CN115477694B - 高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法 - Google Patents

高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法

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Abstract

本发明涉及Cap38～228蛋白制备技术领域，尤其涉及高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法。步骤包括S1.基于PCV4Cap蛋白和His‑SUMO标签的核苷酸序列，构建带双标签的原核表达载体pET‑28a‑His‑SUMO‑Cap38～228；S2.以pET‑28a‑His‑SUMO‑Cap38～228转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以IPTG进行诱导表达，并对表达条件进行优化，制备出目的蛋白His‑SUMO‑Cap38～228；同时经Ni‑NTA亲和层析柱对目的蛋白His‑SUMO‑Cap38～228纯化；S3.His‑SUMO‑Cap38～228经SUMO蛋白酶酶切后，再次用Ni‑NTA亲和层析柱去除His‑SUMO标签，获得Cap38～228。本发明可有效制备出高纯度的PCV4Cap38～228蛋白，其纯度大于95％，为血清学诊断、Cap蛋白的多抗或单抗以及亚单位疫苗研发提供了PCV4Cap38～228蛋白制备的技术基础。

Description

高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及Cap38~228蛋白制备技术领域，尤其涉及高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法。
背景技术
猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）中无囊膜的单股环状负链DNA病毒，其病毒粒子呈二十面体对称，大小约为17~25 nm。目前，猪圆环病毒共分为4个亚型，分别为猪圆环病毒1型、2型、3型和4型。猪圆环病毒1型（PCV1）对猪无致病性，但猪圆环2型、3型和4型主要能引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated dikseases, PCVAD）、猪皮炎与肾病综合征（PNDS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、断奶仔猪系统衰竭综合征（PMWS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、神经系统疾病、心肌炎和腹泻等临床症状。
PCV4病毒与其它3种亚型PCV病毒的亲缘病毒较远，核苷酸相似性为43.2~51.5%。PCV4基因组大小约为1770 bp，其主要存在2个开放阅读框（Open reading frame, ORF），分别为ORF1和ORF2。ORF1和ORF2分别编码296个氨基酸的Rep蛋白和228个氨基酸的Cap蛋白。与PCV1、PCV2和PCV3类似，Rep蛋白主要与病毒复制有关，而Cap蛋白主要形成病毒衣壳。但是，对其Rep蛋白和Cap蛋白的氨基酸序列分析发现，与其它猪圆环病毒的相似性均低于50%，因此，PCV2和PCV3疫苗对PCV4不存在交叉保护作用。由于PCV4在我国为新发的圆环病病原，目前，尚无疫苗对其防控，而Cap蛋白广泛应用于PCV2和PCV3基因工程亚单位疫苗和诊断试剂，因此，Cap蛋白成为PCV4基因工程亚单位疫苗和诊断试剂盒研发的首选目标。
目前，关于PCV4 Cap蛋白的研究较少，并无其高纯度制备方法的现有技术。并由此，尚无基于Cap 蛋白的PCV4基因工程亚单位疫苗和诊断试剂盒研发的报道，且进一步造成了应用于疫苗和诊断试剂的研发受限。
发明内容
本发明的目的是提供高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法，用于填补现有技术中该技术的空白。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
高纯度猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1.基于PCV4 Cap蛋白和His-SUMO标签的核苷酸序列，构建带双标签的原核表达载体pET-28a-His-SUMO-Cap38~228；
S2.以pET-28a-His-SUMO-Cap38~228转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以IPTG进行诱导表达，并对表达条件进行优化，制备出目的蛋白His-SUMO-Cap38~228；同时经Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白His-SUMO-Cap38~228纯化；
S3.His-SUMO-Cap38~228经SUMO蛋白酶酶切后，再次用Ni-NTA亲和层析柱去除His-SUMO标签，获得Cap38~228。
进一步优选的，S1主要包括：
以PCV4/GX2020/FCG49毒株Cap蛋白核苷酸序列为基础，进行大肠杆菌密码子偏好性优化；
在Cap蛋白核苷酸的N端加入His-SUMO标签的核苷酸序列构建His-SUMO-Cap38~228目标序列；
在His-SUMO-Cap38~228目标序列的N端加入RBS序列及翻译起始信号，同时，在该序列5’和3’端分别加入XbaI和HindⅢ酶切位点；
将所述目标序列和pET-28a载体质粒分别经XbaI和HindⅢ双酶切后，进行胶回收双酶切产物，并使用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，制备出连接产物；
