹法、斑点印迹法、免疫共沉淀、胶体金免疫层析法等)、质谱技术等。在一个实施方案中，H-NGAL和/或IL-6蛋白使用特异性抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合片段、配体、适体等检测。在一个实施方案中，H-NGAL和/或IL-6蛋白使用特异性抗体检测，例如侧向流夹心免疫检测(例如测试条(strip))。
侧向流测定(“LFA”)(也称为侧向流免疫测定(“LFIA”))是一种简单易用的测定，用于确认是否存在靶分析物，如人或动物病原体或生物标记物。侧向流测定通常有一条质控线与一条或多条靶或检测线，一起确认测定是否正常工作。它们可以是定性的、可视的，或者在与读取器技术(如
Figure BDA0003092424000000061
)结合使用时，是定量的。尽管“竞争性测定”可适用于本文(例如通过使用富集方法，例如离心以增加检测灵敏度)，夹心(或“非竞争性”)测定通常优选用于本文中。侧向流夹心免疫检测原理可见图1。在非竞争性免疫测定中，阳性测试通常通过在检测线位置存在有色线来表示。非竞争性免疫测定是具有多个抗原位点的大分子量分析物的理想选择。一般来说，非竞争性免疫分析比竞争性免疫分析具有更低的检测限(更高的分析灵敏度)。通常，非竞争性免疫分析可以检测皮克/毫升的数量级，而竞争性分析则是纳克/毫升。
侧向流装置通常利用带有硝化纤维素膜、有色乳胶纳米颗粒(或诸如磁珠或有色苯乙烯球等标签)和抗体的免疫分析技术进行快速分析。当来自PDE的样品被添加到侧向流装置中时，样品沿着测定装置流动，通过结合垫进入硝化纤维素膜，然后进入吸收垫以吸收多余的样品。样品垫作为吸收过程的第一阶段，在某些情况下包含过滤器，以确保样品的准确和受控流动。储存结合标签和抗体的结合垫接收样本。如果存在靶，则固定化的结合抗体和标记结合靶并继续沿着装置迁移。当样品沿着装置移动时，位于硝化纤维素膜上的结合试剂在检测线结合靶。彩色线的形式和线密度的变化取决于存在的靶的数量。一些靶可能需要量化以确定靶浓度，例如通过使用读取器。可以使用更复杂的系统来获取定量数据，例如可以利用免疫荧光技术和读取器来测量PDE中标记物的数量，通过将获得的值与预定截断值进行比较来向患者和临床医生提供更多信息。
US20050250141A1(2005年11月10日)公开了多路侧向流测定、相关方法和装置，其内容通过本引用并入本文。US 6924153 B1、US 128871 B2和US 7785899 B2，其内容通过引用并入本文，公开了能够检测多种分析物的各种侧向流测试试剂盒。
例如，胶体金免疫层析法将特异性抗体(或抗原)以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到测试条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定抗体(或抗原)区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。胶体金免疫层析试纸条结构示意图请见图4。
如本文所用，“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，例如全长抗体的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。参见Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用并入本文。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和包含抗体的至少一部分以足以具有抗原特异性结合能力的多肽。
如本文所用，“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。提及抗体与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用，本文所用术语“特异性结合”或“特异性识别”指所述相互作用取决于结合配偶体上特定氨基酸序列或结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换句话说，抗体优先结合或识别结合配偶体，即使结合配偶体存在于其他分子或生物体的混合物中。结合可以通过共价或非共价相互作用或两者的组合来介导。换句话说，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指抗体与抗原决定簇或表位是特异性免疫反应性的，而与其他抗原决定簇或表位不是免疫反应性的。特异性或免疫特异性结合抗原的抗体可以低亲和力结合具有其他肽或多肽，如通过例如放射免疫测定(“RLA”)、酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、BIACORE或本领域已知的其他测定所确定。特异性结合抗原的抗体或其片段可与携带相同表位的相关抗原交叉反应。优选地，与抗原特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应。
特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离平衡常数(KD)表示。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。解离平衡常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10-8M，例如小于约10-8M、10-9M、10-10M或10-11M或更小的KD结合该抗原。在某些实施方案中，当KD≤10×10-8M时，本发明的抗体或其抗原结合片段被认为特异性地结合H-NGAL或IL-6蛋白。本领域技术人员可以获得H-NGAL蛋白、NGAL蛋白以及IL-6蛋白的特异性抗体。
检测H-NGAL蛋白可以使用任何合适方法或方式进行。在一个实施方案中，可以直接检测H-NGAL蛋白，例如通过质谱或使用H-NGAL蛋白特异性抗体或其抗原结合片段进行。在另一个实施方案中，可以间接检测H-NGAL蛋白，例如首先检测总NGAL(例如包括单体形式和同型二聚体形式，或者包括单体形式、同型二聚体形式和异源二聚体形式)蛋白，然后检测单体形式或者单体形式和异源二聚体形式，从而确定H-NGAL蛋白。
例如，特异性结合NGAL同型二聚体形式而非异源二聚体形式的IgG1单克隆抗体以“N457”提供，可从芬兰图尔库的HyTest有限公司购得(Cat.#4NG7-N457)。HyTest提供的其他抗体(包括N308和N432)与N457具有相似的结合特异性。结合NGAL的单体、同型二聚体和异源二聚体形式的抗体包括HyTest有限公司的N316、N417、N422和N461。仅用于检测NGAL同型二聚体形式的酶免疫测定法(“夹心免疫测定法”)含有N316作为NGAL捕获抗体和N457作为检测抗体，参见“Neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL)”TechNotes，p.2(Jan.2020by HyTest Ltd.)，其内容通过引用并入本文。因此，在某些实施方案中，测定中H-NGAL的检测抗体可以选自N457、N308、N432及其任意组合，而捕获抗体可以选自N316、N417、N422、N461及其任意组合。
在一个实施方案中，本发明提供的在腹膜透析患者中诊断腹膜炎或腹膜炎风险的方法包括：
(a)检测腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白；或
