CN115463062B - 一种抗衰修护乳液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化妆品技术领域，提供一种抗衰修护D相乳液的制备方法和应用。所述D相乳液包含如下质量分数的组分：透明质酸锌0.1‑1.0％，皱叶木兰提取物1.0‑8.0％，黑桑叶根提取物1.0‑8.0％、D相乳化剂0.3～5.0％、油脂1.0～10.0％、多元醇2.0～8.0％、增稠剂0.1～1.0％、防腐剂0.3～1.0％，余量为水。其通过抑制炎症因子IL‑6、IL‑8的活性，抑制MMP‑1、MMP‑3的生成，抑制ROS的产生，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，促进透明质酸的合成，减少衰老细胞的促衰老作用，从而达到抗衰的作用；同时，可以促进皮肤屏障重要蛋白FLG、LOR的生成，达到优异的修护作用。
Description
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种抗衰修护乳液及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
衰老是个持续渐进的过程，表现在分子，细胞，组织和机体水平上功能逐渐变弱或丧失。其中细胞衰老是由应激性损伤和某些生理过程引发的一种细胞状态，其特征是细胞周期的长时间和通常不可逆的停滞，包括分泌特征、大分子损伤和代谢改变等。衰老细胞分泌过多的因子，包括促炎细胞因子和趋化因子、生长调节剂、血管生成因子和蛋白酶和调节剂等，统称为衰老相关分泌表型(SASP)或衰老信息分泌组。SASP可以解释衰老细胞的一些有害的、促衰老作用，SASP因子介导发育衰老、伤口愈合和组织可塑性，并导致炎症性衰老，如下表所示：
衰老相关分泌表型(SASP)
D相乳化技术是为制备出粒径微细、稳定性好而且节省乳化机械能量的乳化工艺，旨在通过稀释的表面活性剂相(D相)包围油滴组成的表面活性剂凝胶(O/D相)，在D相中界面膜张力趋近于0，当外界条件发生变化时很容易发生相态转变，并形成十分微小的O/W乳化体，几乎不需要过多能量输入，在低耗能条件下制备粒径小并且稳定的乳液。D相乳化技术制备的乳液拥有优异的亲肤渗透效果，不仅可以承载更多的活性成分，且活性成分的利用度更高，肤感更好。
现有技术中，对抗衰老的化妆品研究并没有系统从细胞的衰老相关分泌表型着手，而是倾向于从皮肤的衰老表观或者单方面衰老相关分泌表型进行抗衰研究。发明人经研究发现，市面上的抗衰老的化妆品存在肤感油腻、厚重，渗透性差，产品抗衰老效果不明显，价格昂贵等问题。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种抗衰修护D相乳液及其制备方法和应用。本发明以透明质酸锌，皱叶木兰提取物，黑桑叶根提取物为主要有效成分，采用D相乳化技术制备成抗衰修护D相乳液，制备的D相乳液渗透性好，易吸收，可促进活性物质的吸收，提高活性成分的利用度，达到更好的抗衰修护护肤功效，同时安全无毒副作用，因此在皮肤抗衰、修复中具有良好的应用前景。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种抗衰修护D相乳液，所述D相乳液包含如下质量分数(w/w)的组分：
透明质酸锌0.1-1.0％，皱叶木兰提取物1.0-8.0％，黑桑叶根提取物1.0-8.0％、D相乳化剂0.3～5.0％、油脂1.0～10.0％、多元醇2.0～8.0％、增稠剂0.1～1.0％、防腐剂0.3～1.0％，余量为水。
本发明的第二个方面，提供上述D相乳液的制备方法，所述制备方法包括：
S1、水相的制备：将水、增稠剂、透明质酸锌加热，保温搅拌至形成均匀溶液I；
S2、D相的制备：将D相乳化剂加入多元醇中，搅拌使其分散均匀，加热溶解形成均匀溶液II；
S3、将油脂加热形成均匀液体III，将液体III加入溶液II中搅拌均质，合相完成后均质，形成均一油凝胶；
S4、将油凝胶加入溶液I中，均质搅拌，均质完成后降温；
S5、温度降低后，加入皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物和防腐剂，搅拌均匀，即得抗衰修护D相乳液。
经试验证明，采用D相乳化技术，以透明质酸锌、皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物为主要有效成分，制备的D相乳液具有很好的抗衰修护效果，可以用于化妆品中改善肌肤松弛、失去弹性、屏障受损等问题。