将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落扩大培养，并利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228，用XbaI和HindⅢ 进行双酶切鉴定，并测序鉴定目标序列的正确插入，最终构建获得pET-28a-His-SUMO-Cap38~228表达载体。
进一步优选的，S2中，以pET-28a-His-SUMO-Cap38~228转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以IPTG进行诱导表达，主要包括：
以pET-28a-His-SUMO-Cap转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取阳性单克隆菌落，并加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，在37℃、220 rpm/min培养过夜；
取出1 mL菌液，加入到50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；
37℃、220 rpm/min培养4h，当菌液的OD600达到0.6~0.8时，按1:1000比例加入1mol/L的IPTG 50 μL；
37℃、220 rpm/min培养4h后，以4000 rpm/min，离心收集菌体。
进一步优选的，S2中，对表达条件进行优化，包括：
设置诱导时间为10 h；设置诱导温度为20℃-30℃；设置IPTG浓度为0.2 mmol/L。
进一步优选的，S2中，经Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白纯化，主要包括：先用Binding Buffer 以1:10（W/V）的比例将离心收集的菌体进行重悬后，超声破菌；
10000 rpm/min离心30 min，收集上清，用Binding Buffer平衡镍亲和层析柱；
用Binding Buffer冲洗层析柱，再用Wash Buffer洗脱杂蛋白；
用含有100-500咪唑的Elution Buffer进行洗脱目的蛋白。
进一步优选的，S3主要包括：
在His-SUMO-Cap38~228蛋白溶液中，加入缓冲液；
加入SUMO蛋白酶，室温酶切过夜；
经12% SDS-PAGE分析酶切效果后，将酶切后含PCV4 Cap38~228蛋白的溶液流穿镍亲和层析柱，并收集流穿液。
本发明至少具备以下有益效果：
通过本发明的方法，可有效制备出高纯度的PCV4 Cap38~228蛋白，其纯度大于95%，为血清学诊断、Cap蛋白的多抗或单抗以及亚单位疫苗研发提供了PCV4 Cap38~228蛋白制备的技术基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228结构示意图；
图2为PCV4 Cap蛋白生物信息学分析图；
图3为质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228双酶切鉴定图；
图4为His-SUMO-Cap38~228蛋白的表达形式鉴定图
图5为His-SUMO-Cap38~228蛋白表达条件优化图
图6为纯化His-SUMO-Cap38~228蛋白的SDS-PAGE鉴定图；
图7为纯化蛋白Western-blot鉴定结果图；
图8为Cap38~228蛋白纯化结果图；
图9为His-SUMO-Cap38~228蛋白酶切鉴定图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株和主要试剂
pET-28a载体在实验室保存；大肠杆菌感受态DH5α和BL21购自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗His-Tag单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司；HisTrap FF镍亲和层析柱购自美国GE公司；SUMO蛋白酶购自碧云天生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型） 购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 PCV4 Cap蛋白生物信息学分析
首先用MEGA-Ⅹ对PCV4 Cap蛋白的同源性进行分析，再利用ProtParam 和PSIPRED4.0等在线软件分别对PCV4 Cap蛋白的一级结构和二级结构等进行分析。同时，利用TMHMM2.0、SignalP 5.0和IUPred 3.0等在线软件分别对PCV4 Cap蛋白的跨膜区、信号肽和无序区进行分析。
1.3 重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228构建与鉴定
以PCV4/GX2020/FCG49毒株Cap蛋白核苷酸序列（112~684bp）为基础，进行大肠杆菌密码子偏好性优化，并且在Cap蛋白核苷酸N端加入His-SUMO标签的核苷酸序列构建His-SUMO-Cap38~228目标序列，并在His-SUMO-Cap38~228目标序列的N端加入RBS序列及翻译起始信号。同时，在该序列5’和3’端分别加入XbaI和HindⅢ酶切位点（由北京六合华大基因科技有限公司合成）。将上述目的片段和pET-28a载体质粒分别经XbaI和HindⅢ双酶切后，进行胶回收双酶切产物，并使用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。再将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落扩大培养，并利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228，用XbaI和HindⅢ 进行双酶切鉴定，并送北京六合华大基因科技有限公司测序鉴定目标序列的正确插入，最终构建获得pET-28a-His-SUMO-Cap38~228表达载体（参阅图1）。
1.4 重组His-SUMO-Cap38~228蛋白的可溶性表达分析