(b)检测腹膜透析透出液中的总NGAL，包括单体形式NGAL、H-NGAL和异源二聚体形式，并检测单体形式和可能存在的异源二聚体形式，从而确定H-NGAL的量。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在腹膜透析患者中诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的方法，包括：
-获得所述患者的腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子例如抗体与待测样品接触，任选所述第一分子固定在固体支持物例如酶标板上；以及
-检测形成的复合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在腹膜透析患者中诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的方法，包括：
-获得所述患者的腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子例如抗体与待测样品接触，任选所述第一分子固定在固体支持物例如酶标板上；
-加入特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子例如抗体，任选是标记的，例如酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶)标记的，其中所述第二分子与第一分子结合H-NGAL蛋白上不同的表位；
-任选地，加入特异性结合第二分子的物质，例如抗第二分子的抗体，任选是标记的，例如酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶)标记的，以及
-检测形成的复合物。
在一个实施方案中，所述检测可以是本领域已知的显色反应，例如使用底物邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、硝基苯磷酸盐(pNPP)、二氨基联苯胺(DAB)等。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在腹膜透析患者中诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的方法，包括：
-获得腹膜透析患者的腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一抗体分子与待测样品接触，其中所述第一抗体分子用生物素标记；
-加入特异性结合H-NGAL蛋白的第二抗体分子，其中所述第二抗体分子是胶体金标记的，并且所述第二抗体分子与第一抗体分子是结合H-NGAL蛋白上不同表位的不同抗体，任选地，所述第一和第二抗体分子独立选自N316和N457；
-加入链霉亲和素，其中链霉亲和素固定在固体支持物例如硝酸纤维素上，以及
-检测形成的复合物。
在一个实施方案中，所述特异性结合H-NGAL蛋白的第一和第二分子是独立选自N316和N457(海肽生物科技(上海)有限公司)的抗体。在一个实施方案中，第一分子是抗体N457，第二分子是抗体N316。
在进一步的实施方案中，所述诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的方法还包括检测腹膜透析透出液样品中的IL-6蛋白。用于检测IL-6的工具是本领域已知的，例如抗IL-6抗体，包括多克隆和单克隆抗体及其片段，例如M-BE8(EP0430193；KLEIN，B.，et al.1991，Murineanti-interleukin 6monoclonal antibody therapy for a patient with plasma cellleukemia，Blood 78，1198-1204)或M-23C7，或与其识别的表位结合的抗体。
腹膜透析透出液中蛋白质浓度可以根据本领域已知的任何合适方法测定，例如包括但不限于化学发光、生化、亲和层析、免疫印迹以及质谱等方法。测定样品中特定蛋白浓度的方法是本领域技术人员熟知的。
也可以使用测试条来检测样品中待测物(例如H-NGAL和/或IL-6蛋白)是否大于等于截断值，例如可以使用具有所需截断值的测试条(strip)来进行。本领域技术人员已知如何制备本文所述的测试条，例如具有特定截断值的测试条。
在某些实施方案中，使用具有给定截断值(例如对于H-NGAL蛋白为500pg/mL；对于IL-6蛋白为200pg/mL)的测试条检测腹膜透析透出液中的H-NGAL和/或IL-6蛋白，根据检测结果来判断腹膜透析透出液中是否H-NGAL和/或IL-6蛋白大于等于截断值。
在一个方面，本发明提供了一种治疗腹膜透析对象中腹膜炎的方法，包括：检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白；确定H-NGAL水平；将所述H-NGAL水平与截断值比较；如果所述H-NGAL水平超过截断值，施用抗生素治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗腹膜透析对象中腹膜炎的方法，包括：检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白和IL-6蛋白；确定H-NGAL水平和IL-6水平；将所述H-NGAL水平和IL-6水平与截断值比较；如果所述H-NGAL水平和IL-6水平均超过截断值，施用抗生素治疗。
所述H-NGAL的截断值和IL-6的截断值如本文所述。在一个实施方案中，H-NGAL蛋白的截断值为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000pg/mL，优选500pg/mL。在一个实施方案中，IL-6蛋白的截断值为50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000pg/mL，优选200pg/mL。
所述抗生素治疗可以是单药物抗生素或组合治疗抗生素。在一个实施方案中，所述单药物抗生素包括厄他培南(INVANZTM)、头孢西丁、多利培南(DORIBAXTM)、亚胺培南/西司他丁(PRIMAXINTM)、美罗培南(MERREMTM)、莫西沙星(AVELOXTM)、哌拉西林/他唑巴坦(ZOSYNTM)、替卡西林/克拉维酸盐(TIMENTINTM)和替吉环素(TYGACILTM)。在一个实施方案中，所述组合治疗抗生素包括头孢吡肟(MAXIPIMETM)、头孢噻肟(CLAFORANTM)、头孢他啶(FORTAZTM)或头孢曲松(ROCEPHINTM)联合甲硝唑(FLAGYLTM)，或者头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星(CIPROTM)、左氧氟沙星(LEVAQUINTM)联合甲硝唑，或者头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、左氧氟沙星联合甲硝唑，或者庆大霉素或妥布霉素联合克林霉素(CLEOCINTM)或甲硝唑(有或无氨苄西林)。
在一个方面，本发明提供了用于在腹膜透析患者中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(包含检测线、质控线)和任选存在的吸收垫(例如图5所示)，其中所述结合垫包含特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子(任选是经标记的)，所述检测线包含检测H-NGAL蛋白与所述第一分子形成的复合物的固定化的物质，所述质控线包含结合所述第一分子的固定化的物质。在进一步的实施方案中，在所述测试条中，所述结合垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三分子(任选是经标记的)，所述硝酸纤维素膜还包含另一检测线，其包含检测IL-6蛋白与第三分子形成的复合物的物质，以及所述质控线可以包含结合所述第一分子和/或第三分子的物质。
