CN115461374A - 长效gm-csf和使用方法 - Google Patents

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CN115461374A CN202180028093.7A CN202180028093A CN115461374A CN 115461374 A CN115461374 A CN 115461374A CN 202180028093 A CN202180028093 A CN 202180028093A CN 115461374 A CN115461374 A CN 115461374A
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雷磊
沈卫军
王峰
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Abstract

本文公开了粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)肽和包含GM‑CSF肽的组合物。这些分子可用于治疗神经系统疾病或病症。

Description

长效GM-CSF和使用方法
技术领域
本申请要求于2020年2月12日提交的国际申请号PCT/CN2020/074834的权益，所述申请通过引用以其全文并入本文。
背景技术
帕金森氏病(Parkinson’s disease)(PD)是一种与大量发病率、增加的死亡率以及特别高的经济负担相关联的进行性神经退行性疾病。
发明内容
帕金森氏病(PD)和其他神经退行性病症的进展与炎症有联系。临床前地，GM-CSF治疗调节先天小胶质细胞免疫并增加从外周迁移至脑中的调节性T细胞(Treg)，从而产生抗炎应答和神经保护应答。在一个方面，本文提供了用于治疗神经退行性病症和/或炎症相关病症的GM-CSF分子。在一些实施方案中，在此提供的GM-CSF分子用于治疗帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)(AD)、急性辐射综合征、创伤性脑损伤、癌症和克罗恩氏病(Crohn’s disease)(CD)中的一种或多种。
GM-CSF显示出有限的生物利用度和短的半衰期，使得GM-CSF肽治疗剂需要高剂量给药和每日施用。每日GM-CSF治疗已经出现了轻度至中度不良事件，包括注射部位反应、WBC计数升高和骨痛。在一个方面，本文提供了长效GM-CSF分子，其包含连接至支架以增加GM-CSF的半衰期的GM-CSF。示例性支架包括抗体可变结构域。此外，本文提供的各种长效GM-CSF分子相比于单独GM-CSF肽具有增加的GM-CSF生物利用度。本文提供的各种长效GM-CSF分子可以以在约每7天一次至约每月一次之间的频率，例如以约每两周一次的频率施用。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的第一多肽和含有与SEQ ID NO:2至少98％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，第一多肽包含抗体可变区的经修饰的轻链。在一些实施方案中，抗体可变结构域的经修饰的轻链包含位于抗体可变区的第一氨基酸序列与抗体可变区的第二氨基酸序列之间的GM-CSF。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO:14至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含与SEQ IDNO:15至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，GM-CSF位于经修饰的轻链的互补决定区(CDR)内。在一些实施方案中，GM-CSF位于轻链CDR1、CDR2或CDR3内。在一些实施方案中，GM-CSF位于轻链CDR3内。在一些实施方案中，经修饰的轻链是由包含SEQID NO:17的可变轻链修饰而成的。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含第一接头肽。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQID NO:8。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，第一接头肽包含与SEQ ID NO:12至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含第二接头肽。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，第二接头肽包含与SEQID NO:13至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含抗体可变区的重链。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽经由一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽形成抗体可变结构域。在一些实施方案中，抗体可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的平衡解离常数(KD)与抗原结合。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含经修饰的帕利珠单抗(palivizumab)可变结构域。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:19的重链CDR1。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:20的重链CDR2。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:21的重链CDR3。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:22的轻链CDR1。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:23的轻链CDR2。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:77或SEQ ID NO:16的轻链CDR3。在一些实施方案中，经修饰的帕利珠单抗可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的KD与呼吸道合胞病毒(RSV)结合。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或第一多肽包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，轻链序列包含含有与SEQ ID NO:6至少约90％相同的序列的第一多肽，重链序列包含含有与SEQ ID NO:2至少约90％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物包含GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或重链包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含与SEQ ID NO:26(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGS[X1]PFTFGGGTKLEIKR)至少约90％相同的序列，其中轻链序列包含X1并且X1包含GM-CSF；所述重链序列包含与SEQID NO:2至少约90％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:26至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:27(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[X2]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGPFTFGGGTKLEIKR)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中轻链序列包含X2并且X2包含GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或重链包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含与SEQ ID NO:18至少约90％相同的序列。在一些实施方案中，所述序列与SEQ ID NO:18至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，所述序列连接至抗体结构域。在一些实施方案中，抗体结构域是抗体可变结构域。在一些实施方案中，所述序列位于抗体结构域内。在一些实施方案中，所述序列位于抗体可变结构域的CDR内。在一些实施方案中，所述序列位于经修饰的曲妥珠单抗(trastuzumab)抗体可变结构域的CDR内。在一些实施方案中，所述序列位于经修饰的帕利珠单抗抗体可变结构域的CDR内。在一些实施方案中，组合物包含与SEQ ID NO:42至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X5，并且X5包含所述序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。在一些实施方案中，组合物包含与SEQ ID NO:43至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X6，并且X6包含所述序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，Fc区包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:16的第一多肽和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的第二多肽。在一个方面，本文提供了组合物，其包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:77的第一多肽和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽是抗体可变结构域的轻链。在一些实施方案中，第二多肽是抗体可变结构域的重链。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或第二多肽包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39的第一多肽和含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:16的第二多肽。在一个方面，本文提供了组合物，其包含含有SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39的第一多肽和含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:77的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽是抗体可变结构域的轻链。在一些实施方案中，第二多肽是抗体可变结构域的重链。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或第二多肽包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有SEQ ID NO:31的第一多肽和含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的第二多肽。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，第二多肽包含抗体可变区的经修饰的重链。在一些实施方案中，抗体可变结构域的经修饰的重链包含位于抗体可变区的第一氨基酸序列与抗体可变区的第二氨基酸序列之间的GM-CSF。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO:32至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含与SEQ ID NO:33至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，GM-CSF位于经修饰的重链的互补决定区(CDR)内。在一些实施方案中，GM-CSF位于重链CDR1、CDR2或CDR3内。在一些实施方案中，GM-CSF位于重链CDR3内。在一些实施方案中，经修饰的重链是由包含SEQ ID NO:44的可变重链修饰而成的。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含第一接头肽。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，第一接头肽包含与SEQID NO:12至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含第二接头肽。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，第二接头肽包含与SEQ ID NO:13至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含抗体可变区的轻链。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽经由一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽形成抗体可变结构域。在一些实施方案中，抗体可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的平衡解离常数(KD)与抗原结合。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含经修饰的曲妥珠单抗可变结构域。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:34的重链CDR1。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:35的重链CDR2。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:16的重链CDR3。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:37的轻链CDR1。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:38的轻链CDR2。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:39的轻链CDR3。在一些实施方案中，经修饰的曲妥珠单抗可变结构域不以低于约10-2M、10- 3M或10-4M的KD与人表皮生长因子受体2(Her2)结合。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ IDNO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或第二多肽包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在另一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，轻链序列包含含有与SEQ ID NO:31至少约90％相同的序列的第一多肽，重链序列包含含有与SEQ ID NO:29至少约90％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:31至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:29至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物包含GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或重链包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含含有重链序列和轻链序列的抗体可变结构域，重链序列包含与SEQ ID NO:42(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR[[X5]]WGQGTLVTVSS)至少约90％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包含GM-CSF；所述轻链序列包含与SEQID NO:31至少约90％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:42至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[[X6]]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGDYWGQGTLVTVSS)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包含GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ IDNO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，组合物进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或重链包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了用途方法，其中本文的任一种组合物用于治疗神经系统疾病或病症。本文还提供了治疗神经系统疾病或病症的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。本文还提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。本文还提供了治疗创伤性脑损伤的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。本文还提供了治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。本文还提供了治疗急性辐射综合征的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。本文还提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的对象施用本文所述的任一种组合物。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间每约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天施用一次。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间每约14天施用一次。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间每约2周施用一次。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间每约3周施用一次。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间每约4周施用一次。在一些实施方案中，组合物在治疗期期间约每月施用一次。在一些实施方案中，治疗期包括约8周至约2年。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本公开内容的前述概述以及以下详述。然而，本公开内容不限于所示的精确示例，并且根据通常实践，附图的各种特征未按比例。在一些情况下，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下各图。
图1A-图1L：Her-mGMCSF CDR治疗影响外周血和脾脏中的T细胞群体。用递增剂量的Her-mGMCSF CDR治疗的小鼠的外周血中CD8+水平(图1A)、CD4+水平(图1B)和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)水平(图1C)的定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与(a)0mg/kg、(b)0.3mg/kg、(c)1.0mg/kg、(d)3.0mg/kg或(e)10.0mg/kg治疗相比。用递增剂量的rGM-CSF治疗的小鼠的外周血中CD8+水平(图1D)、CD4+水平(图1E)和CD4+CD25+FoxP3+Treg水平(图1F)的定量。从用递增剂量的Her-mGMCSF CDR治疗的小鼠分离的脾脏中CD8+水平(图1G)、CD4+水平(图1H)和CD4+CD25+FoxP3+Treg水平(图1I)的定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与(a)0mg/kg治疗、(b)0.3mg/kg治疗、(c)1.0mg/kg治疗和(d)3.0mg/kg治疗相比。从用递增剂量的rGM-CSF治疗的小鼠分离的脾脏中CD8+水平(图1J)、CD4+水平(图1K)和CD4+CD25+FoxP3+Treg水平(图1L)的定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与(a)0mg/kg、(b)0.01mg/kg、(c)0.03mg/kg或(d)0.10mg/kg rGM-CSF治疗相比。用Her-mGMCSF CDR和rGM-CSF两者治疗导致脾脏内Treg水平的显著剂量依赖性增加。线性回归分析结果提供于图表(图1I)和(图1L)上。
图2：Her-mGMCSF CDR治疗降低在MPTP中毒后观察到的神经炎性应答。在MPTP中毒后两天黑质内的反应性小胶质细胞的定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与(a)PBS或(b)MPTP治疗相比。
图3：Her-mGMCSF CDR治疗在MPTP中毒后保留多巴胺能神经元。在MPTP中毒后黑质内存活的多巴胺能(TH+/Nissl+)和非多巴胺能(TH-/Nissl+)神经元的总数量的体视学定量。确定了以平均值(±SEM，n＝7)计的差异，其中p<0.05，与用(a)PBS或(b)MPTP治疗的组相比。剩余的总神经元数量平均百分比指示在每个治疗条上。
图4：Her-mGMCSF CDR治疗减低纹状体末梢损失。在MPTP中毒后纹状体内TH+末梢的密度计量学分析。将治疗组针对PBS对照密度归一化。确定了以平均值(±SEM，n＝7)计的差异，其中p<0.05，与用(a)PBS或(b)MPTP治疗的组相比。
图5A-图5B：Her-mGMCSF CDR治疗表现出长效抗炎和免疫调节特性。图5A：在MPTP中毒后两天黑质内的反应性小胶质细胞(mac-1+)的定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与(a)PBS或(b)MPTP治疗相比。图5B：在MPTP中毒后七天黑质内存活的多巴胺能(TH+/Nissl+)和非多巴胺能(TH-/Nissl+)神经元的总数量的体视学定量。确定了以平均值(±SEM，n＝5)计的差异，其中p<0.05，与用(a)PBS、(b)MPTP、(c)第15天Her-mGMCSF CDR+MPTP和(d)第10天Her-mGMCSF CDR+MPTP治疗的组相比。
图6A-图6B：在TF-1增殖测定中，长效GM-CSF分子Syn hGMCSF CDRL3、NhGM Syn HC和NhGM Syn LC(图6A)以及Her hGMCSF CDR(图6B)的效力。
图7：各种长效GM-CSF分子的Fab结构域的示意图，其中GM-CSF位于IgG支架的氨基末端或CDR处。
图8A-图8B：在大鼠和小鼠血浆中，GM-CSF分子Syn-hGMCSF CDR、Her-hGMCSF CDR、Syn-mGMCSF CDR和Syn-mGMCSF NT(HC融合体)相比于重组GM-CSF分别表现出增加的半衰期。图8A示出了大鼠血浆中Syn-hGMCSF CDR和Her-hGMCSF CDR随时间的浓度。图8B示出了小鼠血浆中Syn-mGMCSF CDR和Syn-mGMCSF NT(N末端HC融合体)随时间的浓度。
图9：用Syn mGMCSF CDR亚治疗显著增加小鼠中的Treg扩增。
图10：长效GM-CSF，Her-hGMCSF CDR，增加Treg扩增长达14天。
图11：食蟹猴中的药代动力学和药效动力学研究。Her-hGMCSF CDR剂量依赖性地增加循环Treg。
图12：长效GM-CSF主动转运至小鼠的脑中。
具体实施方式
本文描述了GM-CSF分子和包含GM-CSF分子的组合物。示例性分子包含GM-CSF肽，所述GM-CSF肽连接至支架，所述支架使GM-CSF肽的半衰期增加至大于单独GM-CSF的半衰期。此类分子可以称为长效GM-CSF分子。用于增加GM-CSF半衰期的示例性支架包括抗体可变结构域，其中GM-CSF任选地经由一个或多个接头连接至抗体可变结构域。在一些情况下，抗体可变结构域具有降低的或不具有抗原结合。抗原结合的降低可以通过修饰抗体可变结构域的互补决定区(CDR)来产生。修饰可以包括GMCSF肽的插入和/或一个或多个CDR氨基酸的突变、添加或缺失。抗体支架也可以包含可结晶片段(Fc)区，所述可结晶片段区相比于包含野生型IgG1 Fc区的抗体支架表现出降低的效应子功能，诸如降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本文所述的各种GM-CSF分子增加Treg数量和/或功能，这可以有益于帕金森氏病(PD)和/或其他神经退行性和神经炎性疾病。例如，如本文的实施例中所示，用长效GM-CSF治疗导致在单次注射之后Treg数量的剂量依赖性增加，导致外周血和脾脏内的细胞功能增加至高于单独用重组GM-CSF(rGM-CSF)观察到的那些。此外，从用长效GM-CSF治疗的小鼠分离的Treg显示出增加的抗增殖作用并且与从用rGM-CSF治疗的小鼠分离的Treg相比能够在更大程度上抑制应答T细胞(Tresp)增殖。临床上，已经在ALS和PD两者中测试了修饰患病Treg群体。ALS患者显示出与疾病严重程度和存活相关的功能障碍Treg。然而，如果分离患病Treg并且离体刺激，则恢复抑制功能，这表明了潜在治疗靶标。本文所述的各种GM-CSF分子也表现出神经保护特性。如实施例中所示，单剂量的长效GM-CSF在MPTP小鼠模型中是神经保护性的。