将测序正确的重组质粒pET-28a-His-SUMO-Cap转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取阳性单克隆菌落，并加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的液体LB培养基，在37℃、220rpm/min培养过夜。取出1 mL菌液，加入到50 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB液体培养基中，37℃、220 rpm/min培养4h，当菌液的OD600达到0.6~0.8时，按1:1000比例加入1 mol/L的IPTG 50 μL，37℃、220 rpm/min培养4h后，以4000 rpm/min，离心收集菌体，同时设置未加IPTG的对照组。以PBS按1:10（W/V）重悬菌体，超声破菌后，10000 rpm/min离心30 min，分别收集诱导后和未诱导的上清和沉淀。12% SDS-PAGE分析His-SUMO-Cap蛋白的可溶性。
1.5 重组His-SUMO-Cap38~228蛋白表达条件优化
1.5.1最佳表达温度优化
将保存的菌种，以1:50的比例加入25 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的液体LB培养基，37℃、220 rpm/min培养4h，当OD600达到0.6~0.8时，按1:1000比例加入1 mol/L的IPTG25 μL进行诱导表达，分别15℃、20℃、25℃、30℃和37℃下培养4 h，收集菌体。超声破菌后，10000 rpm/min离心30 min，收集诱导后上清，进行12% SDS-PAGE分析。
1.5.2最佳IPTG浓度优化
将保存的菌种，以1:50的比例加入25 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的液体LB培养基，37℃、220 rpm/min培养4h，当OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L IPTG进行诱导，30℃下培养4 h，收集菌体。超声破菌后，进行12% SDS-PAGE分析。
1.5.3最佳诱导时间优化
将保存的菌种，以1:50的比例加入25 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的液体LB培养基，37℃、220 rpm/min培养4h，当OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG进行诱导，37℃下分别培养2h、4h、6h、8h和10h，收集菌体。超声破菌后，进行12% SDS-PAGE分析。
1.6 重组His-SUMO-Cap38~228蛋白的纯化
使用GE公司的镍亲和层析柱对重组His-SUMO-Cap38~228蛋白进行纯化。先用Binding Buffer (50 mmol/L Tris, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑，pH: 8.17) 以1:10（W/V）的比例将离心收集的菌体进行重悬后，超声破菌，功率为40%，工作3 s，停3 s。10000 rpm/min离心30 min，收集上清。用Binding Buffer平衡镍亲和层析柱，将上清流穿镍亲和层析柱后，用Binding Buffer冲洗层析柱，再用Wash Buffer (50 mmol/L Tris，500mmol/L，NaCl 50 mmol/L咪唑，pH: 8.17) 洗脱杂蛋白，最后依次用含有100、150、200和500咪唑的Elution Buffer (50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH: 8.17 ) 进行洗脱目的蛋白。最后经12% SDS-PAGE分析重组His-SUMO-Cap38~228蛋白的纯度。
1.7 Western-blot 鉴定
以兔抗6×His-Tag单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体为二抗对纯化后的重组His-SUMO-Cap蛋白进行Western-blot分析，经ECL显色液显色后观察结果。
1.8 His-SUMO标签切除及Cap38~228蛋白纯化
在纯化后的重组His-SUMO-Cap38~228蛋白溶液中，缓冲体系为（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，3%甘油，pH: 8.17)，加入SUMO蛋白酶，室温酶切过夜。经12% SDS-PAGE分析酶切效果后，将酶切后含PCV4 Cap38~228蛋白的溶液流穿镍亲和层析柱，并收集流穿液。His-SUMO融合标签和His-SUMO酶结合在镍亲和层析柱上，PCV4 Cap38~228蛋白在流穿液中。经12% SDS-PAGE分析后，使用Nano分光光度计进行浓度测定。
2 结果
2.1 PCV4 Cap蛋白生物信息学分析
经MEGA-Ⅹ对PCV4 Cap蛋白的保守性分析发现，该蛋白在PCV4 Cap蛋白中保守性较高（结果未展示）。在线软件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）对PCV4Cap的一级结构进行分析，发现该蛋白共由228个氨基酸残基组成，分子式为C1227H1868N378O330S3，分子量大小为27.29 kDa。理论等电点为11.05，因此在生理条件下带正电荷。同时，该蛋白的不稳定系数为52.96（>40）与平均亲水性值为-0.897（<0），表明该蛋白是亲水的，并且可能不稳定。