在一个实施方案中，所述固体支持物从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(包含检测线和质控线)和吸收垫。
在一个方面，本发明提供了一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、生物素化垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：所述生物素化垫包含生物素标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，所述金标垫包含胶体金标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，所述检测线包含固定化的链霉亲和素，所述质控线包含特异性结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的分子，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的。
如本文所用，样品垫用于将待测样品施加于其上，可以根据本领域已知的任何合适的方法制备。
如本文所用，结合垫包含可以与样品中待测分子相结合的捕获分子，任选是标记的。
如本文所用，生物素化垫包含可以特异性结合样品中待测分子的生物素化的分子。如本文所用，金标垫包含可以特异性结合待测分子或待测分子和捕获分子形成的复合物的胶体金标记分子例如抗体。参见图3所示B和D区。
如本文所用，硝酸纤维素膜包含一或多个检测线，其含有可以与待测分子和捕获分子形成的复合物相结合的固定化的检测分子。两个检测线之间相距一定距离，例如距离0.5-5mm，如0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mm，以彼此不干扰检测结果。本领域已知如何设置测试条的各个检测线。
如本文所用，质控线用于确认检测是否有效。质控线和检测线之间相距一定距离，例如距离0.5-5mm，如0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mm，能够实施检测和判断检测是否有效。本领域已知如何设置质控线和检测线。
如本文所用，吸收垫用于通过吸收液体使得液体在其它垫上流动和/或吸收多余的样品。
如本文所用，连续是指相邻区域彼此接触，优选具有重叠部分，从而可以使得样品从一个区域扩散至相邻区域。本领域技术人员根据本领域技术知识可以确定所述重叠部分具有多少重叠，例如可以为0.5-4.0mm，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mm。
例如，所述测试条可以具有以下特征至少之一：(a)所述样品垫和结合垫具有重叠部分，其中优选所述样品垫在所述结合垫之上；(b)结合垫和硝酸纤维素膜具有重叠部分，其中优选所述结合垫在所述硝酸纤维素膜之上，以及(c)硝酸纤维素膜和吸收垫具有重叠部分，其中所述吸收垫在所述硝酸纤维素膜之上。进一步地，当包括生物素化垫和金标垫时，所述测试条还可以具有以下特征至少之一：(d)生物素化垫和金标垫具有重叠部分，其中优选所述生物素化垫在所述金标垫之上；和(e)金标垫和硝酸纤维素膜具有重叠部分，其中优选所述金标垫在所述硝酸纤维素膜之上。
如本文所用，所述特异性结合H-NGAL或IL-6蛋白的分子是可以特异性结合H-NGAL或IL-6蛋白的任何合适分子，包括例如抗体(优选单克隆抗体)或其抗原结合片段、配体、适体等。本领域已知可以特异性结合H-NGAL或IL-6蛋白的抗体。
如本文所用，所述标记是可以用于标记H-NGAL和/或IL-6蛋白的任何分子或手段，包括例如但不限于生物素、荧光、放射性、发光、化学、酶、颗粒标记例如乳胶颗粒、胶体金等等。在一个实施方案中，所述标记选自胶体金标记和生物素标记。
如本文所用，所述检测复合物的物质是可以指示所述复合物是否存在的合适物质，例如包括但不限于抗体或其抗原结合片段、配体、适体，优选选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或其抗原结合片段，更优选单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员根据本领域技术知识可以选择合适的检测复合物的物质。例如，在标记是酶标记的情况下，所述物质可以是所述酶的底物，其被酶催化产生可以观测(例如目测或通过检测装置)的信号，例如显色、发光、荧光等；在标记是胶体金、同位素、发光等标记的情况下，所述物质可以是结合(例如特异性结合)所述复合物或所述复合物中一个分子的物质(例如抗体)，或是结合分子所带标记的物质(例如抗体)，从而可以通过检测标记发出的信号来检测复合物的存在与否。在一个实施方案中，所述标记是生物素，所述检测复合物的物质是链霉亲和素。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在腹膜透析患者中诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述结合垫包含特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子(任选是经标记的)，以及特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子(任选是经标记的)，所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，所述检测线包含检测H-NGAL蛋白和所述第一分子和/或第二分子形成的复合物的固定化的物质，所述质控线包含结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的物质，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的。在进一步的实施方案中，在所述测试条中，所述结合垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三分子(任选是经标记的)，以及特异性结合IL-6蛋白的第四分子(任选是经标记的)，所述硝酸纤维素膜还包含另一检测线，其包含检测IL-6蛋白与第三分子和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质，以及所述质控线可以任选包含结合所述第三分子和/或第四分子的固定化的物质，其中任选所述第三分子和第四分子是不相同的。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和任选存在的吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：
所述结合垫包含：
(a)特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，任选是经标记的，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的；
(b)特异性结合IL-6蛋白的第三分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合IL-6蛋白的第四分子，任选是经标记的，其中任选所述第三分子和第四分子是不相同的；
所述检测线包括包含检测H-NGAL蛋白和所述第一分子和/或第二分子形成的复合物的固定化的物质的检测线以及包含检测IL-6蛋白和所述第三分子和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质的检测线，以及