在描述本发明方法和组合物之前，应理解本公开内容不限于所述的特定方法或组合物。所使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而并不旨在是限制性的，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求限制。提出实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明组合物和方法的公开内容和描述，并且不旨在限制本发明人视为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力等于或接近大气压。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另外明确规定)也被具体公开。在所陈述范围中的任何所陈述值或中间值与在该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值之间的每个更小范围都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且在任一个、没有一个或两个限值包括在较小范围内时的每个范围也被涵盖在本发明内，但依据所陈述范围内的任何具体排除的限值而定。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明内。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“所述肽”包括提及一种或多种肽及其本领域技术人员已知的等同物(例如多肽)，等等。
术语“互补决定区”和“CDR”(其与“高变区”或“HVR”同义)在本领域中已知是指抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3)。在一些实施方案中，本文提供的GM-CSF分子中的抗体支架包含对一个或多个CDR的一个或多个氨基酸突变、添加和/或缺失，使得CDR具有降低的或不具有抗原结合。此类经修饰的抗体支架仍可以被认为包含六个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3)而不需要抗原结合，其中CDR位于抗体的骨架区之间(例如，重链包含FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4并且轻链包含FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4)。在一些实施方案中，CDR包含GM-CSF，其中GM-CSF置换了CDR的一个或多个氨基酸。“骨架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知方案中的任一种容易地确定，所述方案包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences ofProteins of Immunological Interest,”第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Whitelegg NR和Rees AR,“WAM:an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB,”ProteinEng.2000年12月；13(12):819-24(“AbM”编号方案。在某些实施方案中，本文所述的抗体的CDR可以通过选自Kabat、Chothia、IMGT、Aho、AbM或其组合的方法定义。
关于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在用以实现最大序列同一性百分比而比对序列和引入缺口(如果需要)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以各种已知方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，使用NCBI的序列比较计算机程序BLAST产生氨基酸序列同一性％值。
GM-CSF肽
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含GM-CSF肽，诸如人、牛、大鼠和/或小鼠GM-CSF。在一些实施方案中，GM-CSF肽包含与SEQ ID NO:16相同或者至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文提供的长效GM-CSF分子可以包含GM-CSF肽，所述GM-CSF肽包含与SEQ ID NO:16相同或者至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文提供的长效GM-CSF分子可以包含GM-CSF肽变体，所述GM-CSF肽变体包含相比于包含SEQ ID NO:16的GM-CSF具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，GM-CSF肽包含与SEQ ID NO:77相同或者至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文提供的长效GM-CSF分子可以包含GM-CSF肽，所述GM-CSF肽包含与SEQ ID NO:77相同或者至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文提供的长效GM-CSF分子可以包含GM-CSF肽变体，所述GM-CSF肽变体包含相比于包含SEQ ID NO:77的GM-CSF具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列。此类GM-CSF肽变体包括具有一个或多个保守氨基酸取代的那些。保守取代可以涉及以下保守取代组之一中存在的取代：组1：丙氨酸(Ala；A)、甘氨酸(Gly；G)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)；组2：天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)；组3：天冬酰胺(Asn；N)、谷氨酰胺(Gln；Q)；组4：精氨酸(Arg；R)、赖氨酸(Lys；K)、组氨酸(His；H)；组5：异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、甲硫氨酸(Met；M)、缬氨酸(Val；V)；以及组6：苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、色氨酸(Trp；W)。另外，氨基酸可以按相似功能、化学结构或组成分组为保守取代组。例如，出于取代的目的，脂族分组可以包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。包括被认为彼此保守取代的氨基酸的其他组可以包括：含硫的：Met和Cys；酸性的：Asp、Glu和Asn；小的脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn和Glu；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
长效GM-CSF分子
在一个方面，本文提供了连接至支架以增加GM-CSF肽的半衰期的GM-CSF分子，有时称为长效GM-CSF分子。支架的非限制性示例包括抗体可变结构域。支架可以包含全长抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)和/或一个或多个恒定区。因此，如本文所用，具有抗体可变结构域的支架包括Fab、全长抗体和包含抗体可变结构域的任何其他抗体。GM-CSF肽不需要直接连接至抗体，并且可以经由一个或多个接头分子连接。在一些情况下，GM-CSF位于抗体重链或轻链的末端处。在一些情况下，GM-CSF位于抗体可变结构域的CDR内且/或置换所述CDR的一个或多个氨基酸。在一些情况下，GM-CSF位于CDR的两个氨基酸之间，GM-CSF位于抗体与CDR的第一氨基酸之间，GM-CSF位于抗体与CDR的最后一个氨基酸之间，且/或GM-CSF置换CDR的一部分或全部并且因此位于CDR先前存在的地方。在一些情况下，GM-CSF分子包含第一抗体部分、GM-CSF肽和第二抗体部分。例如，第一抗体部分包含一个或多个骨架区以及(如果适用)在GM-CSF所位于的CDR的N末端的任何其他CDR，并且第二抗体部分包含一个或多个骨架区和/或Fc区以及(如果适用)在GM-CSF肽所位于的CDR的C末端的任何其他CDR。第一抗体部分和第二抗体部分各自可以独立地具有选自以下的长度：至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个或至少约50个氨基酸。对于帕利珠单抗支架，第一抗体部分可以包含与SEQ ID NO:14至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。对于帕利珠单抗支架，第二抗体部分可以包含与SEQ ID NO:15至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。对于曲妥珠单抗支架，第一抗体部分可以包含与SEQ ID NO:32至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。对于曲妥珠单抗支架，第二抗体部分可以包含与SEQ ID NO:33至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，位于CDR内指示没有缺失CDR的氨基酸。在一些情况下，位于CDR内指示至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或全部CDR被GM-CSF肽置换。在一些情况下，抗体CDR包含GM-CSF肽序列。例如，重链或轻链CDR3包含GM-CSF肽序列。
在各种GM-CSF分子中，GM-CSF肽通过一个或多个接头连接至支架。在一些实施方案中，接头包含被配置为形成α螺旋的序列。在一些实施方案中，接头包含被配置为不具有规则二级结构(例如，无α螺旋、3-10螺旋、β链、β转角)的序列。非限制性示例性接头可以包含SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:13中的一个或多个。
本文讨论的连接可以包括肽键，并且因此，GM-CSF分子可以由包含编码GM-CSF融合体分子的DNA的基因构建体产生。如本文所用，“位于……内”和“插入”可以指示GM-CSF肽在包含GM-CSF肽和支架两者的多肽内的位置，并且因此，可以不指示产生GM-CSF分子的方法。例如，“插入”不一定将分子限于由通过插入编码GM-CSF肽的DNA而修饰编码支架的DNA所产生的那些，而是还可以或可替代地指示从头合成编码支架和GM-CSF肽的DNA。
在各种GM-CSF分子中，GM-CSF肽连接至包含抗体可变结构域的支架。抗体可变结构域可以包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含GM-CSF或以其他方式连接至GM-CSF。在一些情况下，第一多肽包含抗体可变结构域的轻链并且第二多肽包含重链可变结构域。在一些情况下，第一多肽包含抗体可变结构域的重链并且第二多肽包含轻链可变结构域。非限制性示例性抗体可变结构域包括曲妥珠单抗或帕利珠单抗可变结构域，其可以通过连接至GM-CSF肽进行修饰。曲妥珠单抗或帕利珠单抗可变结构域可以包含这样的修饰，所述修饰相比于未经修饰的曲妥珠单抗或帕利珠单抗(例如，分别为未经修饰的抗体赫赛汀、Synagis)降低抗原结合。在一些情况下，GM-CSF肽连接至轻链或重链的氨基末端。在一些情况下，GM-CSF肽位于轻链或重链内。例如，GM-CSF肽位于轻链或重链CDR内。作为另外的非限制性示例，GM-CSF肽位于轻链或重链CDR3内。
在一些实施方案中，支架包含抗体Fc区，抗体Fc区包含相比于人IgG1(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和/或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些情况下，支架包含含有与SEQ IDNO:3的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc序列。在一些情况下，支架包含Fc区，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，提供了GM-CSF分子，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含含有与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第一多肽，并且所述重链序列包含含有与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。
在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ IDNO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，提供了GM-CSF分子，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含含有与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第一多肽，并且所述重链序列包含含有与SEQID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。
在各种GM-CSF分子中，GM-CSF肽连接至支架，所述支架包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含与SEQ ID NO:26(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGS[X1]PFTFGGGTKLEIKR)至少约90％相同的序列，其中轻链序列包含X1并且X1包含GM-CSF；所述重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以是人、牛或鼠GM-CSF。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包括GM-CSF的变体或同源物。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:26至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:27(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[X2]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGPFTFGGGTKLEIKR)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中轻链序列包含X2并且X2包含GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc区可以包含与SEQID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在各种GM-CSF分子中，GM-CSF肽连接至支架，所述支架包含含有重链序列和轻链序列的抗体可变结构域，所述重链序列包含与SEQ ID NO:42(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR[[X5]]WGQGTLVTVSS)至少约90％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包含GM-CSF肽；所述轻链序列包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以是人、牛或鼠GM-CSF。GM-CSF可以包含与SEQ IDNO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包括GM-CSF的变体或同源物。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:42至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[[X6]]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGDYWGQGTLVTVSS)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包含GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ IDNO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc区可以包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一接头、GM-CSF肽和第二接头。在非限制性示例中，GM-CSF肽可以是人、牛、大鼠或小鼠的。例如，GM-CSF可以包含与SEQ IDNO:16至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:77至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，GM-CSF肽包括GM-CSF的同源物或变体。在一些实施方案中，第一接头包含被配置为形成α螺旋的第一肽。可以基于使用本领域容易获得的可用生物信息学工具对一级结构的分析预测α螺旋形成。在一些实施方案中，第二接头包含被配置为形成α螺旋的第二肽。在一些实施方案中，GM-CSF分子包含被配置为形成卷曲螺旋的第一肽和第二肽。卷曲螺旋可以是反平行卷曲螺旋。第一肽可以包含相对于SEQ IDNO:8不具有氨基酸取代或缺失或者具有少于约2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。第二肽可以包含相对于SEQ ID NO:9不具有氨基酸取代或缺失或者具有少于约2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，第一接头包含含有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸(并且最多至约30氨基酸)的氨基酸序列，其中氨基酸序列不包含规则二级结构(例如，α螺旋、β链、310螺旋、β转角)且/或是柔性接头。在一些实施方案中，第二接头包含含有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸(并且最多至约30氨基酸)的氨基酸序列，其中氨基酸序列不包含规则二级结构(例如，α螺旋、β链、310螺旋、β转角)且/或是柔性接头。第一接头可以包含相对于SEQ ID NO:10不具有氨基酸取代或者具有1个或2个氨基酸取代的序列。第一接头可以包含相对于SEQ ID NO:11不具有氨基酸取代或者具有1个或2个氨基酸取代的序列。第二接头可以包含相对于SEQ ID NO:10不具有氨基酸取代或者具有1个或2个氨基酸取代的序列。第二接头可以包含相对于SEQID NO:11不具有氨基酸取代或者具有1个或2个氨基酸取代的序列。第一接头可以包含相对于SEQ ID NO:12不具有氨基酸取代或者具有1个、2个、3个或4个氨基酸取代的序列。第二接头可以包含相对于SEQ ID NO:13不具有氨基酸取代或者具有1个、2个、3个或4个氨基酸取代的序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，包含第一接头、GM-CSF肽和第二接头的GM-CSF分子(在一些情况下称为GM-CSF插入序列)连接至抗体可变结构域。GM-CSF插入序列可以位于抗体可变结构域的第一序列(例如，重链或轻链的骨架1)与抗体可变结构域的第二序列(例如，分别为重链或轻链的骨架4)之间。抗体可变结构域的第一序列可以包含相对于SEQ ID NO:14不具有氨基酸取代或者具有1个、2个或3个氨基酸取代的序列。抗体可变结构域的第二序列可以包含相对于SEQ ID NO:15不具有氨基酸取代或者具有1个、2个或3个氨基酸取代的序列。抗体可变结构域的第一序列可以包含相对于SEQ ID NO:32不具有氨基酸取代或者具有1个、2个或3个氨基酸取代的序列。抗体可变结构域的第二序列可以包含相对于SEQ ID NO:33不具有氨基酸取代或者具有1个、2个或3个氨基酸取代的序列。
在一些实施方案中，GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:42至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X5，并且X5包含GM-CSF插入序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。
在一些实施方案中，GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:26至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X1，并且X1包含GM-CSF插入序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:29至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:29至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:29至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:29并且第二多肽包含SEQ ID NO:31。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:28至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:28至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:28至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:28并且第二多肽包含SEQ ID NO:30。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:2至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQID NO:6至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:2并且第二多肽包含SEQ ID NO:6。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQID NO:1至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQID NO:5至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:1并且第二多肽包含SEQ ID NO:5。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:45至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:46至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:47至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:48至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:49至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:50至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:51至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:52至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ IDNO:53至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:54至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:55至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:56至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:57至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:58至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:59至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:60至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:61至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:62至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:63至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:64至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含与SEQ ID NO:67至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含与SEQ ID NO:68至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其由第一核酸和第二核酸编码，所述第一核酸包含与SEQ ID NO:69至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二核酸包含与SEQ ID NO:70至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其由第一核酸和第二核酸编码，所述第一核酸包含与SEQ ID NO:71至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二核酸包含与SEQ IDNO:72至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其由第一核酸和第二核酸编码，所述第一核酸包含与SEQ ID NO:73至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二核酸包含与SEQ ID NO:74至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其由第一核酸和第二核酸编码，所述第一核酸包含与SEQ ID NO:75至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述第二核酸包含与SEQ IDNO:76至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，GM-CSF分子包含来自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:76的一种或多种序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子包含来自表4的序列。表4中的抗体缩写包括：用于重链的“HC”、用于重链的可变区的“VH”、用于可结晶片段区的“Fc”、用于轻链的“LC”、用于轻链的可变区的“VL”、用于轻链的互补决定区3的“CDR3L”、用于重链的互补决定区3的“CDR3H”以及用于骨架的“FR”。