根据在线软件PSIPRED 4.0（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）对PCV4Cap的二级结构进行分析（图2a），发现该PCV4 Cap蛋白中3.95%为α-螺旋（69~71：LKD和132~137：YDVLAN）；33.33%为β-折叠（39~52：IFHARFMREVTLSV，61~68：NVGHYDFK，90~102：YYRIRKVKVEFLP, 116~121：AIQLDG，142~144：HGF，150~155：HSRVFT，181~182：IS，190~198：HHGLQYSIQ，204~218：QVWTVRFTLYVQFRE）；62.72%为无规则卷曲（1~38：MPIRSRYSRRRRNRRNQRRRGLWPRASRRYRWRRKNG，53~60：SSFSTPSW，71~89：FIPKGPGTIVNLYSLPFA，103~115：LNGINSNRTYSST，122~131：DYVGEGKNQ，138~141：HSSR，145~149：TNIAR，156~180：PKPQDPSGETHTLHFQPNNKRNQWW，183~189：MADQDLV，199~203：NSNFV，219~228：FDLVNYPKQG）。
利用TMHMM 2.0 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0） 、SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）和IUPred 3.0（https://iupred2a.elte.hu/）等在线软件分别对PCV Cap蛋白的跨膜区、信号肽和无序区进行分析，发现该蛋白无跨膜区（图2 b）， 1~37 aa 为核仁定位信号区（图2c），1~32 aa为 N 端连续无序性（图2 d），表明PCV4 Cap 蛋白的1~37 aa N端氨基酸序列可能会影响蛋白表达。
2.2 重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228的构建与酶切鉴定
重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228经XbaI和HindⅢ双酶切后，大约在6000 bp和1000 bp处有两条特异性条带，与预期大小相符（图3）。测序结果表明，核苷酸序列正确，重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228构建成功。
2.3 重组His-SUMO-Cap38~228蛋白的表达形式鉴定
重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228转化大肠杆杆菌感受态细胞BL21后，分别收集IPTG诱导前和诱导后的菌液上清和沉淀，经12% SDS-PAGE分析发现在34.44 kDa左右出现一条特异性条带，大小与理论值相符。并且对诱导后的上清与沉淀比较，发现在诱导后的上清中存在大量的目的蛋白，因此SUMO标签有效促进了PCV4 Cap蛋白的可溶性表达（图4）。
2.4 pET-28a-His-SUMO-Cap38~228表达条件优化
将含有重组表达质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228的BL21菌液分别在37℃的摇床中培养4h，然后分别对IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等表达条件进行优化，收集菌体后，经超声破菌，并收集上清。然后经12% SDS-PAGE鉴定，结果显示IPTG的最佳终浓度为0.2mmol/L（图5a）、最佳诱导时间为10 h（图5b）、诱导温度为20℃ 25℃和30℃时，可溶性表达量相差不大（图5c）。
2.5 可溶性重组His-SUMO-Cap38~228蛋白纯化
按照最佳表达条件对重组His-SUMO-Cap38~228蛋白进行表达后，经超声破菌，10000rpm/min离心30 min后，收集上清用于纯化。分别用含50 mmol/L 、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L和500 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱并获得目的蛋白。纯化后的样品经12%SDS-PAGE电泳鉴定，大约在34.44 kDa大小处观察到一条特异性蛋白条带（图6a），与预期大小相符，且纯化的PCV4 His-SUMO-Cap38~228蛋白的纯度能达到约95%以上（图6b）。
2.6 重组His-SUMO-Cap38~228蛋白Western-blot鉴定
将纯化的His-SUMO-Cap38~228蛋白进行Western-blot分析，鉴定结果显示，重组表达的His-SUMO-Cap蛋白能与兔抗6×His标签单克隆反应，在约34.44 kDa大小处观察到一条特异性条带，与预期结果一致（图7）。因此，pET-28a-His-SUMO-Cap38~228质粒可以正确表达His-SUMO-Cap38~228蛋白。
2.7 His-SUMO标签切除及Cap38~228蛋白纯化
纯化后的His-SUMO-Cap38~228蛋白经SUMO蛋白酶4℃酶切过夜后，经12% SDS-PAGE鉴定，大约在22.24 kDa大小处存在一条特异性条带，并与PCV4 Cap38~228蛋白的大小相符，且大约在12.2 kDa处存在一条特异性条带，并与His-SUMO标签大小相符（图8）。同时，Western-blot显示，兔抗6×His标签单克隆与12 kDa处蛋白具有特异性反应，不与约22.24kDa大小处的蛋白反应（图9）。经镍亲和层析柱去除His-SUMO标签后，12% SDS-PAGE鉴定显示，在约22.24 kDa大小的条带依然存在，而约12.2 kDa大小的His-SUMO标签消失，表明His-SUMO标签成功切除（图8）。
3 结论
本发明对重组的PCV4 Cap38~228蛋白进行了可溶性高效表达与纯化，其纯度大于95%，为进一步血清学诊断技术、Cap蛋白的多抗或单抗以及亚单位疫苗研发，尤其是病毒样颗粒亚单位疫苗研发等奠定了一定基础。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.高纯度猪圆环病毒4型Cap38~228蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.基于PCV4 Cap蛋白和His-SUMO标签的核苷酸序列，构建带双标签的原核表达载体pET-28a-His-SUMO-Cap38~228；