所述质控线包含特异性结合所述第一分子、第二分子、第三分子和/或第四分子的固定化的物质。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在腹膜透析患者中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、生物素化垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述生物素化垫包含生物素标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第一抗体分子，所述金标垫包含胶体金标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第二抗体分子，所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，所述检测线包含固定化的链霉亲和素，所述质控线包含结合所述第一抗体分子和/或第二抗体分子的固定化的二抗分子(例如抗IgG抗体分子)，其中所述第一抗体分子和第二抗体分子是不相同的。在一个实施方案中，所述生物素化的第一抗体分子是抗体N457(HyTest)，以及所述胶体金标记的第二抗体分子是抗体N316(HyTest)。在进一步的实施方案中，在所述测试条中，所述生物素化垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三抗体分子(任选是经除生物素之外的标记标记的)，所述金标垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第四抗体分子(任选是标记的，例如胶体金标记的)，所述硝酸纤维素膜还包含另一检测线，其包含检测IL-6蛋白与第三分子形成和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质，以及所述质控线可以包含结合所述第三抗体分子和/或第四抗体分子的固定化的物质(例如抗IgG抗体分子)，其中任选所述第三抗体分子和第四抗体分子是不相同的。
本领域已知制备所述测试条各个部分(例如固体支持物、样品垫、结合垫、生物素化垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫)的方法以及合适的材料，对此可参见例如龚频等，“胶体金免疫层析试纸条技术及其在食品安全检测中的应用研究进展”，食品工业科技，2019，40(13)：358-364，文章编号：1002-0306(2019)13-0358-07；以及闫灵芝，“免疫层析试纸条技术在食品安全领域的研究进展”，食品工业科技，DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020110079。
在一个实施方案中，所述测试条具有本文所述的截断值，例如H-NGAL蛋白的截断值可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000pg/mL，和/或IL-6蛋白的截断值可以为50、60、70、80、90、100、200、300、400、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000pg/mL。在一个实施方案中，H-NGAL蛋白的截断值为100、200、300、400、500pg/mL，优选500pg/mL。在一个实施方案中，IL-6蛋白的截断值为50、60、70、80、90、100、150、200pg/mL，优选200pg/mL。
本领域技术人员根据本领域技术知识知道如何制备具有所需截断值的测试条。例如，可以将商购或者制备的已知浓度的待测物标准溶液进行稀释获得一定浓度的待测物溶液；或者利用本领域内已知的对该待测物的定量方法确定待测物溶液的浓度；制备具有不同含量/浓度的特异性结合所述待测物的检测分子的测试条；然后根据测试结果，确定具有所需截断值的测试条所具有的检测分子含量/浓度。
在一个方面，本发明提供了一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的试剂盒，其包含检测H-NGAL蛋白的手段(例如特异性结合H-NGAL蛋白的分子，如抗体或其抗原结合片段)，和任选包括检测IL-6蛋白的手段(例如特异性结合IL-6蛋白的分子，如抗体或其抗原结合片段)，以及任选地包括参照比色卡(可以用于自动化读数)，根据检测结果与参照比色卡的比较来确定结果是阴性或阳性。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含本发明所述的测试条。
在一个方面，本发明提供了一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的装置，其包括：用于检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白和任选地检测IL-6蛋白的部件，以及任选地包括展示检测结果的部件。
在一个实施方案中，所述装置包括，在所述腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白大于等于截断值(例如浓度大于等于本文所述截断值500pg/mL)时，提示患者患有腹膜炎或具有腹膜炎风险的部件，例如给出特定信号(如声音、可视化信息等)的部件，如电子显示屏等。
在一个实施方案中，所述装置可以通过和数字处理设备(例如个人数据助理或智能电话、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、远程网络服务器等)连接，从而给患者或相关人员提示感染或感染风险。
在一个实施方案中，所述装置包括，在所述腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白大于等于截断值(例如浓度大于等于本文所述截断值500pg/mL)以及IL-6蛋白大于等于截断值(例如浓度大于等于本文所述截断值200pg/mL)时，提示患者患有腹膜炎或具有腹膜炎风险的部件。
如本文所用，用于检测H-NGAL蛋白和/或IL-6蛋白的部件可以是能够检测、优选定量所述蛋白的任何合适单元或设备，包括例如测试条、蛋白质阵列、质谱仪等。
在一个实施方案中，所述装置包括本文所述的测试条和/或试剂盒。
如本文所用，展示检测结果的部件可以将检测结果(例如阴性或阳性、或者具体数值等)以任何合适方式(例如提示音、数字信号、联网讯息等)告知对象或相关医务人员，包括例如显示屏等。
所述装置可以与其它系统互联，包括但不限于智能手机、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。