支架
在一个方面，本文提供了GM-CSF分子，其包含连接至支架的GM-CSF肽。支架可以增加GM-CSF肽的半衰期。可以使用本文提供的实施例中详述的实验或本领域容易获得的方法来测量半衰期的测量值。相比于没有融合体的GM-CSF，例如重组GM-CSF诸如沙格司亭(sargramostim)，半衰期可以增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。因此，本文提供了长效GM-CSF分子，其相比于单独GM-CSF肽具有增加的半衰期。
在一些实施方案中，支架包含一个或多个抗体部分。抗体部分可以包含整个抗体分子或包含含有抗体片段的任何多肽，包括但不限于重链、轻链、可变结构域、可变轻链区(VL)、可变重链区(VH)、恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3和/或CL)、互补决定区(CDR，例如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3)、骨架区(例如，FRH1、FRH2、FRH3、FRH4、FRL1、FRL2、FRL3和/或FRL4)、抗原结合片段、单结构域抗体、片段抗原结合(Fab)区、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fab'、可结晶片段(Fc)区、单链可变片段(scFv)、二价scFv、单结构域抗体、三功能抗体、化学连接的F(ab')2及其任何组合。抗体部分可以包含通过接头或通过二硫键连接的重链和轻链。在一些情况下，抗体部分包含可变结构域，所述可变结构域已经经修饰或以其他方式工程化以降低或消除抗原结合。可以通过突变，例如使轻链和/或重链的CDR3突变来降低或消除抗原结合。抗体可以衍生自本领域技术人员已知的任何类型，包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY和IgW。
如本文所用，抗体可变结构域不限于能够结合抗原的抗体片段，还包括衍生自能够结合抗原的抗体片段的抗体片段，其中衍生化包括降低或消除抗原结合。在一些此类情况下，已经被衍生化以降低或消除抗原结合的抗体结合片段的氨基酸长度可以与所述抗体结合片段所衍生自的抗原结合片段(即结合抗原的抗原结合片段)的氨基酸长度相同或者在其约10％-120％内。在一些情况下，抗体可变结构域是抗体区，所述抗体区包含抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3；其中一个或多个CDR已经被突变或以其他方式在氨基酸序列同一性方面改变以相比于未突变或改变的抗体降低或消除抗原结合。对于其中GM-CSF肽位于CDR内的GM-CSF分子，抗体可变结构域可以包含抗体区，所述抗体区包含抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3；其中一个或多个CDR已经被突变或以其他方式在氨基酸序列同一性方面改变以降低或消除抗原结合。在一些情况下，修饰是例如通过用GM-CSF肽置换1个、2个、3个、4个、5个或全部CDR氨基酸来使GM-CSF肽位于CDR区内。
抗体部分可以是从曲妥珠单抗抗体修饰的，所述曲妥珠单抗抗体包含含有SEQ IDNO:44的重链可变区和含有SEQ ID NO:31的轻链可变区。抗体部分可以是从帕利珠单抗抗体修饰的，所述帕利珠单抗抗体包含含有SEQ ID NO:65的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的轻链可变区。可以通过将GM-CSF肽插入至重链或轻链序列中来修饰抗体部分。GM-CSF肽可以置换重链或轻链序列的一个或多个氨基酸。GM-CSF可以位于重链或轻链序列的CDR内。CDR可以是CDR3。抗体部分可以在重链或轻链序列的氨基或羧基末端处连接至GM-CSF肽。在一些实施方案中，抗体部分经修饰以降低抗原结合。例如，帕利珠单抗重链CDR3可以经修饰以用FGG置换NWY。
在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:15。抗体部分可以包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。GM-CSF肽可以位于SEQID NO:14与SEQ ID NO:15之间。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:33。抗体部分可以包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。GM-CSF肽可以位于SEQ ID NO:32与SEQ ID NO:33之间。
在一些情况下，支架包含抗体或抗体片段的“至少一部分”。在某些实施方案中，“至少一部分”指示抗体或抗体片段的长度的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性存在于组合物中。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:44(120个氨基酸)的重链的至少一部分的支架以至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性包含SEQ ID NO:44的至少约96个氨基酸(80％)、102个氨基酸(85％)、108个氨基酸(90％)或114个氨基酸(95％)。“……的至少一部分”可以是一个连续氨基酸序列，或者由GM-CSF肽分开的两个连续氨基酸序列的总和。例如，包含抗体可变结构域的至少一部分的GM-CSF分子可以包含抗体可变结构域的第一连续氨基酸序列、GM-CSF肽和抗体可变结构域的第二连续氨基酸序列，其中抗体可变结构域的第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列总计达抗体可变结构域的序列长度的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些情况下，GM-CSF分子包含选自以下的抗体或抗体片段的至少一部分：抗体可变结构域和/或抗原结合片段(例如，包含抗体重链和/或抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3的片段)；其中所述分子包含第一抗体或抗体片段区、GM-CSF肽和第二抗体或抗体片段区；并且其中“至少一部分”指示第一抗体或抗体片段区的长度和第二抗体或抗体片段区的长度的总和为抗体可变结构域和/或抗原结合片段的长度的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
抗体部分可以包含来自曲妥珠单抗抗体的抗体序列。抗体部分可以包含与曲妥珠单抗抗体的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。例如，抗体部分包含与选自SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:44的一个或多个的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。作为另一个示例，抗体部分包含选自SEQ ID NO:30-35、37-39和44的一个或多个的序列的至少约10个连续氨基酸。
抗体部分可以包含来自抗Her2抗体的抗体序列。抗体部分可以包含抗Her2抗体的至少一部分。抗体部分可以包含与抗Her2抗体的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体部分包含帕利珠单抗抗体序列。抗体部分可以包含与帕利珠单抗抗体的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。例如，抗体部分包含与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:23的一个或多个的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。作为另一个示例，抗体部分包含选自SEQID NO:14、15、17、65和19-23的一个或多个的序列的至少约10个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的抗体支架对于抗原没有特异性或者对抗原具有降低的结合。例如，本文提供的抗体支架可以不结合抗原或者可以以弱于约10M-2、10M-3或10M-5的亲和力结合抗原，所述亲和力例如如通过本文的实施例中所述的测定所确定。示例性抗体包含六个CDR，其中一个或多个CDR是包含降低或消除抗原结合的一个或多个氨基酸添加、取代或缺失的经修饰的CDR。在一些情况下，通过插入治疗性肽诸如GM-CSF来修饰CDR。在示例性实施方案中，GM-CSF插入重链或轻链的CDR3中。本文提供的示例性GM-CSF分子包含位于抗体可变结构域的重链CDR3内的GM-CSF肽，其中抗体相比于没有GM-CSF融合体的抗体不具有抗原结合或具有降低的抗原结合。GM-CSF可以置换CDR的一个、两个、三个、四个、五个或全部氨基酸。抗体可以包含通过将GM-CSF插入CDR内而修饰的曲妥珠单抗抗体可变结构域支架。在一些情况下，将GM-CSF插入曲妥珠单抗的CDR3内降低抗原结合。包含插入的抗体可以进一步包含一个或多个氨基酸缺失，例如，在插入置换CDR的一个或多个氨基酸的情况下。在一些实施方案中，CDR序列被突变以降低抗原结合。在一些实施方案中，帕利珠单抗的重链CDR3包含SMITX(i)X(ii)X(iii)FDV(SEQ ID NO:66)，其中X(i)选自F、A、G和P；X(ii)选自G、A、S、T和P；并且X(iii)选自G、A、V、L和P。在一些实施方案中，X(i)是F。在一些实施方案中，X(ii)是G。在一些实施方案中，X(ii)是A。在一些实施方案中，X(iii)是G。作为示例，抗体帕利珠单抗的重链CDR3被突变以用FGG置换NWY，从而相比于未突变的帕利珠单抗降低与RSV-F的结合。作为另一个示例，抗体曲妥珠单抗的重链CDR3被突变以去除约1个、2个、3个、4个、5个或全部CDR3氨基酸，从而相比于未突变的曲妥珠单抗降低与Her2的结合。在一些情况下，用GM-CSF肽或GM-CSF插入序列置换曲妥珠单抗的CDR3的一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，抗体部分对于哺乳动物靶标没有特异性。在一些实施方案中，抗体是抗病毒抗体。在一些实施方案中，抗体是抗细菌抗体。在一些实施方案中，抗体是抗寄生虫抗体。在一些实施方案中，抗体是抗真菌抗体。在一些实施方案中，抗体部分衍生自抗体疫苗。
在一些实施方案中，抗体部分包含来自(但不限于)以下的抗体序列：阿克托舒单抗(actoxumab)、贝兹罗图单抗(bezlotoxumab)、CR6261、埃巴单抗(edobacomab)、依芬谷单抗(efungumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、非维珠单抗(felvizumab)、佛拉韦芦单抗(foravirumab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)(TMB-355、TNX-355)、利韦单抗(libivirumab)、莫他韦珠单抗(motavizumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕诺巴库单抗(panobacumab)、雷非韦卢单抗(rafivirumab)、雷西库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、司韦单抗(sevirumab)(MSL-109)、苏韦珠单抗(suvizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、妥韦单抗(tuvirumab)和优托珠单抗(urtoxazumab)。
在一些实施方案中，抗体部分包含来自靶向以下的抗体的抗体序列：艰难梭菌(Clostridium difficile)、正粘病毒(Orthomyxoviruses)(甲型流感病毒(Influenzavirus A)、乙型流感病毒(Influenzavirus B)、丙型流感(Influenzavirus C)、伊萨病毒(Isavirus)、托高土病毒(Thogotovirus))、大肠杆菌(Escherichia coli)、假丝酵母属(Candida)、狂犬病(Rabies)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、肝炎(Hepatitis)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
抗体部分可以包含来自抗病毒抗体的抗体序列。抗病毒抗体可以针对病毒蛋白的表位。抗病毒抗体可以靶向包括但不限于以下的一种或多种病毒：腺病毒(Adenoviruses)、疱疹病毒(Herpesviruses)、痘病毒(Poxviruses)、细小病毒(Parvoviruses)、呼肠孤病毒(Reoviruses)、小RNA病毒(Picornaviruses)、披膜病毒(Togaviruses)、正粘病毒、弹状病毒(Rhabdoviruses)、逆转录病毒(Retroviruses)和嗜肝DNA病毒(Hepadnaviruses)。病毒蛋白可以来自呼吸道合胞病毒。病毒蛋白可以是呼吸道合胞病毒的F蛋白。表位可以在F蛋白的A抗原位点中。抗病毒抗体可以基于或衍生自帕利珠单抗。抗体可以基于或衍生自抗病毒疫苗。抗病毒抗体可以基于或衍生自艾韦单抗、佛拉韦芦单抗、利韦单抗、雷非韦卢单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、非维珠单抗、莫他韦珠单抗、帕利珠单抗和/或苏韦珠单抗。
抗体部分可以包含来自抗病毒抗体G的抗体序列。抗体部分可以包含抗病毒抗体G的至少一部分。抗体部分可以包含与抗病毒抗体G的至少一部分至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含抗病毒抗体M的氨基酸序列。
抗体部分可以包含来自以下的抗体序列：艾韦单抗、佛拉韦芦单抗、利韦单抗、雷非韦卢单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、非维珠单抗、莫他韦珠单抗、帕利珠单抗和/或苏韦珠单抗抗体。抗体部分可以包含艾韦单抗、佛拉韦芦单抗、利韦单抗、雷非韦卢单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、非维珠单抗、莫他韦珠单抗、帕利珠单抗和/或苏韦珠单抗抗体的至少一部分。抗体部分可以包含与以下的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的抗体序列：艾韦单抗、佛拉韦芦单抗、利韦单抗、雷非韦卢单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、非维珠单抗、莫他韦珠单抗、帕利珠单抗和/或苏韦珠单抗抗体。
抗体部分可以包含来自抗细菌抗体的抗体序列。抗细菌抗体可以针对细菌蛋白的表位。抗细菌抗体可以靶向包括但不限于以下的细菌：橙黄醋杆菌(Acetobacteraurantius)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、炭疽杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈拟杆菌(Bacteroidesgingivalis)、产黑素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、马耳他布氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布氏杆菌(Brucellasuis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎披衣菌(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热披衣菌(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、伯内氏柯西氏菌(Coxiella burnetii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、病臭肠球菌(Enterococcus maloratus)、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、具核梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、扭脱甲基杆菌(Methanobacterium extroquens)、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonie)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、龋齿罗氏菌(Rothiadentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibrio comma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。抗体可以基于或衍生自细菌疫苗。抗病毒抗体可以基于或衍生自奈巴库单抗、帕诺巴库单抗、雷西库单抗、埃巴单抗、帕吉巴昔单抗和/或特非珠单抗。
抗体部分可以包含来自抗细菌抗体G的抗体序列。抗体部分可以包含抗细菌抗体G的至少一部分。抗体部分可以包含与抗细菌抗体G的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含基于或衍生自抗细菌抗体M的氨基酸序列。
抗体部分可以包含来自以下的抗体序列：奈巴库单抗、帕诺巴库单抗、雷西库单抗、埃巴单抗、帕吉巴昔单抗和/或特非珠单抗抗体。抗体部分可以包含与以下的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列：奈巴库单抗、帕诺巴库单抗、雷西库单抗、埃巴单抗、帕吉巴昔单抗和/或特非珠单抗抗体。
抗体部分可以包含来自抗寄生虫抗体的抗体序列。抗寄生虫抗体可以针对寄生虫蛋白的表位。抗寄生虫抗体可以靶向包括但不限于以下的寄生虫或寄生虫蛋白：寄生虫棘阿米巴属(Acanthamoeba)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、巴贝虫属(Babesia)(分歧巴贝虫(B.divergens)、双芽巴贝虫(B.bigemina)、马巴贝虫(B.equi)、果氏巴贝虫(B.microfti)、邓肯巴贝虫(B.duncani))、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、芽囊原虫属(Blastocystis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、贝氏等孢子球虫(Isospora belli)、利什曼原虫属(Leishmania)、福氏内格里虫(Naegleria fowleri)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、柯氏卵形疟原虫(Plasmodium ovale curtisi)、沃氏卵形疟原虫(Plasmodium ovale wallikeri)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、西伯氏鼻孢子虫(Rhinosporidium seeberi)、牛-人肉孢子虫(Sarcocystis bovihominis)、猪-人肉孢子虫(Sarcocystis suihominis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、多节绦虫亚纲(Cestoda)、多头绦虫(Taeniamulticeps)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、沃氏棘球绦虫(Echinococcus vogeli)、少节棘球绦虫(Echinococcus oligarthrus)、短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)、牛肉绦虫(Taeniasaginata)、猪肉绦虫(Taenia solium)、古巴伯特绦虫(Bertiella mucronata)、萨氏伯特绦虫(Bertiella studeri)、猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)；麝猫支睾吸虫(Clonorchis viverrini)、分支双腔吸虫(Dicrocoelium dendriticum)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、大片吸虫(Fasciolagigantica)、布氏姜片虫(Fasciolopsis buski)、棘颚口线虫(Gnathostoma spinigerum)、刚棘颚口线虫(Gnathostoma hispidum)、横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)、泰国肝吸虫(Opisthorchis viverrini)、猫后睾吸虫(Opisthorchis felineus)、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)；非洲并殖吸虫(Paragonimus africanus)；卡里并殖吸虫(Paragonimus caliensis)；猫肺并殖吸虫(Paragonimus kellicotti)；斯氏并殖吸虫(Paragonimus skrjabini)；双侧宫并殖吸虫(Paragonimus uterobilateralis)、血吸虫属物种(Schistosoma sp.)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、湄公血吸虫(Schistosoma mekongi)、多刺棘口吸虫(Echinostoma echinatum)、毛毕吸虫(Trichobilharzia regenti)、裂体科(Schistosomatidae)、十二指肠钩虫(Ancylostomaduodenale)、美洲板口线虫(Necator americanus)、哥斯达黎加管圆线虫(Angiostrongylus costaricensis)、异尖线虫(Anisakis)、蛔虫属物种人蛔虫((Ascarissp.Ascaris lumbricoides)、浣熊拜林蛔线虫(Baylisascaris procyonis)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、帝汶布鲁线虫(Brugia timori)、肾膨结线虫(Dioctophyme renale)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinensis)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、格里高利蛲虫(Enterobius gregorii)、牙龈嗜盐菌(Halicephalobus gingivalis)、罗阿丝虫(Loa filaria)、链尾曼森线虫(Mansonella streptocerca)、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、加利福尼亚吸吮线虫(Thelaziacaliforniensis)、结膜吸吮线虫(Thelazia callipaeda)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)、猫弓蛔虫(Toxocara cati)、旋毛线虫(Trichinella spiralis)、布氏毛线虫(Trichinellabritovi)、纳氏毛线虫(Trichinella nelsoni)、本地毛线虫(Trichinella nativa)、毛首鞭形鞭虫(Trichuris trichiura)、狐毛尾线虫(Trichuris vulpis)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、原棘头虫目(Archiacanthocephala)、念珠棘虫属(Moniliformis)、锯齿状舌形虫(Linguatula serrata)、狂蝇总科(Oestroidea)、丽蝇科(Calliphoridae)、麻蝇科(Sarcophagidae)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、硬蜱科(Ixodidae)、隐喙蜱科(Argasidae)、温带臭虫(Cimexlectularius)、人虱(Pediculus humanus)、人体虱(Pediculus humanus corporis)、耻阴虱(Pthirus pubis)、毛囊蠕形螨/皮脂蠕形螨/犬蠕形螨(Demodex folliculorum/brevis/canis)、疥螨(Sarcoptes scabiei)、嗜人锥蝇(Cochliomyia hominivorax)和致痒蚤(Pulex irritans)。