本发明的第三个方面，提供上述D相乳液在制备抗衰修护的化妆品中的应用。本发明通过试验验证，上述乳液能够通过抑制炎症因子IL-6、IL-8的活性，抑制MMP-1、MMP-3的生成，抑制ROS的产生，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，促进透明质酸的合成，多维度作用于衰老细胞分泌的一系列细胞因子，减少衰老细胞的促衰老作用，从而达到抗衰的作用；同时，可以促进皮肤屏障重要蛋白FLG、LOR的生成，达到优异的修护作用；同时安全无毒副作用，因此可应用于抗衰修护护肤的化妆品之中。
因此，本发明的第四个方面，提供一种抗衰修护的化妆品，所述化妆品其包含上述D相乳液。
其中，以所述抗衰修护的化妆品的总质量计，所述抗衰修护D相乳液的加入量为0.1-100％，进一步为0.5-40％，更进一步优选为2-25％，如2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％。
本发明的第五个方面，提供上述抗衰修护的化妆品的制备方法，所述制备方法包括将包含上述第一方面所述的D相乳液以及其他各原料组分混合的步骤。
本发明的第六个方面，提供上述D相乳液和/或化妆品在抗衰修护护肤中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案所获得抗衰修护化妆品的皮肤抗衰及修护功效显著；通过抑制炎症因子IL-6、IL-8的活性，抑制MMP-1、MMP-3的生成，抑制ROS的产生，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，促进透明质酸的合成，多维度作用于衰老细胞分泌的一系列细胞因子，减少衰老细胞的促衰老作用，从而达到抗衰的作用；同时，可以促进皮肤屏障重要蛋白FLG、LOR的生成，达到优异的修护作用。进一步的，通过人体功效实验测试，证明上述化妆品具有很好的抗衰、修护功效，功效显著。
同时，上述技术方案所获得的抗衰修护化妆品的制备方法简单易行，且原料廉价且易于获取，非常适合工业化大批量生产，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1：皮肤抗衰度F4在使用测试样品前后的变化(**表示与阴样品使用前F4值相比，p<0.01；*表示与阴样品使用前F4值相比，0.01<p<0.05)。
图2：TEWL值在使用测试样品前后的变化(**表示与样品使用前TEWL值相比，p<0.01；*表示与样品使用前TEWL值相比，0.01<p<0.05)。
图3：红区分析a*值使用产品前后的变化(**表示与阴样品使用前a*值相比，p<0.01；*表示与阴样品使用前a*值相比，0.01<p<0.05)。
图4：产品使用前后面部红区变化图片示例。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，现有技术中，对抗衰老的化妆品研究并没有系统从细胞的衰老相关分泌表型着手，而是倾向于从皮肤的衰老表观或者单方面衰老相关分泌表型进行抗衰研究。发明人经研究发现，市面上的抗衰老的化妆品存在肤感油腻、厚重，渗透性差，产品抗衰老效果不明显，价格昂贵等问题。
有鉴于此，本发明以透明质酸锌，皱叶木兰提取物，黑桑叶根提取物为主要有效成分，采用D相乳化技术制备成抗衰修护D相乳液，制备的D相乳液渗透性好，易吸收，可促进活性物质的吸收，提高活性成分的利用度，达到更好的抗衰修护护肤功效。经实验证明，该乳液对皮肤具有较强的抗衰修护功效，能够抑制炎症因子IL-6、IL-8的活性，抑制MMP-1、MMP-3的生成，抑制ROS的产生，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，促进透明质酸的合成，多维度作用于衰老细胞分泌的一系列细胞因子，减少衰老细胞的促衰老作用，从而达到抗衰的作用；同时，可以促进皮肤屏障重要蛋白FLG、LOR的生成，达到优异的修护作用；且安全无毒副作用。
具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种抗衰修护D相乳液，所述D相乳液包含如下质量分数(w/w)的组分：
透明质酸锌0.1-1.0％，皱叶木兰提取物1.0-8.0％，黑桑叶根提取物1.0-8.0％、D相乳化剂0.3～5.0％、油脂1.0～10.0％、多元醇2.0～8.0％、增稠剂0.1～1.0％、防腐剂0.3～1.0％，余量为水。
其中，透明质酸锌分子量控制为40万-80万Da，优选的，透明质酸锌分子量为50万-70万Da。
所述皱叶木兰提取物和黑桑叶根提取物均可通过市售方式获得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述皱叶木兰提取物是以乙醇为溶剂采用超临界流体萃取法获得，更具体的，采用如下方法制备得到：