本文描述的装置和方法的实施方案可以在各种系统中实现，包括但不限于智能手机、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。例如，部分操作可以发生在一个设备中，而其他操作可以发生在远程位置，例如一个或多个远程服务器。例如，数据的收集可以在智能手机处进行，数据分析可以在服务器或云计算资源处进行。任何单个计算设备或计算设备的组合都可以执行所述方法。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子联合特异性结合IL-6蛋白的分子用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合IL-6蛋白的分子在制备用于与特异性结合H-NGAL蛋白的分子联合检测腹膜透析患者腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于与特异性结合IL-6蛋白的分子联合检测腹膜透析患者腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条具有选自10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000pg/mL的H-NGAL截断值。在一个实施方案中，所述测试条具有500pg/mL的H-NGAL截断值。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析患者腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条具有选自50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000pg/mL的H-NGAL截断值以及具有选自200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000pg/mL的IL-6截断值。在一个实施方案中，所述测试条具有500pg/mL的H-NGAL截断值以及200pg/mL的IL-6截断值。
在某些实施方案中，特异性结合H-NGAL蛋白的分子选自抗体N457、N308和N432及其任意组合。
除非上下文另有明确指示，词语“或”旨在包括“和”；单词“包含”或“包括”不排除其他元件或步骤。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在某些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％或5％。
本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。上述实施方案仅是示例说明本发明，无限制本发明之意。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方案的限制。
实施例1：测试条制造
1、材料
质控线：羊抗兔IgG抗体，购自山东硕景生物有限公司(Cat.No：P1303)
检测线：链霉亲和素，购自杭州快格科技有限公司(Cat.No：KYSA-003)
抗体：
-H-NGAL抗体(Cat.No：N316和N457)，购自海肽生物科技(上海)有限公司
-IL-6抗体(Cat.No：DA011和DA012)，购自Novoprotein
-NGAL抗体(Cat.No：4C10A7和5A9D12)，购自NanJing GenScript
生物素，购自Thermo Fisher Scientific(Cat.No：21312)
2、测试条制备
2.1样品垫
量取50mL玻璃纤维处理液(三羟甲基氨基甲烷24g、蔗糖50g、海藻糖5g、酪蛋白15g、聚乙烯吡咯烷酮5g、无水碳酸钠3.5g、NaN31g，依次加入，搅拌使之溶解完全，曲拉通X-1002mL，搅拌使之完全混合，加入合适量盐酸调节至pH值为8.5，放置室温保存备用)倒入不锈钢盘内，取一张玻璃纤维(Ahlstrom，Cat.No：8964)放入其中，玻璃纤维被全部浸润饱和后取出。将取出的玻璃纤维放置于网架上，在环境湿度＜20％条件下温度30-40℃充分干燥12小时后得到整张样品垫。按照产品需求进行切割。
2.2硝酸纤维素膜包被及干燥
质控线：固定加液量(1μL/cm)，以1.5mg/mL羊抗兔IgG抗体包被硝酸纤维素膜。
检测线：固定加液量(1μL/cm)，以1.0mg/mL的链霉亲和素包被硝酸纤维素膜。
其中质控线和检测线间隔约4mm。
干燥工艺：温度30-40℃，干燥2小时。
2.3金标垫
在1mL胶体金溶液(万分之四纳米金，粒径35nm)中加入质量浓度为1％K2CO3溶液10μL，以及抗体(H-NGAL抗体(Cat.No：N316)；IL-6抗体(Cat.No：DA011)；NGAL抗体(Cat.No：4C10A7))20μg。金标抗体按10：1离心浓缩，离心浓缩后的金标抗体溶液按照10％-12％比例稀释；然后均匀固相于玻璃纤维，在温度30-40℃干燥12小时，将干燥好的金标抗体反应膜裁成5mm宽度使用。
2.4生物素化垫
将包被抗体(H-NGAL抗体(Cat.No：N457)；IL-6抗体(Cat.No：DA012)；NGAL抗体(Cat.No：5A9D12))与生物素按摩尔比1：20进行生物素化，2-8℃避光反应2h后，透析除去未反应生物素。将生物素化抗体溶液按照0.35％-0.5％比例稀释，均匀固相于玻璃纤维，在温度30-40℃干燥12小时，将干燥好的生物素抗体反应膜裁成5mm宽度使用。
2.5装配
在底板上固定放置：制备的硝酸纤维素膜，然后是上端吸水纸(其与硝酸纤维素膜具有部分重叠(约1.0-1.5mm)并位于其上)，之后是金标垫(其与硝酸纤维素膜具有部分重叠(约1.0-1.5mm)并位于其上)，再是生物素化垫(其与金标垫具有部分重叠(约1.0-1.5mm)并位于其上)，最后是2.1获得的样品垫(其与生物素化垫具有部分重叠(约1.5mm)并位于其上)。制成的测试条从一端至另一端依次是：上端吸水纸、硝酸纤维素膜(依次为质控线、检测线)、金标垫、生物素化垫、样品垫(其上设置有加样孔)。装配的测试条如图3所示。
最后，贴上手柄贴及MAX胶带(条式)，白贴(卡式、笔式)，切成试剂所需宽度，4℃-30℃避光保存。
3、NGAL、IL-6和H-NGAL标准品制备
NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组抗原(单体))：青岛硕景生物科技有限公司，批号：190703
H-NGAL：(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白重组抗原(同型二聚体))：南京艾得普生物技术有限公司，货号：AEP0061
IL-6：(白细胞介素6)：NIBSC，货号：89-548
用腹膜透析透出液阴性样本对相应标准品进行梯度稀释得到不同浓度的NGAL、H-NGAL、IL-6溶液。用具有不同截断值的试纸条对不同浓度的溶液进行检测；每个浓度下重复检测不少于3次。
实施例2：腹膜炎诊断及检测方法
1、根据ISPD指南(ISPD GUIDELINES/RECOMMENDATIONS，ISPDPERITONITISRECOMMENDATIONS：2016UPDATE ON PREVENTION AND TREATMENT，PeritonealDialysis International，Vol.36，pp.481-508)，具有如下至少2种症状的患者被诊断为患有腹膜炎：(1)与腹膜炎一致的临床特征，即腹痛和/或透析透出液混浊；(2)透析透出液白细胞计数＞100/μL或＞0.1×109/L(至少2小时的留腹时间(dwelltime))和(3)阳性透析透出液培养。
腹膜透析患者的腹膜炎根据以上标准诊断。腹膜透析包括持续非卧床腹膜透析(简称CAPD)和自动腹膜透析(简称APD)两种类型。对象根据医生判断和所开具的处方，每隔若干小时使用处方所规定体积的透析液进行透析。如前文所述，根据国际腹膜透析学会指南推荐(ISPD GUIDELINES/RECOMMENDATIONS，Peritoneal Dialysis International，Vol.36，pp.481-508)进行腹膜透析。
2、检测方法
2.1获取腹膜透析患者的腹膜透析透出液样品
2.2将70-80μL(2滴)腹膜透析透出液样品加至实施例1制备的测试条的加样孔中，反应10-15分钟
2.3将测试条与参照比色卡(如图2所示)进行比较，读取显色结果，其中显色强度≥0.5为阳性。阴性结果＝质控线阳性+检测线阴性；阳性结果＝质控线阳性+检测线阳性。部分检测结果可参见图6-8。
3、检测及结果