抗体部分可以包含来自抗寄生虫抗体G的抗体序列。抗体部分可以包含抗寄生虫抗体G的至少一部分。抗体部分可以包含与抗寄生虫抗体G的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列。
抗体部分可以包含来自抗真菌抗体的抗体序列。抗细菌抗体可以针对真菌蛋白的表位。抗真菌抗体可以靶向包括但不限于以下的真菌或真菌蛋白：新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)、白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、类星形假丝酵母(Candidastellatoidea)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。抗真菌抗体可以基于或衍生自依芬谷单抗。
抗体部分可以包含来自抗真菌抗体G的抗体序列。抗体部分可以包含抗真菌抗体G的至少一部分。抗体部分可以包含与抗真菌抗体G的至少一部分相同或者至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多相同的氨基酸序列。
抗体部分可以包含来自抗癌抗体的抗体序列。抗癌抗体的示例包括但不限于阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布本妥昔单抗(brentuximab)、卡那单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹单抗(ipilimumab)、莫罗单抗(muromonab)-cd3、那他珠单抗(natalizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗、帕尼单抗(panitumumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗。
抗体部分可以包含人抗体的至少一部分。抗体部分可以包含人源化抗体的至少一部分。抗体部分可以包含嵌合抗体的至少一部分。抗体部分可以基于或衍生自人抗体。抗体部分可以基于或衍生自人源化抗体。抗体部分可以基于或衍生自嵌合抗体。抗体部分可以基于或衍生自单克隆抗体。抗体部分可以基于或衍生自多克隆抗体。抗体部分可以包含来自以下的抗体的至少一部分：哺乳动物、禽类动物、爬行动物、两栖动物或其组合。哺乳动物可以是人。哺乳动物可以是非人灵长类动物。哺乳动物可以是狗、猫、绵羊、山羊、牛、兔、大鼠或小鼠。
在一个方面，本文提供了抗体可变结构域，其包含：(a)轻链，所述轻链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:22不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:23不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL2和(iii)含有相对于SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:77不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL3；和(b)重链，所述重链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:19不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:20不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH2和(iii)含有相对于SEQ ID NO:21不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH3。在一些实施方案中，CDRL3包含相对于SEQ ID NO:24不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:16的轻链；和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的重链。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:77的轻链；和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的重链。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24的轻链；和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的重链。进一步提供了抗体，其包含抗体可变结构域并且进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以是降低的ADCC和/或降低的CDC。Fc区可以包含与SEQ IDNO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的经修饰的人IgG1。
在一个方面，本文提供了抗体可变结构域，其包含：(a)轻链，所述轻链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:37不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:38不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL2和(iii)含有相对于SEQ ID NO:39不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL3；和(b)重链，所述重链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:34不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:35不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH2和(iii)含有相对于SEQID NO:16不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH3。在一些实施方案中，CDRH3包含相对于SEQ ID NO:36不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39的轻链；和含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:16的重链。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:37-SEQ IDNO:39的轻链；和含有SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:36的重链。进一步提供了抗体，其包含抗体可变结构域并且进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以是降低的ADCC和/或降低的CDC。Fc区可以包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的经修饰的人IgG1。
在一个方面，本文提供了抗体可变结构域，其包含：(a)轻链，所述轻链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:37不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:38不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL2和(iii)含有相对于SEQ ID NO:39不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRL3；和(b)重链，所述重链包含(i)含有相对于SEQ ID NO:34不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH1，(ii)含有相对于SEQ ID NO:35不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH2和(iii)含有相对于SEQID NO:77不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个或3个氨基酸取代或缺失的序列的CDRH3。在一些实施方案中，CDRH3包含相对于SEQ ID NO:36不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，抗体可变结构域包含含有SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39的轻链；和含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:77的重链。进一步提供了抗体，其包含抗体可变结构域并且进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以是降低的ADCC和/或降低的CDC。Fc区可以包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的经修饰的人IgG1。
降低的效应子功能
本文提供的抗体支架可以包含对野生型IgG Fc区的一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代以相比于野生型IgG降低与效应子分子的结合。抗体可以具有降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性。作为示例，支架包含含有以下突变中的一个或多个的IgG1 Fc区：E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S和P331S。在一些实施方案中，抗体包含含有与25至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的恒定区。在一些实施方案中，抗体包含含有与3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的CH1结构域。在一些实施方案中，抗体包含含有与4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的Fc区。
接头
GM-CSF分子可以包含经由一个或多个接头连接至支架的GM-CSF肽。在一些情况下，接头分子包含含有二级结构的接头肽。二级结构可以是α螺旋。示例性α螺旋肽包含与SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:9中的任一个具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，接头分子包括柔性的、不具有规则二级结构的接头肽。示例性接头肽包含与SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11中的任一个具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一接头包含与SEQ ID NO:12至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二接头包含与SEQ ID NO:13至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，GM-CSF分子包含GM-CSF肽，所述GM-CSF肽位于支架内，使得GM-CSF肽的氨基末端和GM-CSF肽的羧基末端各自连接至支架。GM-CSF肽可以通过第一接头在其氨基末端处连接至支架，并且通过第二接头在其羧基末端处连接至支架。作为示例，提供了GM-CSF分子，其包含A1-L1-T-L2-A2，其中A1和A2是支架A3(例如，抗体序列)的第一部分和第二部分，L1是第一接头，L2是第二接头，并且T是GM-CSF肽。A3可以是抗体可变结构域的重链或轻链。在一些情况下，基于L1的一级序列，L1被配置为形成螺旋。在一些情况下，基于L2的一级序列，L2被配置为形成螺旋。在一些情况下，L1被配置为形成第一螺旋，L2被配置为形成第二螺旋，并且第一螺旋和第二螺旋被配置为形成卷曲螺旋。卷曲螺旋可以是反平行的。在一些实施方案中，L1包含相对于SEQ ID NO:8不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，L2包含相对于SEQ IDNO:9不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，L1包括柔性接头。L1可以包含相对于SEQ ID NO:10不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个或2个氨基酸取代或缺失的序列。L1可以包含相对于SEQ ID NO:11不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个或2个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，L2包括柔性接头。L2可以包含相对于SEQ ID NO:10不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个或2个氨基酸取代或缺失的序列。L2可以包含相对于SEQ ID NO:11不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个或2个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，L1包含相对于SEQID NO:12不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。在一些实施方案中，L2包含相对于SEQ ID NO:13不具有氨基酸取代或缺失或者具有约1个、2个、3个或4个氨基酸取代或缺失的序列。L1-T-L2可以包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
载体、宿主细胞和重组方法
在一个方面，本文提供的GM-CSF分子包含多肽序列。本文公开的此类GM-CSF分子(在一些情况下称为GM-CSF蛋白融合体)可以通过已知的重组和蛋白质纯化方法来表达和纯化。在示例性实施方案中，合成编码蛋白融合体的核酸，将其扩增(例如，通过PCR)、限制性酶消化并凝胶纯化。可以将消化的核酸插入至可复制载体中。可以将含有消化的蛋白融合体插入序列的可复制载体转化或转导至宿主细胞中，以供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。宿主细胞可以是原核或真核细胞。此外，与宿主微生物相容的含有复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主有关的转化载体。例如，噬菌体诸如λGEMTM-11可以在制备可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体中使用。蛋白融合体可以在细胞内(例如，细胞质)或在细胞外(例如，分泌)表达。对于细胞外表达，载体可以包含能够使抗体蛋白转运至细胞外的分泌信号。
用于克隆或表达蛋白融合体编码载体的合适的宿主细胞包括原核和真核细胞。宿主细胞可以是真核的。真核细胞的示例包括但不限于人胚肾(HEK)细胞(例如，HEK 293F细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、真菌、酵母、无脊椎细胞(例如，植物细胞和昆虫细胞)、淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。合适的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利细胞、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TR1细胞、MRC 5细胞和FS4细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如，大肠杆菌)。
可以用含有编码GM-CSF蛋白融合体的核苷酸的载体转化宿主细胞。转化的宿主细胞可以在培养基中培养。培养基可以补充有一种或多种用于诱导启动子、选择转化体或者扩增或表达编码所期望序列的基因的试剂。用于转化宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以包括电穿孔、氯化钙或聚乙二醇/DMSO。可以用含有编码GM-CSF蛋白融合体的核苷酸的载体转染或转导宿主细胞。转染或转导的宿主细胞可以在培养基中培养。培养基可以补充有一种或多种用于诱导启动子、选择转染或转导的细胞或者表达编码所期望序列的基因的试剂。
表达的GM-CSF蛋白融合体可以被分泌至宿主细胞的周质中并且从其中回收，或者转运至培养基中。从周质中回收蛋白质可以涉及破坏宿主细胞。宿主细胞的破坏可以包括渗透压休克、超声处理和/或裂解。可以使用离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。GM-CSF蛋白融合体可以例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化。可替代地，可以在培养基中分离分泌至所述培养基中的GM-CSF蛋白融合体。可以从培养物中去除细胞，并且将培养上清液过滤和浓缩，以便进一步纯化产生的蛋白质。可以使用通常已知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定来进一步分离和鉴定表达的多肽。
可以通过发酵工艺大量进行GM-CSF蛋白融合体生产。多种大规模补料分批发酵程序可用于重组蛋白的生产。大规模发酵具有至少1000升的容量，例如约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物，尤其是葡萄糖(一种优选的碳源/能源)。小规模发酵通常是指在容积容量不超过大约100升，并且范围可以为约1升至约100升的发酵罐中的发酵。在发酵工艺中，通常在细胞已经在合适的条件下生长至所期望密度(例如，约180-220的OD550)(在所述阶段细胞处于早期的稳定期)之后启动对蛋白质表达的诱导。根据采用的载体构建体，可以使用多种诱导剂，如本领域已知的以及本文所述的。在诱导前可以使细胞生长较短的时段。通常诱导细胞约12-50个小时，尽管可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本文公开的GM-CSF蛋白融合体的生产产率和质量，可以对多个发酵条件进行改进。例如，为了改善所分泌的GM-CSF蛋白融合体的正确组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺,反异构酶)的另外的载体来共转化宿主原核细胞。已经证明，伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解性。
为了使表达的异源蛋白质(特别是对蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解最小化，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本公开内容。例如，可以对宿主细胞菌株进行修饰以在编码已知细菌蛋白酶诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中实现一个或多个基因突变。一些缺乏大肠杆菌蛋白酶的菌株是可用的。
可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的非限制性示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅或阳离子交换树脂(诸如DEAE)上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法以及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
可以使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore
Figure BDA0003886481550000541
超滤单元来浓缩GM-CSF蛋白融合体。
可以在前述任何步骤中包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物，以抑制GM-CSF蛋白融合体的蛋白水解。
在一些情况下，GM-CSF蛋白融合体在分离后可能不具有生物活性。用于将多肽“重折叠”或转化成其三级结构并产生二硫键的各种方法可以用于恢复生物活性。此类方法包括使溶解的多肽暴露于通常高于7的pH以及特定浓度的离液剂的存在下。离液剂的选择类似于用于包含体增溶的选择，但通常离液剂在较低浓度下使用，并且不必与用于增溶的离液剂相同。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将含有还原剂或特定比率的还原剂加上其氧化形式以生成特定的氧化还原电位，从而允许在一个或多个蛋白质的半胱氨酸桥的形成中发生二硫化物改组。一些常用的氧化还原电对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。在许多情况下，可以使用共溶剂来增加重折叠的效率，并且用于此目的的常见试剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
组合物
本文公开了组合物，其包含GM-CSF肽，诸如包含GM-CSF肽和支架的GM-CSF分子(例如，长效GM-CSF分子)。对于包含多肽序列的支架，GM-CSF分子在一些情况下也可以称为GM-CSF蛋白融合体。
组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物。用于在本发明药物组合物中使用的药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物包括载剂、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、递送媒介物、张力剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。
中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当载剂。药物组合物可以包含抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或抗体；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如吐温、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。还通过举例的方式，合适的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可以用作防腐剂。合适的共溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(诸如聚山梨醇酯80)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)等。缓冲剂可以是常规缓冲液，诸如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸缓冲剂可以是约pH 4-5.5，并且Tris缓冲剂可以是约pH 7-8.5。另外的药剂在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack PublishingCompany,1990中阐述。