S1、将皱叶木兰粉碎过筛，粉碎后的皱叶木兰粉末投入二氧化碳超临界萃取器中进行萃取，乙醇作为夹带剂，萃取液过滤得皱叶木兰萃取液；
S2、将步骤S1得到的皱叶木兰萃取液进行蒸馏浓缩处理，挥发至无醇味，加入丁二醇，搅拌均匀，过滤，即得皱叶木兰提取物。
其中，
所述步骤S1中，过筛处理中选用100～150目筛，如100、120或150目；本发明的一个具体实施方式中，过筛处理选用120目筛；
萃取具体工艺条件包括：萃取温度为45～65℃、萃取压力为30MPa、二氧化碳流量为20～30L/h、萃取时长为3～4h，更具体的，以70％乙醇作为夹带剂，加入速度为6～10mL/min，过滤。
所述步骤S2中，蒸馏浓缩具体为在55-65℃条件下采用减压蒸馏处理，待滤液蒸发无醇味，加入剩余浓缩液2～3倍质量的丁二醇，搅拌均匀过滤后即得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述黑桑叶根提取物是以乙醇为溶剂采用加热回流法获得，更具体的，采用如下方法制备得到：
S1、将黑桑叶根粉碎过筛，粉碎后的黑桑叶根粉末置于加热回流罐中，加入乙醇加热回流提取，降温后过滤，收集滤液，滤渣置于加热回流罐中，重复提取1～2次，过滤，合并滤液得黑桑叶根提取液；
S2、将步骤S1得到的黑桑叶根提取液进行蒸馏浓缩处理，浓缩液加入甘油，搅拌均匀，过滤，即得黑桑叶根提取物。
其中，
所述步骤S1中，过筛处理中选用150～200目筛，如150、180或200目；本发明的一个具体实施方式中，过筛处理选用200目筛；
加热回流提取具体工艺条件包括：加入10～20质量倍数的55％～95％乙醇，70～90℃加热回流提取1～3h，降温至50℃～55℃后过滤，收集滤液，滤渣置于加热回流罐中，重复提取1次，提取2～3h，过滤，合并两次滤液。
所述步骤S2中，蒸馏浓缩具体为在65-75℃条件下采用减压蒸馏处理，待黑桑叶根提取液蒸发至剩余1/6-1/4时，加入剩余浓缩液相同质量的甘油，搅拌均匀过滤后即得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述D相乳化剂为辛基十二聚醇醚-20、蔗糖月桂醇酸酯、枯草菌酯肽钠、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或几种，优选为蔗糖月桂醇酸酯、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或几种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的油脂为氢化聚异丁烯、异壬酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯中的一种或几种，优选为氢化聚异丁烯、异壬酸乙基己酯、碳酸二辛酯中的一种或几种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的增稠剂为小核菌胶、黄蓍胶、角叉(菜)胶、明胶、海藻酸钠、阿拉伯胶、刺梧桐树胶中的一种或几种，优选为鞘氨醇菌胶、小核菌胶中的一种或几种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、双丙甘醇中的一种或多种，优选为丁二醇、双丙甘醇、甘油中的一种或几种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的防腐剂为PE 9010、辛酰羟肟酸、乙基己基甘油、对羟基苯乙酮中的一种，优选为PE 9010。
在本发明的一个具体实施方式中，所述D相乳液由如下质量分数(w/w)的组分组成：
透明质酸锌0.2-0.5％，皱叶木兰提取物4.0-6.0％，黑桑叶根提取物4.0-6.0％、D相乳化剂1.0～2.0％、油脂3.0～8.0％、多元醇3.0～5.0％、增稠剂0.1～0.5％、防腐剂0.4～0.8％，余量为水。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述D相乳液的制备方法，所述制备方法包括：
S1、水相的制备：将水、增稠剂、透明质酸锌加热，保温搅拌至形成均匀溶液I；
S2、D相的制备：将D相乳化剂加入多元醇中，搅拌使其分散均匀，加热溶解形成均匀溶液II；
S3、将油脂加热形成均匀液体III，将液体III加入溶液II中搅拌均质，合相完成后均质，形成均一油凝胶；
S4、将油凝胶加入溶液I中，均质搅拌，均质完成后降温；
S5、温度降低后，加入皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物和防腐剂，搅拌均匀，即得抗衰修护D相乳液。