3.1在患有腹膜炎和临床诊断无腹膜炎的腹膜透析患者的腹膜透析透出液中通过盲法检测IL-6和NGAL蛋白(总NGAL蛋白，包括所述的单体、同型二聚体和异源二聚体形式)，信息如下表1所示。
表1
Figure BDA0003092424000000171
表1所示样品检测结果示于表2。
Figure BDA0003092424000000181
根据表2中的结果，截断值为120ng/mL时检测NGAL显示较好的特异性(87.5％)且灵敏度为90.0％。截断值为200pg/mL时检测IL-6的灵敏度为100％较另外两个截断值的好，且特异性为96.1％较另外两个截断值的略低。但是相比之下，检测NGAL的特异性和灵敏度均比检测IL6低。
3.2在患有腹膜炎和临床诊断无腹膜炎的腹膜透析患者的腹膜透析透出液中通过盲法检测H-NGAL、IL-6和NGAL(总NGAL蛋白，包括所述的单体、同型二聚体和异源二聚体形式)，信息如下表3所示。
表3
Figure BDA0003092424000000191
表3所示样品检测结果示于表4。
Figure BDA0003092424000000201
检测H-NGAL(500pg/mL)(灵敏度98.18％，特异性96.08％)和同时检测(“AND”)H-NGAL(500pg/mL)以及IL-6(200pg/mL)(灵敏度98.18％，特异性97.87％)显示较高的灵敏度和特异性。
4、结论
a)根据表2和表4的结果：总NGAL截断值定为120ng/mL，IL6截断值定为200pg/mL，H-NGAL截断值定为500pg/mL。
b)表4中的结果显示检测H-NGAL比检测总NGAL显示更高的特异性和灵敏度；检测H-NGAL比检测IL-6显示更高的特异性。
c)检测H-NGAL(500pg/mL)(灵敏度98.18％，特异性96.08％)和同时检测H-NGAL(500pg/mL)以及IL-6(200pg/mL)(“AND”)(灵敏度98.18％，特异性97.87％)显示较高的灵敏度和特异性。

Claims (31)

1.特异性结合同型二聚体中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(homodimerNeutrophilgelatinase-associated lipocalin，H-NGAL)的分子在制备用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
2.特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合白介素-6(IL-6)蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
3.特异性结合IL-6蛋白的分子在制备用于与特异性结合H-NGAL蛋白的分子联合检测腹膜透析对象腹膜透析透出液来诊断、优选快速腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
4.特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于与特异性结合IL-6蛋白的分子联合检测腹膜透析对象腹膜透析透出液来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的组合物、测试条或试剂盒中的应用。
5.特异性结合H-NGAL蛋白的分子用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或腹膜炎风险。
6.权利要求1-5任一项的应用，其中所述分子选自抗体或其抗原结合片段、配体、适体，优选选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段，更优选选自单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.特异性结合H-NGAL蛋白的分子在制备用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条优选具有500pg/mL的H-NGAL截断值。
8.特异性结合H-NGAL蛋白的分子和特异性结合IL-6蛋白的分子的组合在制备用于通过检测腹膜透析对象腹膜透析透出液中的H-NGAL和IL-6蛋白来诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的测试条中的应用，其中所述测试条优选具有500pg/mL的H-NGAL截断值以及200pg/mL的IL-6截断值。
9.一种诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的方法，包括：检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白，如果H-NGAL蛋白大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险；任选地，所述方法还包括检测所述腹膜透析透出液中的IL-6蛋白，如果IL-6蛋白大于等于截断值，指示所述对象患有腹膜炎或具有患腹膜炎的风险。
10.权利要求9的方法，其中检测H-NGAL包括：
(a)检测所述腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白；或
(b)检测所述腹膜透析透出液中的总NGAL，包括单体形式NGAL、H-NGAL和异源二聚体形式，并检测单体形式和异源二聚体形式，从而确定H-NGAL的量。
11.权利要求9或10的方法，其中H-NGAL蛋白的截断值为500pg/mL，以及任选地，IL-6蛋白的截断值为200pg/mL。
12.权利要求9-11任一项的方法，包括：
-获得腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子例如抗体与所述样品接触，任选所述第一分子固定在固体支持物上；以及
-检测形成的复合物。
13.权利要求9-12任一项的方法，包括：
-获得腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子例如抗体与所述样品接触，任选所述第一分子固定在固体支持物上；
-加入特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子例如抗体，任选是标记的，其中所述第二分子与第一分子结合H-NGAL蛋白上不同的表位；
-任选地，加入特异性结合所述第二分子的物质，例如抗第二分子的抗体，任选是标记的，以及
-检测形成的复合物。
14.权利要求9-13任一项的方法，包括：
-获得腹膜透析透出液样品：
-将特异性结合H-NGAL蛋白的第一抗体分子与所述样品接触，其中所述第一抗体分子用生物素标记；
-加入特异性结合H-NGAL蛋白的第二抗体分子，其中所述第二抗体分子是胶体金标记的，并且所述第二抗体分子与第一抗体分子是结合H-NGAL蛋白上不同表位的不同抗体；
-加入链霉亲和素，任选地，其中链霉亲和素固定在固体支持物上，以及
-检测形成的复合物。
15.一种治疗腹膜透析对象中腹膜炎的方法，包括：
(a)检测所述对象的腹膜透析透出液中的H-NGAL蛋白；
(b)确定H-NGAL水平；
(c)将所述H-NGAL水平与截断值比较；以及
(d)如果所述H-NGAL水平超过截断值，施用抗生素治疗。
16.权利要求15的方法，其中所述H-NGAL的截断值为500pg/mL。