组合物可以呈液体形式或呈冻干或冷冻干燥形式，并且可以包含一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增量剂。在一个实施方案中，包含冻干保护剂，其为非还原糖，诸如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得在重构后，所得配制品将是等渗的，但高渗或略微低渗的配制品也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量应足以防止蛋白质在冻干时不可接受的量的降解和/或聚集。在另一个实施方案中，包含表面活性剂，例如像非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂诸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(例如，Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蔻基磺基甜菜碱、亚油基磺基甜菜碱或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、亚油酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰胺丙基甜菜碱或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基二甲基胺、棕榈酰胺丙基二甲基胺或异硬脂酰胺丙基二甲基胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油酰基(ofeyl)牛磺酸二钠；MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普朗尼克、PF68等)。可以存在于预冻干配制品中的表面活性剂的示例性量是约0.001％-0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填充剂、粘合剂)可以包括例如阿拉伯胶、白蛋白、藻酸、磷酸钙(二碱式)、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、侵填体(tylose)、预胶化淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨糖醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、黄蓍胶微晶纤维素、淀粉和玉米醇溶蛋白。高分子量结构添加剂的示例性浓度是以重量计0.1％至10％。在其他实施方案中，可以包含增量剂(例如，甘露糖醇、甘氨酸)。
非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质；肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。大体上参见Remington's Pharmaceutical Science,第16版,Mack编辑,1980。
本文所述的组合物可以以提供产品的局部浓度(例如，弹丸式、贮库(depot)效应)和/或增加在特定局部环境中的稳定性或半衰期的方式配制用于控制递送或持续递送。组合物可以包括本文公开的GM-CSF分子蛋白、多肽、核酸或载体与聚合化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂以及提供活性剂的控制释放或持续释放的试剂诸如可生物降解基质、可注射微球、微囊颗粒、微囊剂、可生物侵蚀颗粒珠、脂质体和可植入递送装置的配制品，然后可以将其作为贮库型注射剂递送。用于配制此类持续递送或控制递送装置的技术是已知的，并且已经开发和使用了多种聚合物用于药物的控制释放和控制递送。此类聚合物通常是可生物降解的和生物相容的。聚合物水凝胶(包括通过对映体聚合物或多肽区段的复合而形成的那些和具有温度或pH敏感特性的水凝胶)可能由于参与捕获生物活性蛋白剂的温和和水性条件而对于提供药物贮库效应是所期望的。
本文公开的药物组合物可以通过任何合适的施用途径施用至对象，所述施用途径包括但不限于肠胃外(静脉内、皮下、腹膜内、肌内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部)、外用、口服和/或经鼻施用。
适于肌内、皮下、肿瘤周围或静脉内注射的配制品可以包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液、以及用于重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的示例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、氢化蓖麻油(cremophor)等)、其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。例如通过以下方式维持适当流动性：通过使用包衣(诸如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。适于皮下注射的配制品还含有任选的添加剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
对于静脉内注射，可以将活性剂任选地配制在水性溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。
肠胃外注射任选地涉及弹丸式注射或连续输注。注射用配制品任选地以单位剂型呈现，例如在添加有防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。本文所述的药物组合物可以呈作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液的适于肠胃外注射的形式，并且含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物配制品包括呈水溶性形式的活性剂的水性溶液。另外，悬浮液任选地制备为适当的油性注射悬浮液。
可替代地或另外，可以经由植入至本文公开的GM-CSF分子已经吸附或包封于其上的膜、海绵或其他适当材料的受影响区域中来局部施用组合物。在使用植入装置的情况下，可以将装置植入至任何合适的组织或器官中，并且本文公开的GM-CSF肽、核酸或载体的递送可以经由弹丸式或经由连续施用或经由使用连续输注的导管通过所述装置直接进行。
可以将本文公开的包含GM-CSF分子的药物组合物配制用于吸入，例如像作为干粉。还可以将吸入溶液配制在液化推进剂中用于气雾剂递送。在又另一种配制品中，可以将溶液雾化。对于肺部递送，颗粒大小应适于递送至肺远侧。例如，颗粒大小可以是1μm至5μm；然而，可以使用更大的颗粒，例如，在每个颗粒是相当多孔的情况下。
包含本文公开的GM-CSF分子的某些配制品可以口服施用。可以将以这种方式施用的配制品用或不用在固体剂型(诸如片剂和胶囊)的混配中惯常使用的那些载剂来配制。例如，胶囊可以设计为在胃肠道中的某点释放配制品的活性部分，在所述点生物利用度最大化且全身性前降解最小化。可以包括另外的试剂以促进选择性结合剂的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种制剂可以包含在具有适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的GM-CSF分子。通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或者结合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或者润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
“药学上可接受的”可以是指由联邦或州政府监管机构批准或可批准或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出以用于在动物(包括人)中使用的。
“药学上可接受的盐”可以是指药学上可接受并且具有母体化合物的所期望药理活性的化合物盐。
“药学上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”可以是指可以与本公开内容的至少一种抗体一起施用至对象并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时不破坏其药理学活性且无毒的赋形剂、载剂或佐剂。
“药学上可接受的媒介物”可以是指与本公开内容的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。
治疗用途
在一个方面，本文公开的GM-CSF分子包含用于治疗、减轻、抑制和/或预防一种或多种疾病和/或病症的GM-CSF肽。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。神经系统疾病或病症的非限制性示例包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或特征在于神经炎症的疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是炎性疾病或病症。炎性疾病或病症的非限制性示例包括克罗恩氏病和结肠炎。在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病。感染性疾病可以包括巨细胞病毒感染。在一些实施方案中，疾病或病症包括帕金森氏病(PD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。
在一些实施方案中，在对象中进行诱导化学疗法后施用本文公开的GM-CSF分子。GM-CSF分子可以缩短嗜中性粒细胞恢复的时间和/或降低感染的发生率。在一些情况下，对象患有急性骨髓性白血病。
在一些实施方案中，施用本文公开的GM-CSF分子以将造血祖细胞动员至外周血中以便通过白细胞单采术收集。与不伴有动员的收集相比，动员可以允许收集更多数量的能够植入的祖细胞。在化学疗法诸如清髓性化学疗法后，更多数量的组细胞的移植可以导致更快速的植入。
在一些实施方案中，施用本文公开的GM-CSF分子以加速患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的对象体内的骨髓恢复。在一些实施方案中，施用本文公开的GM-CSF分子以加速患有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的对象体内的骨髓恢复。在一些实施方案中，施用本文公开的GM-CSF分子以加速患有霍奇金氏病的对象体内的骨髓恢复。在一些实施方案中，对象正经受自体骨髓移植(BMT)。相比于不伴有GM-CSF施用的骨髓植入，GM-CSF施用可以加速骨髓植入。相比于不伴有GM-CSF施用的持续时间，GM-CSF施用可以减少抗生素施用的中位持续时间。相比于无GM-CSF分子施用，施用可以降低感染发作的中位持续时间。相比于无GM-CSF分子施用，施用可以缩短住院治疗的中位持续时间。可以通过全血计数来检测对GM-CSF的血液学应答。
在一些实施方案中，施用本文公开的GM-CSF分子以加速正经受从HLA匹配相关供体的同种异体BMT的对象体内的骨髓恢复。
在一些实施方案中，将本文公开的GM-CSF分子施用至经受过其中植入延迟或已失败的同种异体或自体骨髓移植(BMT)的对象。施用可以延长对象的存活期。重组人GM-CSF用于多种造血障碍，包括降低化学疗法诱导的嗜中性粒细胞减少症的严重程度、加速骨髓移植后的造血恢复以及动员血液祖细胞用于移植。然而，重组GM-CSF在人体内具有短的半衰期并且通常通过在化学疗法后的15-21天内每日注射来施用。每日施用的需要还限制了GM-CSF对于化学疗法患者和用于治疗已经暴露于辐射的患者诸如ARS患者的吸引力。因此，提供了使用本文的长效GM-CSF分子用于此类病症(包括急性辐射综合征)的方法。
此外，初步临床前结果证明，GM-CSF可以保护和治疗细胞免受辐射毒性的损伤或副作用。GM-CSF可以有助于辐射损伤组织更快速愈合。
为了评估GM-CSF在人体内的功效，对正经受癌症治疗并且在辐射疗法后获得细胞损伤的人患者进行了回顾性分析。发现，对于在辐射疗法前接受GM-CSF的患者，所述治疗改善病症，其中一些显示损伤组织相比于对照组更快速愈合。因此，本文的方法包括用本文的GM-CSF分子治疗将经受辐射疗法、正经受辐射疗法或已经受过辐射疗法的对象。
在一些实施方案中，针对急性辐射综合征施用本文公开的GM-CSF分子。GM-CSF分子可以增加暴露于骨髓抑制剂量的辐射(急性辐射综合征的造血综合征，H-ARS)的对象的存活期。当辐射损伤骨髓时发生骨髓抑制。骨髓的抑制阻断血细胞的产生。GM-CSF分子可以促进发育为白细胞的骨髓细胞的恢复。因此，GM-CSF也可以用于治疗和/或预防感染。
GM-CSF在免疫调节和造血中起关键作用。不受疗法的约束，实验证据指明，在多种类型的人癌症中通常上调的GM-CSF标记待由免疫系统靶向的癌细胞。除了对多种免疫功能的直接刺激效应之外，GM-CSF受体的激活促进许多不同免疫细胞类型的存活、生长和分化，所述免疫细胞类型包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和各种T细胞。初步临床前结果已证明，GM-CSF可以以不同方式刺激免疫系统，从而停止或延迟肿瘤细胞生长。GM-CSF可以增加骨髓或外周血中存在的免疫细胞的数量。GM-CSF也可以诱导广泛的肿瘤破坏。
为了评估GM-CSF对免疫肿瘤学的功效，对诊断为患有癌症的人患者进行回顾性分析。发现，对于接受GM-CSF的患者，所述治疗改善其病症。对于接受GM-CSF的一些患者，相比于对照组，治疗延迟肿瘤生长。此外，对于接受GM-CSF的一些患者，相比于对照组，肿瘤大小减小。这些结果表明，GM-CSF可以为肿瘤抗原呈递创建有利环境。因此，本文的方法包括用本文的GM-CSF分子治疗患有癌症的对象。
在一些实施方案中，本文的方法包括治疗罹患痴呆，诸如阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、大脑淀粉样血管病(CAA)的对象。
初步临床前结果已证明，GM-CSF快速减少大脑淀粉样沉积并且完全逆转阿尔茨海默氏病(AD)的转基因小鼠模型中的记忆缺失。对因癌症正经受造血细胞移植并且获得来自化学疗法或放射的认知损害的人患者的认知研究进行回顾性分析(NCT01409915)。在接受集落刺激因子(CSF)以刺激骨髓并恢复免疫系统功能的患者中，发现相比于接受单独G-CSF的患者，接受GM-CSF加G-CSF的患者显著改善认知功能。这些发现与过去二十年在老年白细胞减少患者中使用重组人GM-CSF的积累安全性数据的组合支持使用GM-CSF作为用于逆转大脑淀粉样病变和AD的认知损害的治疗。
治疗方法可以包括向有需要的对象施用包含本文公开的一种或多种GM-CSF分子的组合物。组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂。GM-CSF分子可以是基本上纯化的(例如，基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。对象可以是动物，包括但不限于诸如牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、鸡、猫、狗、小鼠等的动物。对象可以是哺乳动物。对象可以是人。对象可以是非人灵长类动物。对象可以是牛。对象可以是禽、爬行动物或两栖动物。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含连接至包含抗体可变结构域的支架的GM-CSF肽。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。抗体可变结构域可以包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含或以其他方式连接至GM-CSF肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ IDNO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，提供了GM-CSF分子，其包含含有构成第一多肽的轻链序列和构成第二多肽的重链序列的抗体可变结构域，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，并且所述第二多肽包含与SEQID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ IDNO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第一多肽包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，第二多肽包含与SEQ IDNO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，提供了GM-CSF分子，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，轻链序列包含含有与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第一多肽，并且重链序列包含含有与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含连接至支架的GM-CSF肽，所述支架包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含与SEQ ID NO:26(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGS[X1]PFTFGGGTKLEIKR)至少约90％相同的序列，其中轻链序列包含X1并且X1包括GM-CSF；所述重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。GM-CSF可以是人、牛或鼠GM-CSF。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包括GM-CSF的变体或同源物。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:26至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链序列包含与SEQ ID NO:27(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[X2]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGPFTFGGGTKLEIKR)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中轻链序列包含X2并且X2包括GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含Fc区，Fc区包含相比于人IgG1(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc区可以包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含连接至支架的GM-CSF肽，所述支架包含含有重链序列和轻链序列的抗体可变结构域，所述重链序列包含与SEQ ID NO:42(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR[[X5]]WGQGTLVTVSS)至少约90％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包括GM-CSF肽；所述轻链序列包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。GM-CSF可以是人、牛或鼠GM-CSF。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:16至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包含与SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。GM-CSF可以包括GM-CSF的变体或同源物。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:42至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[[X6]]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGDYWGQGTLVTVSS)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中重链序列包含X6并且X6包括GM-CSF。在一些实施方案中，重链序列包含与SEQ ID NO:43至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，GM-CSF分子进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1(SEQ ID NO:25)降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc区可以包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些情况下，Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列和含有与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ IDNO:29至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ IDNO:29至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:29至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:29并且第二多肽包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列和含有与SEQ ID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ IDNO:28至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ IDNO:28至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:28至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:30至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:28并且第二多肽包含SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列和含有与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQID NO:6至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:6至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ IDNO:6至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:2并且第二多肽包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。
本文提供了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含GM-CSF分子的组合物，所述GM-CSF分子包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列和含有与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约95％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约95％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约96％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约96％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约97％相同的序列并且第二多肽包含与SEQID NO:5至少约97％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约98％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ ID NO:5至少约98％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1至少约99％相同的序列并且第二多肽包含与SEQ IDNO:5至少约99％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:1并且第二多肽包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施方案中，神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。在一些实施方案中，疾病或病症包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，疾病或病症包括阿尔茨海默氏病(AD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括创伤性脑损伤。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎性肠病(IBD)，包括结肠炎和/或克罗恩氏病(CD)。在一些实施方案中，疾病或病症包括急性辐射综合征。在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，GM-CSF分子约每7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、每周、每两周或每月施用一次。
施用
在一个方面，本文提供的包含支架的GM-CSF分子是长效的，具有大于单独GM-CSF肽的半衰期的半衰期。此类GM-CSF分子可以每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每15天一次、每16天一次、每17天一次、每18天一次、每19天一次、每20天一次、每21天一次、每22天一次、每23天一次、每24天一次、每25天一次、每26天一次、每27天一次、每28天一次、每29天一次、每30天一次、每31天一次、每32天一次或每月施用一次至有需要的对象。本文提供的GM-CSF分子可以约每两周施用一次。本文提供的GM-CSF分子可以约每三周施用一次。本文提供的GM-CSF分子可以约每四周施用一次。本文提供的GM-CSF分子可以约每月施用一次。将在治疗、抑制和/或预防疾病或障碍方面有效的本文所述的组合物的量可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地采用体外测定以有助于鉴定最佳剂量范围。待在配制品中使用的精确剂量还可以取决于施用途径和疾病或障碍的严重程度，并且应根据从业者的判断和每名患者的情况来决定。可以从衍生自体外、动物模型测试系统或临床试验的剂量-应答曲线外推有效剂量。在非限制性实施方案中，施用GM-CSF分子以治疗帕金森氏病。
药理学特性
在一个方面，本文公开了改善GM-CSF的一种或多种药理学特性的方法。GM-CSF至少包括人、牛、大鼠和小鼠GM-CSF以及包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:77的至少约90％同一性的GM-CSF。所述方法可以包括产生GM-CSF分子，诸如包含连接至如本文公开的支架的GM-CSF肽的GM-CSF分子。药理学特性的示例可以包括但不限于半衰期、稳定性、溶解度、免疫原性、毒性、生物利用度、吸收、释放、分布、代谢和排泄。释放可以是指GM-CSF从药物配制品中释放的过程。吸收可以是指物质进入血液循环的过程。分布可以是指物质遍布身体的体液和组织的分散或散布。代谢(或生物转化，或失活)可以是指被存在外来物质的生物体的识别以及母体化合物向子代谢物的不可逆转化。排泄可以是指物质从身体的去除。
GM-CSF分子的半衰期可以是至少约5小时至约1000小时、至少约10小时至约1000小时、至少约15小时至约1000小时、至少约20小时至约1000小时、至少约25小时至约1000小时、至少约30小时至约1000小时、至少约40小时至约1000小时、至少约50小时至约1000小时、至少约60小时至约1000小时、至少约70小时至约1000小时、至少约80小时至约1000小时、至少约90小时至约1000小时、至少约100小时至约1000小时、至少约125小时至约1000小时、至少约150小时至约1000小时、至少约175小时至约1000小时、至少约200小时至约1000小时、至少约225小时至约1000小时、至少约250小时至约1000小时、至少约275小时至约1000小时、至少约300小时至约1000小时、至少约350小时至约1000小时、至少约400小时至约1000小时、至少约450小时至约1000小时或至少约500小时至约1000小时。在一些实施方案中，本文提供的GM-CSF分子的半衰期在约100小时与约500小时之间、约150小时与约500小时之间、约200小时与约500小时之间、约100小时与约400小时之间、约150小时与约400小时之间、约200小时与约400小时之间或约100小时与约300小时之间。例如，半衰期是约100、125、150、175、200、225、250、275或300小时。半衰期可以在人、大鼠或小鼠血液、血清和/或血浆中测量。可以使用本文实施例中提供的方法测量半衰期。可以在向对象施用GM-CSF分子之后测量半衰期。可以在将GM-CSF分子在从对象分离的生物样品中孵育之后测量半衰期。
包含支架的GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽(例如，沙格司亭)的半衰期大至少约2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、140倍、160倍、180倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍或500倍。GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽的半衰期大至少约50倍。GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽的半衰期大至少约100倍。GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽的半衰期大至少约200倍。GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽的半衰期大至少约300倍。GM-CSF分子的半衰期可以比单独GM-CSF肽的半衰期大至少约400倍。
试剂盒
本文进一步公开了试剂盒，其包含本文提供的一种或多种GM-CSF分子或其组合物。可以将GM-CSF分子以促进其用于实践本公开内容的方法的方式包装。例如，试剂盒包含包装在容器中的本文所述的GM-CSF分子，所述容器具有贴在容器上的标签或描述组合物在实践所述方法中的使用的包装插页。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以包含其中容纳有GM-CSF分子的容器。试剂盒可以进一步包含指示GM-CSF分子可以用于治疗特定病症的包装插页。可替代地或另外，试剂盒可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(例如，注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液)的第二(或第三)容器。它可以进一步包含从商业和使用者的角度来看所期望的其他材料，包括但不限于其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。GM-CSF分子可以以单位剂型形式包装。试剂盒可以进一步包含适于根据具体施用途径施用抗体融合蛋白的装置。试剂盒可以含有描述GM-CSF分子的使用的标签。
实施例
以下实施例中提供的活性数据通常使用在实施例中定义的并由所提供的SEQ ID例证的分子而获得。应理解，本文公开的任何分子的活性均可以增强或减弱，这取决于与一级序列无关的条件，例如表达和纯化条件。
实施例1：长效GM-CSF的产生
表达构建体：通过IDT(Coralville，IA)合成编码GM-CSF的基因，并且通过使用PfuUltra II DNA聚合酶(Agilent Technologies，CA)的聚合酶链反应扩增。还通过IDT合成编码帕利珠单抗(具有降低的RSV-F结合)和曲妥珠单抗的抗体重链和轻链连同接头的DNA片段，并且通过PCR扩增。使用Gibson组装主混合物(assembly Master Mix)(NewEngland Biolabs，MA)将融合体基因片段组装至pFuse骨架(Invivogen，CA)中。通过DNA测序(GENEWIZ，CA)确认所得哺乳动物表达载体的序列。以此方式产生表1中的编码融合体的构建体。图7提供了各种长效GM-CSF分子的Fab结构域的示意图，其中GM-CSF位于IgG支架的氨基末端或CDR处以产生IgG融合体。
长效GM-CSF分子的重链包含人IgG1重链恒定区，所述重链恒定区具有突变(E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S)以降低补体依赖性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
表达和纯化：通过在HEK 293F细胞(Life Technologies，CA)中瞬时转染来根据表1共表达含有每种GM-CSF分子的重链和轻链的基因。将HEK293F细胞在含有FreeStyle培养基(Life Technologies，CA)的摇瓶中培养，并且在125rpm、37℃下、在5％ CO2下振荡。对于转染，将293F细胞生长至100万个细胞/mL的密度，并且根据制造商的说明书用轻链、重链质粒和293fectin以1:2:6的比率转染。在转染后第5天收获表达培养基以收集分泌的蛋白。将融合抗体通过蛋白A色谱法(Thermo Fisher，IL)纯化并且通过SDS-PAGE和质谱分析进行分析。
表1.长效GM-CSF分子
Figure BDA0003886481550000761
对由七点突变引起的Fc无效的确认：为了确认蛋白融合体的Fc中的七个点突变可以显著降低由Fcγ受体相互作用介导的不期望的ADCC和CDC效应，将包含位于抗体重链CDR3内的治疗性肽(INVKCSLPQQCIKPCKDAGMRFGKCMNKKCRCYS，SEQ ID NO:77)的抗体与THP-1(一种具有Fcγ受体的高表达的人单核细胞系)一起孵育，所述抗体重链CDR3具有用AlexaFluor 488标记的突变型Fc(SEQ ID NO:25，Fc无效)或野生型IgG1 Fc。Fc无效抗体融合体在高达100nM的浓度下未结合THP-1，而具有野生型IgG1 Fc的抗体融合体在低至1nM的浓度下显著结合THP-1。
实施例2：长效GM-CSF分子的表征和体外活性
在TF-1增殖测定中对实施例1中产生的GM-CSF分子的生物活性进行了测定。将TF-1人白细胞(ATCC，CRL-2003)在37℃下在5％ CO2下在补充有10％胎牛血清(FBS)的ATCC配制品RPM1640培养基中培养。对于增殖测定，将细胞用PBS洗涤5次以去除FBS。将GM-CSF融合体或商业GM-CSF标准品(R&D systems)添加至96孔板中的细胞，密度为5,000个细胞/孔，在150uL具有2％ FBS的RPM1640培养基中。在72小时的孵育之后，将15uL AlamarBlue(Invitrogen，DAL1025)添加至每个孔，并且在37℃下在5％ CO2下孵育4小时之后测量565/595nm下的荧光信号。相应数据示出于图6A-图6B和表2中。
表2.长效GM-CSF分子的表征
Figure BDA0003886481550000771
Figure BDA0003886481550000781
实施例3：长效GM-CSF在大鼠中的药代动力学(PK)、药效动力学(PD)和体内功效
在大鼠中的药代动力学测定：将长效GM-CSF蛋白的样品以10mg/kg的单剂量静脉内注射至Sprague-Dawley大鼠中，或者以3mg/kg或10mg/kg腹膜内注射至小鼠中。在各个时间点抽取血液样品。将样品储存在肝素化收集管中、旋转沉降并且储存在-80℃下，直到进一步处理。在解冻和适当稀释样品之后，通过ELISA定量每个血液样品中抗体的量。通过PK建模程序(WinNonlin，Certara，NJ)分析数据以确定药代动力学参数。使用表1的分子进行实验，其中数据呈现于图8A-图8B和表3中。图8A示出了大鼠血浆中Syn-hGMCSF CDR和Her-hGMCSF CDR随时间的浓度。图8B示出了小鼠血浆中Syn-mGMCSF CDR和Syn-mGMCSF NT(N末端HC融合体)随时间的浓度。Syn-hGMCSF CDR和Her-hGMCSF CDR相比于重组GM-CSF表现出半衰期延长(t1/2是约200h相比于沙格司亭t1/2<0.5h)。hGMCSF CDR融合体表现出2,481nM的Cmax和63,257的AUC∞(小时*nM)。
Treg测定：图9显示用Syn-mGMCSF CDR(示出为Syn-GMCSF)亚长期治疗显著增加小鼠中的Treg扩增。图10显示单一长效GM-CSF Her-hGMCSF CDR增加Treg扩增长达14天。
食蟹猴PK/PD测定：将Her-hGMCSF CDR的样品以1mg/kg(IV)、5-10mg/kg(IV)或5-10mg/kg(SC)的单剂量静脉内(IV)或皮下(SC)注射至食蟹猴(n＝4，约3kg，2-5岁龄)中。对于血浆PK，收集13个时间点：给药前、10min(对于SC＝30min)、1小时、3小时、10小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、240小时、336小时和504小时。在以下6个时间点收集血液样品用于流式细胞术：给药前、72小时、120小时、240小时、336小时和504小时。不存在明显的消极临床征象。如图11中所示，Her-hGMCSF CDR剂量依赖性增加循环Treg，在第8天具有峰值Treg增加，并且在5mg/kg治疗组中具有高达20倍增加。
体内功效：在实施例4中进一步描述测定。
小鼠中的脑暴露：长效GMCSF(Her-hGMCSF CDR和Her-mGMCSF CDR)主动转运至小鼠的脑中，如图12中所示。将长效GM-CSF蛋白的样品以10mg/kg的单剂量静脉内注射至CD1小鼠(n＝4，雌性，12周龄)中。在给药后3小时收获脑组织。将脑样品在干冰上粉碎并且转移至预负载有1.4mm陶瓷珠的匀浆管中。将组织在补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。在4℃下以1,7000g旋转30min之后，收集上清液并且测量蛋白质浓度。对于ELISA测定，将板在37℃下用2.5μg/mL抗人IgG Fc抗体包被2小时，随后进行洗涤并且用在0.5％ PBST中的2％脱脂乳封闭1小时。在添加标准蛋白质和稀释样品之后，将板在4℃下孵育过夜并且用0.5％ PBST洗涤。然后，将1μg/mL抗人或小鼠GMCSF抗体添加至孔，并且在室温下孵育2小时。在洗涤之后，添加0.5μg/mL HRP连接的抗小鼠IgG抗体，随后在室温下孵育1小时。将预温热的TMB底物添加至孔，并且在室温下在黑暗中孵育10min。通过酶标仪测量450nM下的吸光度。
表3.长效GM-CSF的药代动力学、药效动力学和体内功效
Figure BDA0003886481550000801
n/a-未评价
实施例4：长效GM-CSF的神经保护和抗炎能力
帕金森氏病(PD)的特征在于多巴胺能神经元沿黑质纹状体轴的损失。免疫功能障碍和神经炎症与疾病进展和神经元损失相关联。PD中功能障碍的先天免疫与增加的促炎细胞因子产生、小胶质细胞增生、活性氧水平和神经毒素(所有这些都具有影响神经元细胞死亡的能力)相关联。同样，PD中适应性免疫应答的功能障碍包括降低的CD4+T细胞水平、效应记忆T细胞的存在和调节性T细胞(Treg)的降低水平以及Th1和Th17 T效应T细胞(Teff)的增加频率。不受理论的约束，这些免疫改变可能促成疾病的发病。在肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默氏病(AD)和克罗恩氏病(CD)中已经观察到类似的适应性免疫失常，这表明Treg在抑制炎症方面的关键作用。
在小鼠中用长效GM-CSF治疗后，通过流式细胞术分析确定全血分析和血液化学概况。在帕金森氏病的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)模型中评估长效GM-CSF的神经保护和抗炎能力。用长效GM-CSF治疗导致Treg诱导和增强的Treg免疫抑制功能。
长效GM-CSF组合物的使用在外周内引起神经保护免疫转化。所观察到的表型偏移和神经保护应答大于在重组GM-CSF(rGM-CSF)的情况下观察到的，这表明长效GM-CSF可作为用于治疗PD和其他神经退行性疾病的候选物。
方法
动物、抗体GM-CSF治疗和MPTP中毒
雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄)获自Jackson Laboratories。在适应之后，向小鼠腹膜内注射(i.p.)长效GM-CSF Her-mGMCSF CDR(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56)。对于剂量应答研究，以范围为0mg/kg-30.0mg/kg的剂量向小鼠注射单次注射。对于rGM-CSF(重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)蛋白注射，在处死或MPTP中毒前以0.1mg/kg的剂量向小鼠施用单次注射(1X)或5次每日注射(5X)。对于神经保护实验，向小鼠注射媒介物(DPBS，10ml/kg体重)或获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的重构于PBS中的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP-HCl)。小鼠接受MPTP-HCl(16mg/kg，MPTP游离碱)的4次皮下注射；一次注射以2小时为间隔。根据MPTP安全性和操作方案进行MPTP安全措施。在MPTP中毒后第2和7天，处死小鼠，并且收获脑用于处理。将所有动物根据国立卫生研究院机构指南(NationalInstitutes of Health Institutional guidelines)饲养和维持，并且由内布拉斯加大学医学中心的机构动物护理和使用委员会(IACUC)(Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)of the University of Nebraska Medical Center)批准。
灌注和免疫组织化学
在处于末期麻醉(Fatal Plus，戊巴比妥)时，经由心脏穿刺向小鼠灌注DPBS、随后是DPBS中的4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)。在灌注后，收获整个脑并且进行处理以评估黑质和纹状体中的多巴胺能神经元存活率。将冷冻的中脑切片切割为30μm，用抗酪氨酸羟化酶(TH)(抗TH，1:2000，EMD Millipore)免疫染色，并且复染Nissl物质。为了评估多巴胺能末梢，还用抗TH(1:1000，EMD Millipore)标记纹状体切片。对于小胶质细胞标记，用抗巨噬细胞抗原复合物-1(Mac-1)(抗CD11b，1:1000，AbD Serotech)免疫染色中脑切片。为了可视化所有抗体标记组织，将切片在链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)溶液(ABC Elite载体试剂盒，Vector Laboratories)中孵育，使用葡萄糖氧化酶颜色生成系统生成颜色并且与二氨基联苯胺(DAB)色原体(ACROS Organics)一起孵育以进行可视化。在SN内，在光学分馏模块(MBF Bioscience)下使用Stereo Investigator软件通过体视学分析来估计Mac-1+细胞、TH+Nissl+(多巴胺能神经元)和TH-Nissl+(非多巴胺能神经元)的总数量。使用Image J软件(国立卫生研究院)确定纹状体中多巴胺能神经元末梢的密度计量学分析。
CD4+ T细胞分离
在施用单剂量的Her-mGMCSF CDR或5个剂量的rGM-CSF后五天，处死供体小鼠并且从脾脏获得单细胞悬浮液。对于基因组学研究，根据制造商的说明书使用EasySep小鼠CD4+T细胞分离试剂盒(StemCell)分离总CD4+细胞。对于增殖测定，根据制造商的说明书使用EasySep小鼠CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒II(StemCell)从脾脏分离CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-常规应答T细胞(Tresp)。分离的细胞纯度经由流式细胞术分析评估，并且对于所有分离确定为>90％。
流式细胞术评估
在治疗后五天，收集全血和脾脏以经由流式细胞术分析确定T细胞和B细胞概况。使用针对CD3、CD4、CD25、CD8、CD19的细胞外标记物和FoxP3的细胞内标记物的抗体荧光标记全血(50μl)和脾细胞(1x 106)。用PerCP-Cy5.5-抗CD3(eBioscience)、PE-Cy7-抗CD4(eBioscience)、PE-抗CD25(eBioscience)、FITC-抗CD8(eBioscience)和PE-抗CD19(eBioscience)标记小鼠血液和脾细胞。对于细胞内染色，使用FoxP3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience)在4℃下将细胞透化45min。然后用APC-抗FoxP3(eBioscience)标记细胞，随后进行固定。用LSRII流式细胞仪和FACSDiva软件(BD Biosciences，San Jose，CA)分析样品。所有细胞频率从总淋巴细胞群体确定。
血液化学和外周血评估
在处死时，将250μl全血收集至用于全血计数(CBC)水平的K2EDTA血液收集管中或用于血液化学和代谢物水平的肝素化血液收集管中。在分离后，离心肝素化血液并且收集血浆。使用VetScan化学综合测试卡盒(Abaxis)在VetScan VS2机器上进行完全代谢面板。对于CBC分析，立即在VetScan HM5机器上测定从K2EDTA管收集的全血。
统计分析
所有值表示为平均值±SEM。使用ANOVA和随后的Newman-Keuls事后检验(GraphPad Software,Inc.，La Jolla，CA)分析组间平均值的差异。使用线性回归评价CFSE抑制测定的斜率和高度的比较。所有线的斜率显著是非零的，并且线性回归分析值表示在相应图表上或注释在图例中。
结果
长效GM-CSF治疗显著增加血液和脾脏中的CD4+CD25+FoxP3+水平并且增强免疫抑 制功能。
外周血中淋巴细胞群体的流式细胞术分析揭示，Her-mGMCSF CDR治疗未影响CD8+水平(图1A)。然而，CD4+水平显著降低(图1B)。相比之下，仅用30.0mg/kg Her-mGMCSF CDR的治疗相比于对照水平显著增加CD4+CD25+Foxp3+细胞频率(图1C)。用增加给药的rGM-CSF治疗未改变CD8+或CD4+水平(图1D和图1E)，但确实导致不显著的CD4+CD25+FoxP3水平的中度升高(图1F)。在用Her-mGMCSF CDR治疗后对脾淋巴细胞群体的流式细胞术分析揭示稍微不同的结果。Her-mGMCSF CDR治疗在3.0mg/kg、10.0mg/kg和30.0mg/kg治疗的情况下导致CD8+水平的显著降低(图1G)，而CD4+水平无显著变化(图1H)。还观察到CD4+CD25+FoxP3+水平的剂量依赖性增加(R2＝0.72，p＝0.0337)(图1I)。与血液观察结果类似，rGM-CSF治疗未改变CD8或CD4水平(图1J和图1K)，但也导致CD4+CD25+FoxP3+水平的剂量依赖性增加(R2＝0.78，p＝0.0197)(图1L)。
在MPTP中毒小鼠中长效GM-CSF预治疗减弱小胶质细胞增生并且是神经保护性的。
在Treg诱导评估后，通过定量反应性小胶质细胞的水平来评估Her-mGMCSF CDR治疗减弱与MPTP中毒相关联的神经炎性应答的能力。MPTP中毒后两天，在用Her-mGMCSF CDR或rGM-CSF预治疗之后，在峰值炎症时收获前侧中脑。通过具有变形虫样形态的Mac-1+小胶质细胞的存在评估反应性(图2)。相比于PBS对照，MPTP中毒将反应性小胶质细胞计数从4±0.8个细胞/mm2显著升高至70±6.4个细胞/mm2(图2)。相比于单独MPTP中毒，用Her-mGMCSFCDR治疗将反应性小胶质细胞计数显著降低至47±4个细胞/mm2(对于1.0mg/kg)、49±5.5个细胞/mm2(对于3.0mg/kg)、46±6.8个细胞/mm2(对于5.0mg/kg)和33±3.6个细胞/mm2(对于10.0mg/kg)。用0.1mg/kg rGM-CSF治疗还通过将计数减少至46±5.6个细胞/mm2来减弱神经炎性应答。
评估了Her-mGMCSF CDR预治疗在MPTP小鼠模型中的神经保护能力(图3)。在MPTP中毒后，相比于PBS对照，多巴胺能神经元数量从9313±418显著下降至4873±211(图3)。用0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg或3.0mg/kg的单剂量的Her-mGMCSF CDR预治疗未提供显著的神经元存活率，在治疗之后产生3891±248、3631±364、5104±488和5089±378个神经元。然而，相比于单独MPTP中毒，用5.0mg/kg和10.0mg/kg Her-mGMCSF CDR治疗导致显著的神经保护，分别产生81％和76％神经元保留。相比之下，用5个连续剂量的0.1mg/kg rGM-CSF治疗也显著保留多巴胺能神经元数量，分别将存活率从45％增加至78％。然而，使用0.1mg/kg rGM-CSF的单次注射未导致神经保护，这指明当利用非长效rGM-CSF时需要连续给药。还通过TH+末梢的免疫组织化学评估纹状体末梢存活率。数字图像分析指明，相比于PBS治疗的对照，用MPTP治疗显著减小纹状体末梢密度(图4)。用1.0mg/kg、20.0mg/kg和25.0mg/kg Her-mGMCSF CDR预治疗中度避免了纹状体末梢减少；然而，水平仍显著低于PBS对照。用所有其他剂量的治疗(包括Her-mGMCSF CDR和rGM-CSF)未保护纹状体末梢，这支持纹状体多巴胺能末梢的易感性增加的观点。
评估了Her-mGMCSF CDR的单次注射的长效治疗性潜力。将小鼠MPTP中毒并且在中毒后两天或七天处死以评估炎性应答和多巴胺能神经元存活率(图5A和图5B)。单独MPTP中毒导致前侧中脑内反应性Mac-1+小胶质细胞的数量显著增加(图5A)。在MPTP中毒前15天用Her-mGMCSF CDR治疗未减弱所观察到的小胶质细胞增生。在之前10天或5天用Her-mGMCSFCDR治疗使反应性小胶质细胞数量从113±7个细胞/mm2显著下降至69±9和38±10个细胞/mm2。类似地，MPTP中毒使TH+/Nissl+多巴胺能神经元计数从8418±130显著减少至6252±292(图5B)。然而，在MPTP中毒前5天仅Her-mGMCSF CDR治疗导致显著的神经元保留，使神经元计数回到对照水平。总之，这些发现指示多达10天的潜在Her-mGMCSF CDR治疗性治疗持续时间。
这些实验显示，外周Her-mGMCSF CDR治疗增加Treg频率和活性，减弱神经炎性应答并且选择性地减轻MPTP诱导的神经毒性。
长效GM-CSF治疗导致抗炎性CD4+ T细胞表型。
检查了用10mg/kg Her-mGMCSF CDR的治疗对外周适应性免疫群体、具体地CD4+T细胞的影响。在用Her-mGMCSF CDR治疗之后对CD4+T细胞的转录组学分析导致与T细胞分化相关联的多种基因的显著失调(归一化至PBS治疗对照)。相比之下，当归一化至PBS对照时，用0.1mg/kg rGM-CSF治疗仅产生基因表达的较小倍数变化。
长效GM-CSF针对神经炎性疾病的用途
GM-CSF治疗基于其已知抗炎能力和诱导Treg群体的能力而具有改良神经炎性疾病的潜力。然而，临床转化的障碍是其相对短的半衰期和有限的生物利用度。在此呈现的实施例表征了长效GM-CSF配制品Her-mGMCSF CDR的神经保护潜力。
用Her-mGMCSF CDR治疗导致在单次注射之后Treg数量的剂量依赖性增加(其可以持续多达10天)并且还导致外周血和脾脏内的细胞功能增加高于在rGM-CSF治疗的情况下观察到的那些。在单次注射后Treg数量的升高还延长至注射后的14天，这支持其长效免疫调节潜力。同样，从Her-mGMCSF CDR治疗的小鼠分离的Treg显示出增加的抗增殖作用并且与从rGM-CSF治疗的动物分离的Treg相比能够在更大程度上抑制应答T细胞(Tresp)增殖。
rGM-CSF的每日给药在神经退行性疾病的模型中具有增加神经元存活率和减少小胶质细胞增生的潜力。在Her-mGMCSF CDR的长效性质内，使用单次注射方案实现MPTP小鼠模型中神经保护的几乎相同水平。在MPTP病变小鼠中用Her-mGMCSF CDR治疗显著保留多巴胺能神经元细胞体以及它们向纹状体中的突出。Her-mGMCSF CDR治疗还导致大于单独rGM-CSF治疗的抗炎应答，如通过病变位点内小胶质细胞增生减少所指示的。所产生的反应性小胶质细胞群体的减少可以归因于在Her-mGMCSF CDR治疗后总体CD4+T细胞群体中观察到的总体抗炎表型偏移。MPTP中毒通常导致因神经毒素本身的约10％神经元死亡。然而，对于MPTP诱导的病变要进展和表现，需要CD4+T细胞来维持脑内的炎性微环境。在MPTP中毒后，CD4+T细胞跨过血脑屏障(BBB)，与小胶质细胞相互作用，偏移其表型并且增强促炎和神经毒性介体的产生。
实施例中进行的实验证明，本文所述的长效GM-CSF分子可以提供减少的给药频率和增加的GM-CSF生物利用度。Her-mGMCSF CDR治疗选择性地诱导超过2倍的Treg群体并且增强Treg免疫抑制和抗炎细胞功能。Her-mGMCSF CDR治疗在MPTP中毒后保留SN内的多巴胺能神经元并且减少相应的免疫介导的炎性应答。小胶质细胞增生的减少和所产生神经保护与Her-mGMCSF CDR治疗所提供的抗炎性和调节性T细胞表型有关联。连同其稳健的神经保护和抗炎概况，所有所产生的积极变化使用单剂量的Her-mGMCSF CDR而不是五个连续剂量来实现，这支持长效GM-CSF治疗在转化上有吸引力并且在临床上有益于PD治疗的观点。
缩写列表：AD－阿尔茨海默氏病、ALS－肌萎缩性侧索硬化症、CFSE－5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺基酯、DAB－3,3′-二氨基联苯胺、DPBS－杜氏(Dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水、GM-CSF－粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、HRP－辣根过氧化物酶、IPA－独创性通路分析、MPTP－1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、PBS－磷酸盐缓冲盐水、PD－帕金森氏病、rGM-CSF－重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、RT-PCR－逆转录聚合酶链反应、SEM－平均值的标准误差、TBI－创伤性脑损伤、TH－酪氨酸羟化酶、UPDRS－统一帕金森氏病评定量表。
实施例5：帕金森氏病临床试验
对健康对象和患有帕金森氏病的对象进行来自表1的长效GM-CSF(例如，Her-hGMCSF CDR、Syn-hGMCSF CDR)的随机化、双盲、安慰剂对照、单一/多个递增剂量研究。
纳入标准：
适应症：接受PD药物相比于消除期的特发性帕金森氏病(中度特发性PD－Hoehn和Yahr 1-3伴有运动过慢加另一PD体征(静止性震颤或僵硬)。
健康对象相比于帕金森氏病患者：Ph1a：健康->Ph1b PD患者或Ph1a/b：PD患者。
每组对象数量(10)，6个递增剂量群组并随机分配以接受长效GM-CSF或安慰剂。
治疗持续时间(8周导入期，8-26周治疗)，每2-4周施用长效GM-CSF或安慰剂并且在观察期期间监测。
排除标准：异常MRI、显著的实验室异常。
终点：
安全性和耐受性评估：体格和神经系统检查、实验室测试、生命体征和不良事件。
药代动力学参数(血清和CSF)：最大长效GM-CSF浓度、曲线下面积和半衰期。
药效动力学：Treg、WBC、运动控制和运动性改善、UPDRS评分。
免疫原性(ADA)。
实施例6：骨髓移植临床试验
在自体或同种异体骨髓或外周血祖细胞(PBPC)移植之后用安慰剂或本文例示的GM-CSF分子治疗对象。儿科和成人患者接受GM-CSF分子或安慰剂的每两周一次静脉内输注，持续30天。
实施例7：在小鼠模型中用长效GM-CSF治疗ALS
先前实验已证明，ALS的SOD1小鼠模型对疗法在人体内的成功有预测性(Cleveland和Rothstein(2001),Nat Rev Neurosci,2,806-19)。此类分析中的主要终点是运动体征的发作和死亡两者。例如，运动体征的发作可以定义为小鼠不能在速度为20rpm的转棒仪上保持7min的第一天(Li等人(2000),Science,288,335-9)。死亡评分为死亡日，或缺陷如此严重以致于必须处死小鼠(例如，无欲貌且无法自我纠正)的日期。通过测量运动强度(通过抓握强度测试)、脊髓中运动神经元的计数、神经厚度(例如，坐骨神经、膈神经)以及脊髓运动神经元中细胞凋亡染色的存在来确定另外的参数。将表1的GM-CSF分子以预定剂量，例如以60ug/kg体重/天经由渗透泵输注至脑室中。可替代地，以60ug/kg体重/天的剂量或更高剂量经由i.v.或i.p.注射给予GM-CSF分子。在SOD1 G93A突变体的较晚症状发生前阶段在第60天开始治疗。在非治疗家族性ALS小鼠中，在12-14周龄显现运动损害，而在20周龄之前未观察到瘫痪。寿命期望值是140-170天。对小鼠监测到有效治疗，包括相比于对照组延长寿命超过15％(Cleveland和Rothstein(2001),Nat.Rev.Neurosci.,2,806-19)。作为治疗的对照组，使用媒介物和zVADfmk(一种在此模型中已显示出功效的有效半胱天冬酶抑制剂)两者治疗的动物。每个组各自包括10只动物。
实施例8：用于治疗ALS的长效GM-CSF
用表1的GM-CSF分子治疗ALS患者并且监测其运动功能的改善。
实施例9：用长效GM-CSF治疗急性辐射综合征
在放射之后向小鼠施用表1的GM-CSF分子以证明增加辐射暴露之后的存活率的功效。
简而言之，将小家鼠(mus musculus)/C57BL/6小鼠用于这些研究。LD50/30是预期在30天内引起暴露群体的50％死亡的辐射剂量。LD 70/30是预期在30天内引起暴露群体的70％死亡的辐射剂量。等同于LD50/30或LD70/30的辐射剂量作为γ辐射的单一均匀总体剂量递送。在不同剂量的GM-CSF和不同剂量的辐射下测试GM-CSF分子或对照(媒介物)增加30天存活率的功效。监测小鼠的存活率，直到第30天。研究的终点包括30天总体存活率、平均存活时间(MST)和全血计数(CBC)分析。增加的CBC可以指示GM-CSF治疗小鼠相比于未用GM-CSF治疗的对照小鼠的造血恢复加速。重复此实验以确定在辐射暴露前GM-CSF分子的施用是否将改善存活率。
进行与在此所述的实验类似的实验以确定在致死放射后的其他动物物种诸如狗和猴中表1的分子的施用是否改善存活率并且加速造血恢复。辐射剂量可以确定为对应于LD50至LD70剂量。可以在放射后的30-60天内跟踪存活率。可以调整蛋白质的给药频率和/或剂量以反映物种之间分子的清除率的差异。可以确定每种分子的最佳剂量和给药方案。
实施例10：用长效GM-CSF治疗辐射毒性
在辐射疗法之前、在辐射疗法期间或在辐射疗法之后用表1的GM-CSF分子治疗经受辐射疗法的患者。在辐射疗法后监测患者细胞损伤的减少。
实施例10：用于治疗癌症的长效GM-CSF
用表1的GM-CSF分子治疗被诊断为患有癌症的患者。监测患者的肿瘤生长的延迟和肿瘤大小减小。
实施例11：在小鼠模型中用长效GM-CSF治疗阿尔茨海默氏病
用表1的GM-CSF分子治疗小鼠。确定未治疗小鼠相比于治疗组是否显示出损害。
用于评价短期记忆的放射臂水迷宫(RAWM)
基本上如(Arendash等人(2001)；Ethell等人(2006)；Arendash等人(2007))所述进行实验。
简而言之，将铝插入物置于圆形池中以产生从中心圆形游泳面积散发的6个放射状分布的游泳臂。2-D和3-D视觉提示的分配围绕池。在治疗测试前8天和治疗测试后4天内以5次试验/天确定在定位6个游泳臂中含有被浸没的逃逸平台的那一个之前的错误数。在每次试验(最大60s)期间，在游到不正确臂中时使小鼠返回至该试验的起始臂，并且记录定位被浸没的平台所需的秒数。如果小鼠在60-s试验内未找到平台，则引导其至平台以停留30-s。错误数和逃逸等待时间两者均视为工作记忆的指标，并且在时间上类似于临床上用于评价AD患者的具体项目的标准登记/回忆测试。
认知干扰任务
如(Loewenstein等人(2004))所述进行实验。
在治疗后完成RAWM测试(4天)后，在新颖的认知干扰任务中进一步评价所有小鼠，持续6天。此任务涉及在两个不同房间中的两个放射臂水迷宫装置以及3组不同的视觉提示。所述任务需要动物记住一组视觉提示，使得在用一组不同的提示干扰后，可以回忆初始组的提示以成功解决放射臂水迷宫任务。
实施例12：用长效GM-CSF治疗阿尔茨海默氏病
用于评估表1的GM-CSF分子在治疗由于AD而具有轻度认知损害的患者方面的安全性和功效的临床试验。
将表1的GM-CSF分子或安慰剂施用至对象，长达24周。施用氟贝他吡(Florbetapir)用于PET扫描以检查基线脑成像病变和治疗中的变化。
主要结局量度：如通过使用氟贝他吡F18(Amyvid)的PET所测量的标准化摄取值比相对于基线的变化[时间框：从基线至第24周]
次要结局量度：经历治疗突发性不良事件(TEAE)的患者数量[时间框：第24周]；CSF分析相对于基线的变化[时间框：在第1天的第一注射之前以充当任何所需随访的基线，以及在第155天的任选评估]；用于评估淀粉样蛋白相关成像异常(ARIA)的MRI[时间框：在筛选时和在第43天、85天和155天]；抗药抗体水平的测量[时间框：在第1天、29天、57天、85天和155天]
纳入标准：
具有由于根据国立衰老研究所阿尔茨海默氏病协会(National Institutes ofAging Alzheimer's Association)(NIA-AA)标准(中等或高可能性)、具有偶发性或家族性遗传模式的AD的MCI诊断的≥40岁且≤80岁男性和女性。轻度认知损害AD定义为：关于与人的先前水平相比的认知变化(在过去一年期间超过6个月的记忆抱怨主诉/主观记忆减退和/或由信息提供者和/或临床医生确认)的具有意义的证据；和通过阿尔茨海默氏病评估量表-认知子量表(ADAS-cog)的延迟回忆部分的错误评分记录的客观记忆功能损害相对于年龄分层平均值(即年龄55-69岁：≥6次错误，年龄70-74岁：≥7次错误，年龄75+岁：≥8次错误)≥1.5标准偏差(SD)，但在研究人员看来，没有日常生活活动(ADL)的一种或多种明确损害，如通过针对MCI改编的阿尔茨海默氏病协作研究(ADCS)ADL评估的；以及根据产品标签通过定性评估通过使用氟贝他吡F18(Amyvid)(一种阳性扫描)的正电子发射断层显像(PET)测量的皮质淀粉样蛋白升高的证据。
具有专用伙伴/护理人员信息提供者，其可以协助患者进行研究程序和施用研究药物，并且每周至少12小时在患者的陪同下。
愿意并能够提供签署的知情同意。
排除标准：
用研究性抗淀粉样蛋白疗法治疗史。
禁忌腰椎穿刺或禁忌或无法完成磁共振成像(MRI)或者过去或计划具有对电离辐射的暴露，所述暴露连同由施用此研究中使用的PET示踪剂产生的辐射超过对每年或终生暴露的适用机构、本地或国家推荐。
改良型Hachinski缺血评分>4。
可能损害认知的其他神经系统或精神病学病症(除AD之外)；或潜在显著的与AD无关的颅内异常的计算机断层扫描(CT)/MRI证据(例如，大卒中或认知关键区域中的腔隙、感染、癌症、脑积水、多发性硬化症等的证据)；或不符合AD的异常脑脊液(CSF)。
>4处微出血的MRI证据：可能有自发性淀粉样蛋白相关成像异常(ARIA-H)的倾向和/或可能更易发生ARIA-H的不良作用的患者。
在研究人员看来可能干扰研究评估或在研究进行期间可能需要免疫刺激、免疫抑制或者一种或多种免疫调节治疗(例如，免疫球蛋白、治疗性疫苗、细胞因子、抗细胞因子单克隆抗体)的未治疗的或不稳定的医学病症。无脾、脾功能减退(hyposplenia)或脾切除(无论手术原因如何)病史。
根据精神障碍诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual ofPsychiatric Disorders)，第IV版，文本修订版(DSM-IV-TR)或DSM-V的当前情绪或焦虑障碍、和/或精神障碍、和/或物质相关障碍；或由研究人员评估视为自杀性的或显示出自杀意念。
指示可能增加风险或干扰研究评估的未治疗的医学或血液病症的实验室异常，所述未治疗的医学或血液病症包括未治疗的甲状腺机能减退或甲状腺机能亢进、维生素B12缺乏症、高白细胞性综合征(包括但不限于慢性骨髓性白血病、霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)、单克隆丙种球蛋白病和血小板增多症。
已知的肾功能障碍或血清肌酐>150μmol/L。
已知的肝功能障碍(除了吉尔伯特综合征(Gilbert's syndrome))或血清丙氨酸转氨酶(ALT)≥3倍正常上限(ULN)。
妊娠或母乳喂养女性。
药物过敏的存在或病史；或已知对沙格司亭、酵母衍生产品、产品的任何其他组分或苯甲醇(存在于抑菌水或输液用盐水中)过敏。
液体潴留的证据(临床或放射性)、呼吸道症状(例如，呼吸困难)、心血管症状或需要治疗干预的心脏病的心电图证据(例如，室上性心律失常)。
深静脉血栓(DVT)或肺栓塞病史，或者DVT或肺栓塞的家族倾向。
具有生育潜能且未受到高效节育避孕方法保护(即，口服或长效避孕药或宫内节育器[IUD]或对象接受了手术绝育)和/或不愿意或不能进行怀孕测试；或者怀孕或哺乳的妇女和女性伴侣。
之前60天内或该药物消除半衰期的5倍内(以最长者为准)研究药物的接收者。
乳胶过敏或酵母过敏史。
任何以下患者：
在研究期间可能不遵守规定、离开所述区域或与指定的护理人员/信息提供者分开超过3天，
因语言问题或智力发育不良而无法合作，或
监督或实施所述研究的任何方面。
前述内容仅说明本公开内容的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本公开内容的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。另外，意图在于此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本公开内容的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本公开内容的范围和精神由所附权利要求体现。
表4.抗体序列
Figure BDA0003886481550000941
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Claims (203)

1.一种组合物，其包含含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的第一多肽和含有与SEQ ID NO:2至少98％相同的序列的第二多肽。
2.如权利要求1所述的组合物，其中GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述GM-CSF包含人GM-CSF或鼠GM-CSF。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含抗体可变区的经修饰的轻链。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述抗体可变结构域的所述经修饰的轻链包含位于所述抗体可变区的第一氨基酸序列与所述抗体可变区的第二氨基酸序列之间的GM-CSF。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO:14至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:14。
8.如权利要求5-7中任一项所述的组合物，其中所述第二氨基酸序列包含与SEQ IDNO:15至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:15。
10.如权利要求4-9中任一项所述的组合物，其中所述GM-CSF位于所述经修饰的轻链的互补决定区(CDR)内。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述GM-CSF位于轻链CDR1、CDR2或CDR3内。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述GM-CSF位于轻链CDR3内。
13.如权利要求4-12中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的轻链是由包含SEQ IDNO:17的可变轻链修饰而成的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽进一步包含第一接头肽。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ ID NO:10。
16.如权利要求14或权利要求15所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ ID NO:8。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ ID NO:11。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述第一接头肽包含与SEQ ID NO:12至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽进一步包含第二接头肽。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ ID NO:10。
21.如权利要求19或权利要求20所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ ID NO:9。
22.如权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ ID NO:11。
23.如权利要求19-22中任一项所述的组合物，其中所述第二接头肽包含与SEQ ID NO:13至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含抗体可变区的重链。
29.如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:2。
30.如权利要求1-29中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含与SEQ IDNO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
32.如权利要求1-31中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽经由一个或多个二硫键连接。
33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽形成抗体可变结构域。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述抗体可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的平衡解离常数(KD)与抗原结合。
35.如权利要求33或权利要求34所述的组合物，其中所述抗体可变结构域包含经修饰的帕利珠单抗可变结构域。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:19的重链CDR1。
37.如权利要求35或权利要求36所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:20的重链CDR2。
38.如权利要求35-37中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:21的重链CDR3。
39.如权利要求35-38中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:22的轻链CDR1。
40.如权利要求35-39中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:23的轻链CDR2。
41.如权利要求35-40中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:16的轻链CDR3。
42.如权利要求35-41中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的帕利珠单抗可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的KD与呼吸道合胞病毒(RSV)结合。
43.如权利要求1-42中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
45.如权利要求43或权利要求44所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
46.如权利要求43-45中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
47.如权利要求1-46中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽进一步包含与SEQ IDNO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述第一多肽包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
48.一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含含有与SEQ ID NO:6至少约90％相同的序列的第一多肽，所述重链序列包含含有与SEQID NO:2至少约90％相同的序列的第二多肽。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:6至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
50.如权利要求48或权利要求49所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
51.如权利要求48-50中任一项所述的组合物，其包含GM-CSF。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。
53.如权利要求51或权利要求52所述的组合物，其中GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
54.如权利要求48-53中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
55.如权利要求48-54中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
56.如权利要求48-55中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
57.如权利要求48-56中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
58.如权利要求48-57中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
60.如权利要求58或权利要求59所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
61.如权利要求58-60中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
62.如权利要求48-61中任一项所述的组合物，其中所述重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述重链包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
63.一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含与SEQ ID NO:26(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGS[X1]PFTFGGGTKLEIKR)至少约90％相同的序列，其中所述轻链序列包含X1并且X1包含GM-CSF；所述重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约90％相同的序列。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。
65.如权利要求63或权利要求64所述的组合物，其中所述GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
66.如权利要求63-65中任一项所述的组合物，其中所述轻链序列包含与SEQ ID NO:26至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
67.如权利要求63-66中任一项所述的组合物，其中所述轻链序列包含与SEQ ID NO:27(DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[X2]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGPFTFGGGTKLEIKR)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中所述轻链序列包含X2并且X2包含所述GM-CSF。
68.如权利要求63-67中任一项所述的组合物，其中所述重链序列包含与SEQ ID NO:2至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
69.如权利要求63-68中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
70.如权利要求63-69中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:5至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
71.如权利要求63-70中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
72.如权利要求63-71中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
73.如权利要求63-72中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
75.如权利要求73或权利要求74所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
76.如权利要求73-75中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
77.如权利要求63-76中任一项所述的组合物，其中所述重链进一步包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述重链包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
78.一种组合物，其包含与SEQ ID NO:18至少约90％相同的序列。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述序列与SEQ ID NO:18至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
80.如权利要求78或权利要求79所述的组合物，其中所述序列连接至抗体结构域。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述抗体结构域是抗体可变结构域。
82.如权利要求80或权利要求81所述的组合物，其中所述序列位于所述抗体结构域内。
83.如权利要求81所述的组合物，其中所述序列位于所述抗体可变结构域的CDR内。
84.如权利要求83所述的组合物，其中所述序列位于经修饰的曲妥珠单抗抗体可变结构域的CDR内。
85.如权利要求83所述的组合物，其中所述序列位于经修饰的帕利珠单抗抗体可变结构域的CDR内。
86.如权利要求78-83中任一项所述的组合物，其包含与SEQ ID NO:42至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X5，并且所述X5包含所述序列。
87.如权利要求86所述的组合物，其进一步包含与SEQ ID NO:31至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。
88.如权利要求78-83中任一项所述的组合物，其包含与SEQ ID NO:43至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区，其中所述区包含X6，并且所述X6包含所述序列。
89.如权利要求88所述的组合物，其进一步包含与SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的区。
90.如权利要求78-89中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
91.如权利要求90所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
92.如权利要求90或权利要求91所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
93.如权利要求90-92中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
94.如权利要求90-93中任一项所述的组合物，其中所述Fc区包含与SEQ ID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
95.一种组合物，其包含含有：(i)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:16的第一多肽和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的第二多肽，或含有：(ii)SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:77的第一多肽和含有SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:21的第二多肽。
96.如权利要求95所述的组合物，其中所述第一多肽是抗体可变结构域的轻链。
97.如权利要求95或权利要求96所述的组合物，其中所述第二多肽是抗体可变结构域的重链。
98.如权利要求95-97中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:24。
99.如权利要求95-98中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
101.如权利要求99或权利要求100所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
102.如权利要求99-101中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
103.如权利要求95-102中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含与SEQID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述第二多肽包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
104.一种组合物，其包含含有：(i)SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:39的第一多肽和含有SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:16的第二多肽，或含有：(ii)SEQ ID NO:37-SEQ IDNO:39的第一多肽和含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:77的第二多肽。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述第一多肽是抗体可变结构域的轻链。
106.如权利要求104或权利要求105所述的组合物，其中所述第二多肽是抗体可变结构域的重链。
107.如权利要求104-106中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:36。
108.如权利要求104-107中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
109.如权利要求108所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
110.如权利要求108或权利要求109所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
111.如权利要求108-110中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
112.如权利要求104-111中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含与SEQID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述第二多肽包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
113.一种组合物，其包含含有SEQ ID NO:31的第一多肽和含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的第二多肽。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
115.如权利要求113或权利要求114所述的组合物，其中所述GM-CSF包含人GM-CSF或鼠GM-CSF。
116.如权利要求113-115中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含抗体可变区的经修饰的重链。
117.如权利要求116所述的组合物，其中所述抗体可变结构域的所述经修饰的重链包含位于所述抗体可变区的第一氨基酸序列与所述抗体可变区的第二氨基酸序列之间的GM-CSF。
118.如权利要求117所述的组合物，其中所述第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO:32至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
119.如权利要求118所述的组合物，其中所述第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:32。
120.如权利要求117-119中任一项所述的组合物，其中所述第二氨基酸序列包含与SEQID NO:33至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
121.如权利要求120所述的组合物，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:33。
122.如权利要求116-121中任一项所述的组合物，其中所述GM-CSF位于所述经修饰的重链的互补决定区(CDR)内。
123.如权利要求122所述的组合物，其中所述GM-CSF位于重链CDR1、CDR2或CDR3内。
124.如权利要求123所述的组合物，其中所述GM-CSF位于重链CDR3内。
125.如权利要求116-124中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的重链是由包含SEQID NO:44的可变重链修饰而成的。
126.如权利要求113-125中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含第一接头肽。
127.如权利要求126所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ ID NO:10。
128.如权利要求126或权利要求127所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ IDNO:8。
129.如权利要求126-128中任一项所述的组合物，其中所述第一接头肽包含SEQ IDNO:11。
130.如权利要求126-129中任一项所述的组合物，其中所述第一接头肽包含与SEQ IDNO:12至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
131.如权利要求113-130中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含第二接头肽。
132.如权利要求131所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ ID NO:10。
133.如权利要求131或权利要求132所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ IDNO:9。
134.如权利要求131-133中任一项所述的组合物，其中所述第二接头肽包含SEQ IDNO:11。
135.如权利要求131-134中任一项所述的组合物，其中所述第二接头肽包含与SEQ IDNO:13至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
136.如权利要求113-135中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
137.如权利要求113-136中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
138.如权利要求113-137中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
139.如权利要求113-138中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
140.如权利要求113-139中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含抗体可变区的轻链。
141.如权利要求113-140中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:31。
142.如权利要求113-141中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽进一步包含与SEQID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
143.如权利要求113-142中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
144.如权利要求113-143中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽经由一个或多个二硫键连接。
145.如权利要求113-144中任一项所述的组合物，其中所述第一多肽和所述第二多肽形成抗体可变结构域。
146.如权利要求145所述的组合物，其中所述抗体可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的平衡解离常数(KD)与抗原结合。
147.如权利要求145或权利要求146所述的组合物，其中所述抗体可变结构域包含经修饰的曲妥珠单抗可变结构域。
148.如权利要求147所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:34的重链CDR1。
149.如权利要求147或权利要求148所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:35的重链CDR2。
150.如权利要求147-149中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:16的重链CDR3。
151.如权利要求147-150中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:37的轻链CDR1。
152.如权利要求147-151中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:38的轻链CDR2。
153.如权利要求147-152中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域包含含有SEQ ID NO:39的轻链CDR3。
154.如权利要求147-153中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的曲妥珠单抗可变结构域不以低于约10-2M、10-3M或10-4M的KD与人表皮生长因子受体2(Her2)结合。
155.如权利要求113-154中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
156.如权利要求155所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
157.如权利要求155或权利要求156所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
158.如权利要求155-157中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
159.如权利要求113-158中任一项所述的组合物，其中所述第二多肽进一步包含与SEQID NO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述第二多肽包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
160.一种组合物，其包含含有轻链序列和重链序列的抗体可变结构域，所述轻链序列包含含有与SEQ ID NO:31至少约90％相同的序列的第一多肽，所述重链序列包含含有与SEQ ID NO:29至少约90％相同的序列的第二多肽。
161.如权利要求160所述的组合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:31至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
162.如权利要求160或权利要求161所述的组合物，其中所述第二多肽包含与SEQ IDNO:29至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
163.如权利要求160-162中任一项所述的组合物，其包含GM-CSF。
164.如权利要求163所述的组合物，其中所述GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。
165.如权利要求163或权利要求164所述的组合物，其中所述GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
166.如权利要求160-165中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
167.如权利要求160-166中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:30至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
168.如权利要求160-167中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
169.如权利要求160-168中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
170.如权利要求160-169中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
171.如权利要求170所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
172.如权利要求170或权利要求171所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
173.如权利要求170-172中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
174.如权利要求160-173中任一项所述的组合物，其中所述重链进一步包含与SEQ IDNO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述重链包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
175.一种组合物，其包含含有重链序列和轻链序列的抗体可变结构域，所述重链序列包含与SEQ ID NO:42(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR[[X5]]WGQGTLVTVSS)至少约90％相同的序列，其中所述重链序列包含X6并且X6包含GM-CSF；所述轻链序列包含与SEQ ID NO:31至少约90％相同的序列。
176.如权利要求175所述的组合物，其中所述GM-CSF是人GM-CSF或鼠GM-CSF。
177.如权利要求175或权利要求176所述的组合物，其中所述GM-CSF包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:77至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
178.如权利要求175-177中任一项所述的组合物，其中所述重链序列包含与SEQ IDNO:42至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
179.如权利要求175-178中任一项所述的组合物，其中所述重链序列包含与SEQ IDNO:43(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGSGAKLAALKAKLAALKGGGGS[[X6]]GGGGSELAALEAELAALEAGGSGDYWGQGTLVTVSS)至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，其中所述重链序列包含X6并且X6包含所述GM-CSF。
180.如权利要求175-179中任一项所述的组合物，其中所述重链序列包含与SEQ IDNO:43至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
181.如权利要求175-180中任一项所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:7至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
182.如权利要求175-181中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
183.如权利要求175-182中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
184.如权利要求175-183中任一项所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
185.如权利要求175-184中任一项所述的组合物，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含相比于人IgG1降低的效应子功能。
186.如权利要求185所述的组合物，其中所述人IgG1包含SEQ ID NO:25。
187.如权利要求185或权利要求186所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
188.如权利要求185-187中任一项所述的组合物，其中所述降低的效应子功能包括降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
189.如权利要求175-188中任一项所述的组合物，其中所述重链进一步包含与SEQ IDNO:3至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；且/或所述重链包含Fc区，所述Fc区包含含有根据Kabat编号的E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S的人IgG1。
190.如权利要求1-189中任一项所述的组合物的用途，用于治疗神经系统疾病或病症。
191.一种治疗神经系统疾病或病症的方法，其包括向有需要的对象施用包括如权利要求1-189中任一项的组合物。
192.如权利要求190所述的用途或如权利要求191所述的方法，其中所述神经系统疾病或病症包括帕金森氏病。
193.如权利要求1-189中任一项所述的组合物的用途，其用于治疗阿尔茨海默氏病和/或创伤性脑损伤。
194.如权利要求1-189中任一项所述的组合物的用途，其用于治疗ALS。
195.如权利要求1-189中任一项所述的组合物的用途，其用于治疗急性辐射综合征。
196.如权利要求1-189中任一项所述的组合物的用途，其用于治疗癌症。
197.如权利要求190-196中任一项所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间每约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天施用一次。
198.如权利要求196所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间每约14天施用一次。
199.如权利要求190-196中任一项所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间每约2周施用一次。
200.如权利要求190-196中任一项所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间每约3周施用一次。
201.如权利要求190-196中任一项所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间每约4周施用一次。
202.如权利要求190-196中任一项所述的用途或方法，其中所述组合物在治疗期期间约每月施用一次。
203.如权利要求197-202中任一项所述的用途或方法，其中所述治疗期包括约8周至约2年。
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