经试验证明，采用D相乳化技术，以透明质酸锌、皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物为主要有效成分，制备的D相乳液具有很好的抗衰修护效果，可以用于化妆品中改善肌肤松弛、失去弹性、屏障受损等问题。
其中，所述步骤S1和S2没有先后顺序之分。
所述步骤S1、S2和S3中，加热温度均可以为70～75℃。
所述步骤S5中，温度降低至40℃(含40℃)以下。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述D相乳液在制备抗衰修护的化妆品中的应用。本发明通过试验验证，上述乳液能够通过抑制炎症因子IL-6、IL-8的活性，抑制MMP-1、MMP-3的生成，抑制ROS的产生，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，促进透明质酸的合成，多维度作用于衰老细胞分泌的一系列细胞因子，减少衰老细胞的促衰老作用，从而达到抗衰的作用；同时，可以促进皮肤屏障重要蛋白FLG、LOR的生成，达到优异的修护作用；同时安全无毒副作用，因此可应用于抗衰修护护肤的化妆品之中。
因此，在本发明的一个具体实施方式中，提供一种抗衰修护的化妆品，所述化妆品其包含上述D相乳液。
其中，以所述抗衰修护的化妆品的总质量计，所述抗衰修护D相乳液的加入量为0.1-100％，进一步为0.5-40％，更进一步优选为2-25％，如2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％。
显而易见的，所述抗衰修护的化妆品还可以包含任意化妆品领域允许添加的其他原料成分，如润肤剂、保湿剂、抗氧化剂等，在此不再赘述。
同时，本发明通过合理添加上述原料成分，也可以以此制备不同化妆品剂型，如精华水、精华乳、精华霜等，同时，基于上述化妆品品类，进一步衍生制备获得的其他化妆品品类，显然亦均属于本申请的保护范围之内。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述抗衰修护的化妆品的制备方法，所述制备方法包括将包含上述所述的D相乳液以及其他各原料组分混合的步骤。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述D相乳液和/或化妆品在抗衰修护护肤中的应用。
下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。同时，在本发明实施例中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明下述各实施例和对比例中，透明质酸锌分子量为60万Da。
使用的皱叶木兰提取物采用如下方法制得：将皱叶木兰粉碎过120目筛，粉碎后的皱叶木兰粉末投入二氧化碳超临界萃取器中，以萃取釜温度为60℃、萃取压力为30MPa、二氧化碳流量为25L/h、萃取时长为3h的工艺条件进行萃取，70％乙醇作为夹带剂，加入速度为8mL/min，过滤得萃取液；将皱叶木兰萃取液进行蒸馏浓缩处理(60℃)，挥发至无醇味，加入剩余浓缩液2倍质量的丁二醇，搅拌均匀，过滤，即得皱叶木兰提取物。
所述黑桑叶根提取物采用如下方法制备得到：将黑桑叶根粉碎过筛，粉碎后的黑桑叶根粉末置于加热回流罐中，加入10倍质量的95％乙醇加热回流提取2.5h，降温至55℃后过滤，收集滤液，滤渣置于加热回流罐中，重复提取1次，提取2h，过滤，合并两次滤液得黑桑叶根提取液；将黑桑叶根提取液进行减压蒸馏浓缩处理(70℃)，待提取液蒸发至剩下1/4时，浓缩液中加入同质量的甘油，搅拌均匀，过滤，即得黑桑叶根提取物。
实施例1
一种D相乳液，配比为：蔗糖月桂醇酸酯1.0份，丁二醇3.0份，双丙甘醇2.0份，小核菌胶0.15份，异壬酸乙基己酯3.0份，氢化聚异丁烯2.0份，透明质酸锌0.1份，皱叶木兰提取物1.0份，黑桑叶根提取物1.0份，防腐剂PE9010 0.4份，水余量。
制备方法为：
S1、水相的制备：将纯化水、小核菌胶、透明质酸锌加热至70～75℃，保温搅拌至形成均匀溶液一。
S2、D相的配制：将蔗糖月桂醇酸酯分批次加入多元醇(丁二醇、双丙甘醇)中，搅拌使其充分分散均匀，升温至70～75℃，加热溶解形成均匀溶液二。
S3、将异壬酸乙基己酯、氢化聚异丁烯加热至70～75℃形成均匀液体三，将液体三缓慢加入D相中搅拌均质，慢慢加快合相速度，合相完成后均质2min，形成均一油凝胶。
S4、将油凝胶加入溶液一中，均质搅拌10min，均质完成后降温。
S5、温度降至40℃以下时，加入皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物、PE9010，搅拌均匀，即得抗衰修护D相乳液。
对比例1
配比为：透明质酸锌0.3份，皱叶木兰提取物5.0份，黑桑叶根提取物5.0份，水余量。
制备方法为：将透明质酸锌、皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物混合到一起，溶于纯化水中。
实施例1-3及对比例2-4制备方法相同，区别仅在主要有效成分透明质酸锌、皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物的用量配比不同，具体方案如下表1所示，以质量比计算。
表1 具体实施例及对比例成分列表
实施例4精华乳
上述抗衰修护D相乳液的应用，制备含有该抗衰修护D相乳液的精华乳产品，配方如表2所示。
表2 精华乳产品配方
精华乳的制备方法：
S1：水相的制备：分别加入A相中原料，加热至80～85℃搅拌溶解；
S2：油相的制备：分别加入B相中原料，加热至75～80℃熔解；
S3：将A相与B相合相，开启均质(3000rpm)，均质12min；
S4：当温度降至65～70℃时加入C相，搅拌溶解，溶解完毕后继续降温；
S5：当温度降至45℃时，依次加入D相成分，搅拌溶解分散均匀，即得精华乳产品。
试验例1：安全性测试实验
参照SN/T 2329-2009《化妆品眼刺激性/鸡胚绒毛尿囊膜试验》，对产品进行眼刺激测试即安全性测试。
实验方法：采用7日龄以内的受精鸡胚，在37.6±0.5℃﹑50％～70％湿度的孵育箱中孵育9日。
CAM制备：进行照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置，用镊子剥去带标记的蛋壳部分，暴露白色蛋膜，应小心操作不破坏蛋膜完整性。滴加0.5mL 0.9％NaCl溶液使蛋膜充分湿润，用纸巾轻轻吸干表面液体，并用镊子小心去除内膜，保证血管膜不受损。
反应终点法：取透明受试物0.3mL均匀滴加或涂抹于CAM表面，作用3min后使用0.9％NaCl溶液洗去受试物，观察CAM每种毒性效应变化的程度。
终点评分法(end point score ES)：采用反应终点法进行的试验，应计算终点评分(ES)，结果保留小数点后两位。每只鸡胚记分＝每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和，ES＝6只鸡胚得分的数学总和。根据ES值按表3对受试物眼刺激性进行分类。
表3 反应终点法结果判定标准
| 刺激评分 | ES≤12 | 12<ES<16 | ES≥16 |
| 刺激性分类 | 无/轻刺激性 | 中度刺激性 | 强刺激性/腐蚀性 |
试验结果如表4所示，该抗衰修护护肤乳液无刺激性。
表4 刺激性实验结果统计表
试验例2：体外抑制炎症因子IL-6、IL-8的活性实验
采用LPS(细菌脂多糖)诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7，通过ELISA方法检测IL-6、IL-8表达量，来评价受试物抑制相关细胞通路因子表达的能力。见表5测试方案。
表5 测试方案
测试结果如表6-表7所示。
表6 IL-6含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表6中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3，4均能显著抑制IL-6的活性，实施例2的抑制效果最为显著，对比例2，3，4的抑制率较低。表明该抗衰修护护肤乳液能显著抑制IL-6的活性。
表7 IL-8含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表7中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，4均能显著抑制IL-8的活性，实施例2的抑制效果最为显著，对比例2，4的抑制率较低，表明该抗衰修护护肤乳液能显著抑制IL-8的活性。
试验例3：体外抑制MMP-1、MMP-3活性，促进Ⅰ型胶原蛋白、弹性蛋白、HA生成实验
本实验采用UVA辐照成纤维细胞，检测样品作用后MMP-1、MMP-3、I型胶原(Collagen I)、弹力蛋白(Elastin)和透明质酸(HA)含量的变化情况。
根据表8测试方案，待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
UVA辐照：根据试验分组，对需要UVA照射的组别进行30J/cm2的UVA辐照，置于培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养24h。
培养24h后，收集细胞培养上清液于EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。根据ELISA试剂盒的操作说明书进行检测。
表8 测试方案
测试结果如表9-表13所示。
表9 MMP-1含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表9中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3，4均能显著抑制MMP-1的活性，实施例2的抑制效果最为显著，对比例2，3，4的抑制率较低，表明该抗衰修护护肤乳液能显著抑制MMP-1的活性。
表10 MMP-3含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表10中可以看出，实施例1，2，3及对比例1均能显著抑制MMP-3的活性，实施例2的抑制效果最为显著，对比例2，3，4的无显著抑制作用，表明该抗衰修护护肤乳液能显著抑制MMP-3的活性。
表11 CollagenⅠ含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表11中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3，4均能显著促进Ⅰ型胶原蛋白的生成，实施例2的促进效果最为显著，对比例2，3，4的抑制作用较低，表明该抗衰修护护肤乳液能显著促进Ⅰ型胶原蛋白的生成。
表12 弹性蛋白含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表12中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3，4均能显著促进弹性蛋白的生成，实施例2的促进效果最为显著，对比例2，3，4的促进效果较差，表明该抗衰修护护肤乳液能显著促进弹性蛋白的生成。
表13 HA含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表13中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3均能显著促进HA的生成，实施例2的促进效果最为显著，对比例2，3的促进效果较差，对比例4无显著促进作用，表明该抗衰修护护肤乳液能显著促进HA的生成。
试验例4：基于角质形成细胞的体外抗ROS实验
采用UVB辐照角质形成细胞，检测样品作用后活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化情况。
根据表14测试方案，待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
UVB辐照：根据试验分组，对有UVB照射的组别进行300mJ/cm2的UVB辐照。
ROS含量测试：辐照结束后，直接用PBS清洗每孔细胞3次，每孔加入1mL浓度为10μMDCFH-DA探针，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育30min；弃掉含DCFH-DA的培养液，用PBS清洗3次，胰酶(0.25％)消化细胞后，PBS清洗细胞1次，加入一定量新鲜PBS，流式检测。
表14 测试方案
测试结果如表15所示。
表15 ROS含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表15中可以看出，实施例1，2，3及对比例1，2，3，4均能显著抑制ROS的产生，实施例2的抑制效果最为显著，对比例2，3，4的抑制作用较低，表明该抗衰修护护肤乳液能显著抑制ROS的产生。
试验例5：体外促进屏障相关蛋白FLG&LOR实验
采用UVB辐照3D表皮皮肤模型通过检测样品作用后皮肤模型的屏障相关蛋白(FLG&LOR)含量的变化评价修护功效。
根据表16测试方案，将模型转移到6孔板中(提前添加0.9mL相应分组的培养液)，在6孔板上标注测试组编号。向BC组和NC组每孔添加0.9mL无菌PBS，PC组加0.9mL含有50μM WY14643的PBS溶液，向样品组加入0.9mL含有相应浓度样品的PBS。
将6孔板按照测试分组置于UVB辐照仪下辐照。辐照结束后，吸弃孔板中的培养基，向BC组和NC组每孔添加0.9mL的培养液，PC组加入0.9mL含有50μM WY14643的培养液，样品组加入0.9mL含有相应浓度样品工作液的培养液，之后，将模型置于培养箱(5％CO2，37℃)，孵育24h±2h。孵育结束后，用无菌PBS清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。
取用于屏障相关蛋白检测的模型，将模型环切取下，用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，进行屏障相关蛋白(FLG&LOR)的免疫荧光检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。
表16 测试方案
测试结果如表17-18所示。
表17 FLG含量结果汇总表
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表17中可以看出，实施例1，2，3及对比例1均能显著促进FLG蛋白的含量，实施例2的促进效果最为显著，对比例2，3，4的无显著促进效果，表明该抗衰修护护肤乳液能显著促进FLG蛋白的含量。
表18 LOR含量结果汇总表
| 样品名称 | 相对IOD平均值 | SD | P-value | 提升率 |
| BC | 1.00 | 0.04 | / | / |
| NC | 0.31 | 0.04 | 0.0000## | / |
| PC | 0.71 | 0.07 | 0.0010** | 129.03 |
| 实施例1 | 0.59 | 0.08 | 0.0056** | 90.32 |
| 实施例2 | 0.67 | 0.05 | 0.0006** | 116.13 |
| 实施例3 | 0.63 | 0.06 | 0.0015** | 103.23 |
| 对比例1 | 0.60 | 0.03 | 0.0006** | 93.55 |
| 对比例2 | 0.40 | 0.05 | 0.0716 | / |
| 对比例3 | 0.42 | 0.07 | 0.0774 | / |
| 对比例4 | 0.33 | 0.06 | 0.6560 | / |
(注：##表示与空白对照相比，p<0.01；**表示与阴性对照相比，p<0.01；*表示与阴性对照相比，0.01<p<0.05。)
从表18中可以看出，实施例1，2，3及对比例1均能显著促进LOR蛋白的含量，实施例2的促进效果最为显著，对比例2，3，4的无显著促进效果，表明该抗衰修护护肤乳液能显著促进LOR蛋白的含量。
试验例6：实施例4的人体抗衰、修护功效实验
制备的实施例4精华乳产品进行人体皮肤功效测试，选择年龄范围在30～50周岁的中国健康女性受试者。在受试者使用受试产品前(D0)及连续使用产品14天(D14)、28天后(D28)，测量皮肤弹性度F4、经皮水分流失速率(TEWL)参数、面部红区a*值。通过对产品使用前后的结果比较，判断是否有统计学差异。
产品使用方法：
1)使用28天，每天使用2次。
2)早晚洁面后，取1管精华液(≈0.52g)均匀涂于面部肌肤，轻轻按摩拍打至肌肤完全吸收。
3)整个测试期间，除了提供的测试样品外，在测试区域(面部)不能使用其他同功效护肤品。
表19 测试项目
样品使用期间如志愿者皮肤出现不良反应，应立即终止测试，并对志愿者进行适当医治，对不良反应予以记录。
使用产品后的变化率＝(使用后数值-使用前数值)/使用前数值×100％
测试结果：
(1)与使用产品前比较，受试者使用产品第14天后的皮肤弹性度F4显著降低了8.60％；受试者使用产品28天后与使用前比较，皮肤弹性度F4显著降低了21.15％，说明使用该产品14天、28天后均具有显著的抗衰肌肤功效。具体见图1。
(2)与使用产品前比较，受试者使用产品第14天后的皮肤TEWL值显著降低了10.66％；受试者使用产品28天后与使用前比较，皮肤TEWL值显著降低了19.13％，说明使用该产品14天、28天后均具有显著的修护皮肤屏障功效。具体见图2。
(3)使用产品2周后，红区分析a*值相对于初始值均值变化率降低8.8％；使用产品4周后，红区分析a*值相对于初始值均值变化率降低12.5％；根据VISIA-CR采集导出的红区图片显示，受试者面部发红情况在第2周、第4周都有不同程度的减少，说明使用该产品14天、28天后均具有显著的修红作用。具体见图3～4。
通过以上结果表明：含有抗衰修护护肤乳液的产品能够达到抗衰修护皮肤的功效，用于护肤品中具有显著的效果。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.一种抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述D相乳液包含如下质量分数的组分：
透明质酸锌0.1-1.0％，皱叶木兰提取物1.0-8.0％，黑桑叶根提取物1.0-8.0％、D相乳化剂0.3～5.0％、油脂1.0～10.0％、多元醇2.0～8.0％、增稠剂0.1～1.0％、防腐剂0.3～1.0％，余量为水；
所述透明质酸锌分子量为50万-70万Da；
所述皱叶木兰提取物是以乙醇为溶剂采用超临界流体萃取法获得；
所述黑桑叶根提取物是以乙醇为溶剂采用加热回流法获得；
所述皱叶木兰提取物是采用如下方法制备得到：
S1、将皱叶木兰粉碎过筛，粉碎后的皱叶木兰粉末投入二氧化碳超临界萃取器中进行萃取，乙醇作为夹带剂，萃取液过滤得皱叶木兰萃取液；
S2、将步骤S1得到的皱叶木兰萃取液进行蒸馏浓缩处理，挥发至无醇味，加入丁二醇，搅拌均匀，过滤，即得皱叶木兰提取物；
所述黑桑叶根提取物是采用如下方法制备得到：
S1、将黑桑叶根粉碎过筛，粉碎后的黑桑叶根粉末置于加热回流罐中，加入乙醇加热回流提取，降温后过滤，收集滤液，滤渣置于加热回流罐中，重复提取1～2次，过滤，合并滤液得黑桑叶根提取液；
S2、将步骤S1得到的黑桑叶根提取液进行蒸馏浓缩处理，浓缩液加入甘油，搅拌均匀，过滤，即得黑桑叶根提取物；
所述D相乳化剂为辛基十二聚醇醚-20、蔗糖月桂醇酸酯、枯草菌酯肽钠、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或几种；
所述的油脂为氢化聚异丁烯、异壬酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯中的一种或几种；
所述的增稠剂为小核菌胶、黄蓍胶、角叉(菜)胶、明胶、海藻酸钠、阿拉伯胶、刺梧桐树胶中的一种或几种；
所述的多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、双丙甘醇中的一种或多种；
所述的防腐剂为PE 9010、辛酰羟肟酸、乙基己基甘油、对羟基苯乙酮中的一种。
2.如权利要求1所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述皱叶木兰提取物制备步骤S1中，过筛处理中选用100～150目筛。
3.如权利要求2所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述皱叶木兰提取物制备步骤S1中，过筛处理中选用120目筛。
4.如权利要求1所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述黑桑叶根提取物制备步骤S1中，过筛处理中选用150～200目筛。
5.如权利要求4所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述黑桑叶根提取物制备步骤S1中，过筛处理中选用200目筛。
6.如权利要求1所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述D相乳化剂为蔗糖月桂醇酸酯、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或几种；
所述的油脂为氢化聚异丁烯、异壬酸乙基己酯、碳酸二辛酯中的一种或几种；
所述的增稠剂为鞘氨醇菌胶、小核菌胶中的一种或几种；
所述的多元醇为丁二醇、双丙甘醇、甘油中的一种或几种；
所述的防腐剂为PE 9010。
7.如权利要求1所述的抗衰修护D相乳液，其特征在于，所述D相乳液由如下质量分数的组分组成：
透明质酸锌0.2-0.5％，皱叶木兰提取物4.0-6.0％，黑桑叶根提取物4.0-6.0％、D相乳化剂1.0～2.0％、油脂3.0～8.0％、多元醇3.0～5.0％、增稠剂0.1～0.5％、防腐剂0.4～0.8％，余量为水。
8.权利要求1-7任一项所述D相乳液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、水相的制备：将水、增稠剂、透明质酸锌加热，保温搅拌至形成均匀溶液I；
S2、D相的制备：将D相乳化剂加入多元醇中，搅拌使其分散均匀，加热溶解形成均匀溶液II；
S3、将油脂加热形成均匀液体III，将液体III加入溶液II中搅拌均质，合相完成后均质，形成均一油凝胶；
S4、将油凝胶加入溶液I中，均质搅拌，均质完成后降温；
S5、温度降低后，加入皱叶木兰提取物、黑桑叶根提取物和防腐剂，搅拌均匀，即得抗衰修护D相乳液。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1和S2没有先后顺序之分；
所述步骤S1、S2和S3中，加热温度均为70～75℃；
所述步骤S5中，温度降低至40℃以下。
10.权利要求1-7任一项所述D相乳液在制备抗衰修护的化妆品中的应用。
11.一种抗衰修护的化妆品，其特征在于，所述化妆品其包含权利要求1-7所述D相乳液。
12.权利要求1-7任一项所述D相乳液和/或化妆品在抗衰修护护肤中的应用。
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