17.权利要求15或16的方法，其中所述抗生素治疗选自厄他培南、头孢西丁、多利培南、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、莫西沙星、哌拉西林、他唑巴坦、替卡西林、克拉维酸盐和替吉环素；或者头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶或头孢曲松联合甲硝唑；或者头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星联合甲硝唑；或者头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、左氧氟沙星联合甲硝唑；或者庆大霉素或妥布霉素联合克林霉素或甲硝唑。
18.一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和任选存在的吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：
所述结合垫包含特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，任选是经标记的，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的所述检测线包含检测H-NGAL蛋白和所述第一分子和/或第二分子形成的复合物的固定化的物质，并且
所述质控线包含特异性结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的物质。
19.权利要求18的测试条，其中：
所述结合垫还包含特异性结合IL-6蛋白的第三分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合IL-6蛋白的第四分子，任选是经标记的，其中任选所述第三分子和第四分子是不相同的；
所述硝酸纤维素膜还包含检测IL-6蛋白和所述第三分子和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质的检测线，以及
任选地，所述质控线包含特异性结合所述第三分子和/或第四分子的固定化的物质。
20.一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和任选存在的吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：
所述结合垫包含：
(a)特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，任选是经标记的，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的；
(b)特异性结合IL-6蛋白的第三分子，任选是经标记的，并且任选地，还包含特异性结合IL-6蛋白的第四分子，任选是经标记的，其中任选所述第三分子和第四分子是不相同的；
所述检测线包括包含检测H-NGAL蛋白和所述第一分子和/或第二分子形成的复合物的固定化的物质的检测线以及包含检测IL-6蛋白和所述第三分子和/或第四分子形成的复合物的固定化的物质的检测线，以及
所述质控线包含特异性结合所述第一分子、第二分子、第三分子和/或第四分子的固定化的物质。
21.权利要求18-20任一项的测试条，其中所述分子用选自生物素、荧光、放射性、发光、化学、酶或颗粒性标记优选胶体金标记的标记进行标记。
22.一种用于在腹膜透析对象中诊断、特别是快速诊断腹膜炎或具有腹膜炎风险的测试条，其包括固体支持物，该固体支持物具有第一和第二末端，从所述第一末端开始连续包含如下部分：样品垫、生物素化垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述硝酸纤维素膜包含检测线和质控线，其中：
所述生物素化垫包含生物素标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第一分子，
所述金标垫包含胶体金标记的特异性结合H-NGAL蛋白的第二分子，所述检测线包含固定化的链霉亲和素，
所述质控线包含特异性结合所述第一分子和/或第二分子的固定化的物质，其中任选所述第一分子和第二分子是不相同的。
23.权利要求18-22任一项的测试条，其中所述分子和/或物质选自抗体或其抗原结合片段、配体、适体，优选选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或其抗原结合片段，更优选单克隆抗体或其抗原结合片段。
24.权利要求18-23任一项的测试条，其中所述分子是一抗或其抗原结合片段，所述质控线包含结合所述第一、第二、第三和/或第四抗体的二抗或其抗原结合片段，例如抗IgG抗体分子。
25.权利要求18-24任一项的测试条，其具有以下特征至少之一：
(a)样品垫和结合垫具有重叠部分，其中样品垫在结合垫之上；
(b)结合垫和硝酸纤维素膜具有重叠部分，其中结合垫在硝酸纤维素膜之上；
(c)生物素化垫和金标垫具有重叠部分，其中生物素化垫在金标垫之上，
(d)金标垫和硝酸纤维素膜具有重叠部分，其中金标垫在硝酸纤维素膜之上；以及
(e)吸收垫和硝酸纤维素膜具有重叠部分，其中吸收垫在硝酸纤维素膜之上。
26.权利要求18-25任一项的测试条，其具有500pg/mL的H-NGAL蛋白截断值和/或具有200pg/mL的IL-6蛋白截断值。
27.一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析患者的腹膜炎或患有腹膜炎风险的试剂盒，其包含检测H-NGAL蛋白的手段，和任选地包括检测IL-6蛋白的手段，以及任选地包括参照比色卡，根据检测结果与参照比色卡的比较来确定结果是阴性或阳性。
28.权利要求27的试剂盒，其包含权利要求18-26任一项的测试条。
29.一种用于诊断、优选快速诊断腹膜透析对象的腹膜炎或患有腹膜炎风险的装置，其包括：用于检测腹膜透析对象的腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白和任选地检测IL-6蛋白的部件，以及任选地包括展示检测结果的部件。
30.权利要求29的装置，其包含在所述腹膜透析透出液中H-NGAL蛋白大于等于截断值例如500pg/mL时，以及任选地在所述腹膜透析透出液中IL-6蛋白大于等于截断值例如200pg/mL时，提示对象患有腹膜炎或具有腹膜炎风险的部件。
31.权利要求18-26任一项的测试条、权利要求27或28的试剂盒和/或权利要求29或30的装置，其用于权利要求9-17任一项的方法中。
CN202110605930.XA 2020-07-23 2021-05-31 H-ngal用于检测腹膜炎 Pending CN115480061A (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110605930.XA CN115480061A (zh) 2021-05-31 2021-05-31 H-ngal用于检测腹膜炎
US17/384,500 US20220026426A1 (en) 2020-07-23 2021-07-23 System for determining peritonitis using homodimer neutrophil gelatinase-associated lipocalin
PCT/US2021/043040 WO2022020760A1 (en) 2020-07-23 2021-07-23 System for determining peritonitis using homodimer neutrophil gelatinase-associated lipocalin
CN202280004351.2A CN115715369A (zh) 2021-05-31 2022-05-30 H-ngal用于检测腹膜炎
EP22815218.7A EP4348253A1 (en) 2021-05-31 2022-05-30 H-ngal for the detection of peritonitis