主要包括：
以PCV4/GX2020/FCG49毒株Cap蛋白核苷酸序列为基础，进行大肠杆菌密码子偏好性优化；
在Cap蛋白核苷酸的N端加入His-SUMO标签的核苷酸序列构建His-SUMO-Cap38~228目标序列；
在His-SUMO-Cap38~228目标序列的N端加入RBS序列及翻译起始信号，同时，在该序列5’和3’端分别加入XbaI和HindⅢ酶切位点；
将所述目标序列和pET-28a载体质粒分别经XbaI和HindⅢ双酶切后，进行胶回收双酶切产物，并使用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，制备出连接产物；
将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落扩大培养，并利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET-28a-His-SUMO-Cap38~228，用XbaI和HindⅢ 进行双酶切鉴定，并测序鉴定目标序列的正确插入，最终构建获得pET-28a-His-SUMO-Cap38~228表达载体；
S2.以pET-28a-His-SUMO-Cap38~228转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以IPTG进行诱导表达，并对表达条件进行优化，制备出目的蛋白His-SUMO-Cap38~228；同时经Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白His-SUMO-Cap38~228纯化；
其中，对表达条件进行优化，包括：设置诱导时间为10 h；设置诱导温度为20℃-30℃；设置IPTG浓度为0.2 mmol/L；
S3.His-SUMO-Cap38~228经SUMO蛋白酶酶切后，再次用Ni-NTA亲和层析柱去除His-SUMO标签，获得Cap38~228。
2.根据权利要求1所述的高纯度猪圆环病毒4型Cap38~228蛋白的制备方法，其特征在于，S2中，以pET-28a-His-SUMO-Cap38~228转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以IPTG进行诱导表达，主要包括：
以pET-28a-His-SUMO-Cap转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取阳性单克隆菌落，并加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，在37℃、220 rpm/min培养过夜；
取出1 mL菌液，加入到50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；
37℃、220 rpm/min培养4h，当菌液的OD600达到0.6~0.8时，按1:1000比例加入1 mol/L的IPTG 50 μL；
37℃、220 rpm/min培养4h后，以4000 rpm/min，离心收集菌体。
3.根据权利要求1所述的高纯度猪圆环病毒4型Cap38~228蛋白的制备方法，其特征在于，S2中，经Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白纯化，主要包括：先用Binding Buffer 以1:10 W/V的比例将离心收集的菌体进行重悬后，超声破菌；
10000 rpm/min离心30 min，收集上清，用Binding Buffer平衡镍亲和层析柱；
用Binding Buffer冲洗层析柱，再用Wash Buffer洗脱杂蛋白；
用含有100-500咪唑的Elution Buffer进行洗脱目的蛋白。
4.根据权利要求1所述的高纯度猪圆环病毒4型Cap38~228蛋白的制备方法，其特征在于，S3主要包括：
在His-SUMO-Cap38~228蛋白溶液中，加入缓冲液；
加入SUMO蛋白酶，室温酶切过夜；
经12% SDS-PAGE分析酶切效果后，将酶切后含PCV4 Cap38~228蛋白的溶液流穿镍亲和层析柱，并收集流穿液。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611359A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN114409741A (zh) * 2021-12-02 2022-04-29 吉林大学 一种pcv2、pcv3和pcv4三联亚单位疫苗及其制备方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087624A (zh) * 2015-08-18 2015-11-25 肇庆大华农生物药品有限公司 一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体及其构建方法和应用
CN108785667B (zh) * 2017-04-28 2021-04-27 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用
CN111087452A (zh) * 2019-12-18 2020-05-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611359A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN114409741A (zh) * 2021-12-02 2022-04-29 吉林大学 一种pcv2、pcv3和pcv4三联亚单位疫苗及其制备方法和应用

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