PCT/CN2022/095940 WO2022253173A1 (en) 2021-05-31 2022-05-30 H-ngal for the detection of peritonitis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110605930.XA CN115480061A (zh) 2021-05-31 2021-05-31 H-ngal用于检测腹膜炎

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115480061A true CN115480061A (zh) 2022-12-16

Family

ID=84322816

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110605930.XA Pending CN115480061A (zh) 2020-07-23 2021-05-31 H-ngal用于检测腹膜炎
CN202280004351.2A Pending CN115715369A (zh) 2021-05-31 2022-05-30 H-ngal用于检测腹膜炎

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280004351.2A Pending CN115715369A (zh) 2021-05-31 2022-05-30 H-ngal用于检测腹膜炎

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4348253A1 (zh)
CN (2) CN115480061A (zh)
WO (1) WO2022253173A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117741165A (zh) * 2023-11-29 2024-03-22 浙江鼎创医疗科技有限公司 一种高特异性、高灵敏度hnl检测用胶体金免疫层析试纸条及其制备方法以及使用方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009063307A2 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Inflammatory activity detection method using il-6
CN102759623A (zh) * 2012-07-06 2012-10-31 南京基蛋生物科技有限公司 一种检测ngal胶体金试纸条及其制备方法
CN105891503A (zh) * 2015-03-31 2016-08-24 北京科美生物技术有限公司 用于检测嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质(ngal)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法
GB201520657D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Mologic Ltd Improvements in or relating to the detection of peritoneal Diaysis Fluid infection
CN105974128A (zh) * 2016-06-12 2016-09-28 吉林大学 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
US11280788B2 (en) * 2019-01-31 2022-03-22 Fresenius Medical Care Holdings, Inc. Rapid diagnosis of peritonitis in peritoneal dialysis patients

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022253173A1 (en) 2022-12-08
CN115715369A (zh) 2023-02-24
EP4348253A1 (en) 2024-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2972395B1 (en) Rapid test for urine albumin and urine creatinine
US9903865B2 (en) Assay, immunochromatographic test strip, and assay reagent kit for measuring an analyte, using a hematocrit correction
US11280793B2 (en) Anti-VLA-4 related assays
EA008194B1 (ru) Способы обнаружения амниотической жидкости во влагалищном секрете и устройства для реализации указанных способов
EP2295966A1 (en) IgA NEPHROPATHY DETECTION METHOD AND DETECTION KIT
CN114200132B (zh) 一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒
Serebrennikova et al. A semi-quantitative rapid multi-range gradient lateral flow immunoassay for procalcitonin
US7595201B2 (en) Device for measuring an analyte
EP2673646A1 (en) Diagnostic method for urinary tract infection
WO2022253173A1 (en) H-ngal for the detection of peritonitis
US10996228B2 (en) Biomarkers for assessment of preeclampsia
US20170322228A1 (en) Method, kit and test strip for detecting kawasaki disease
CN103630692A (zh) 快速检测尿液c肽的胶体金免疫层析试剂盒及其检测方法
US20220026426A1 (en) System for determining peritonitis using homodimer neutrophil gelatinase-associated lipocalin
CN114236131B (zh) 一种检测甲状腺过氧化物酶抗体及其亚型的试剂盒
CN114019158A (zh) 联检试纸条和检测试剂盒
CN115639371A (zh) 一种反映脂联素质量浓度的试剂盒及其使用方法
JPH0658936A (ja) 糖化蛋白の測定方法
JP2017122586A (ja) 抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）抗体検出法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication