CN115461343A - Ptotac btk降解剂的制备方法 - Google Patents

Ptotac btk降解剂的制备方法 Download PDF

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CN115461343A CN202180031407.9A CN202180031407A CN115461343A CN 115461343 A CN115461343 A CN 115461343A CN 202180031407 A CN202180031407 A CN 202180031407A CN 115461343 A CN115461343 A CN 115461343A
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雷柏林
霍常鑫
孙冬青
陈捷
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Abstract

本文披露了通过使BTK抑制剂部分与E3连接酶配体部分缀合而形成的新颖的双功能化合物的制备方法，这些双功能化合物功能是将靶向的蛋白质募集到E3泛素连接酶以进行降解。

Description

PTOTAC BTK降解剂的制备方法
技术领域
本文披露了通过使BTK抑制剂部分与E3连接酶配体部分缀合而形成的双功能化合物的制备方法，这些双功能化合物功能是将靶向的蛋白质募集到E3泛素连接酶以进行降解。
背景技术
蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)是一种通过小分子选择性敲除靶蛋白的新颖策略(Sakamoto KM等人,Proc Natl Acad Sci[美国科学院院报]2001,98:8554-9.；SakamotoK.M.等人,Methods Enzymol.[酶学方法]2005；399:833-847.)。PROTAC利用泛素-蛋白酶系统靶向特定蛋白质并诱导其在细胞中降解(Zhou P.等人,Mol Cell.[分子细胞]2000；6(3):751-756；Neklesa T.K.等人,Pharmacol Ther.[药理学与治疗学]2017；174:138-144；Lu M.等人,Eur J Med Chem.[欧洲药物化学杂志]2018；146:251-259；)。泛素-蛋白酶系统的正常生理功能负责清除细胞中的变性、突变或有害蛋白质。泛素-蛋白酶体系统(UPS)，也称为泛素-蛋白酶体途径(UPP)，是一种常见的翻译后调节机制，负责正常和病理状态下的蛋白质降解(Ardley H.等人,Essays Biochem.[生物化学测定]2005,41,15-30；KomanderD.等人,Biochem.[生物化学]2012,81,203-229；Grice G.L.等人,Cell Rep[细胞报告].2015,12,545-553；Swatek K.N.等人,Cell Res.[细胞研究]2016,26,399-422)。泛素(在真核细胞中高度保守)是一种修饰分子，由76个氨基酸组成，经由涉及E1、E2和E3酶的一系列酶促反应共价结合并标记靶标底物。随后，经修饰的底物被26S蛋白酶体复合物识别以进行泛素化介导的降解。迄今为止，已经发现了两种E1酶，分别称为UBA1和UBA6。另一方面，约有40种E2酶和超过600种E3酶，提供了控制多种下游蛋白质底物活性的功能多样性。然而，仅成功劫持有限数量的E3泛素连接酶，用于小分子PROTAC技术：希佩尔-林道综合征肿瘤抑制蛋白(VHL)、小鼠双微体2同系物(MDM2)、细胞内细胞凋亡的抑制剂(cIAP)和小脑蛋白(cereblon)(Philipp O.等人,Chem.Biol.[化学生物学]2017,12,2570-2578)。
由靶蛋白结合部分和E3泛素连接酶结合部分组成的双功能化合物已显示出诱导所选蛋白质的蛋白酶体介导的降解。这些类药物分子提供了暂时控制蛋白质表达的可能性，并且可用作治疗疾病的生化试剂。近年来，这种新开发的方法已广泛用于抗肿瘤研究(Lu J.等人,Chem Biol.[化学生物学]2015；22(6):755-763；Ottis P.等人,Chem Biol.[化学生物学]2017；12(4):892-898.；Crews C.M.等人,J Med Chem.[药物化学杂志]2018；61(2):403-404；Neklesa T.K.等人,Pharmacol Ther.[药理学与治疗学]2017,174:138-144.；Cermakova K.等人,Molecules,[分子]2018.23(8).；An S.等人,EBioMedicine[E生物医学],2018.；Lebraud H.等人,Essays Biochem.[生物化学测定]2017；61(5):517-527.；Sun Y.H.等人,Cell Res.[细胞研究]2018；28:779-81；Toure M.等人,Angew ChemInt Ed Engl.[应用化学国际版]2016；55(6):1966-1973；Yonghui Sun等人,Leukemia[白血病],第33卷,第2105-2110页(2019)；Shaodong Liu等人,Medicinal ChemistryResearch[药物化学研究],第29卷,第802-808页(2020)；并且已在专利出版物中披露或讨论，例如US 20160045607、US 20170008904、US 20180050021、US 20180072711、WO2002020740、WO 2014108452、WO 2016146985、WO 2016149668、WO 2016149989、WO2016197032、WO 2016197114、WO 2017011590、WO 2017030814、WO 2017079267、WO2017182418、WO 2017197036、WO 2017197046、WO 2017197051、WO 2017197056、WO2017201449、WO 2017211924、WO 2018033556、和WO 2018071606。
布鲁顿氏酪氨酸激酶(Btk)属于Tec酪氨酸激酶家族(Vetrie等人,Nature[自然]361:226-233,1993；Bradshaw,Cell Signal.[细胞信号]22:1175-84,2010)。Btk主要在大多数造血细胞中表达，例如B细胞、肥大细胞和巨噬细胞(Smith等人,J.Immunol.[免疫学杂志]152:557-565,1994)，并位于骨髓、脾脏和淋巴结组织中。Btk在涉及B细胞发育、分化的B细胞受体(BCR)和FcR信号传导途径中起重要作用(Khan,Immunol.Res.[免疫学研究]23:147,2001)。Btk被上游Src家族激酶激活。一旦激活，Btk反过来会使PLCγ磷酸化，从而导致对B细胞功能和存活产生影响(Humphries等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]279:37651,2004)。必须精确调节这些信号传导途径。编码Btk的基因中的突变导致人类遗传性B细胞特异性免疫缺陷疾病，称为X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)(Conley等人,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年鉴]27:199-227,2009)。异常的BCR介导的信号传导可能导致B细胞激活失调，从而导致多种自身免疫性疾病和炎性疾病。临床前研究表明，缺乏Btk的小鼠对发展胶原诱导的关节炎具有抗性。此外，美罗华(Rituxan)(一种消耗成熟B细胞的CD20抗体)的临床研究表明，B细胞在许多炎性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症中)起关键作用(Gurcan等人,Int.Immunopharmacol.[国际免疫药理学]9:10-25,2009)。因此，Btk抑制剂可用于治疗自身免疫和/或炎性疾病。
已经显示，抑制BTK会影响癌症的发展(B细胞恶性肿瘤)和细胞活力，并改善自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎和狼疮)。还经由替代性策略报道了对BTK的抑制，例如通过降解BTK(Alexandru D.等人,Biochemistry[生物化学]2018,57,26,3564-3575；Adelajda Z.等人,PNAS[美国科学院院报]2018 115(31)；Dennis D.等人,Blood[血液],2019,133:952-961；Yonghui S.等人,Cell Research[细胞研究],2018,28,779-781；Yonghui S.等人,Leukemia[白血病],2019,Degradation of Bruton’s tyrosine kinasemutants by PROTACs for the potential treatment of ibrutinib-resistant non-Hodgkin lymphomas[PROTAC对布鲁顿氏酪氨酸激酶突变体的降解，以潜在治疗依鲁替尼抗性的非霍奇金淋巴瘤])并且已在专利出版物中披露或讨论，例如US 20190276459、WO2019186343、WO 2019186358、WO 2019148150、WO 2019177902和WO 2019127008。
需要新型BTK抑制剂或降解剂，其比已知的BTK抑制剂更有效并且可经由替代性策略例如通过降解BTK来抑制BTK，以及同样需要其制备方法。本申请解决了该需求并提供了一种PROTAC BTK降解剂的制备方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供通过使BTK抑制剂与E3连接酶配体缀合来提供蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)化合物的制备方法，所述化合物功能是将靶向的蛋白质募集至E3泛素连接酶以进行降解。特别地，本披露提供了具有式(I)的PROTAC化合物的制备方法。
方面1：一种具有式(I)的化合物的制备方法：
Figure BDA0003911948700000041
其中：A1和A2各自独立地选自CH和N；
Figure BDA0003911948700000042
步骤1：化合物I-1在1,4-二噁烷和H2O中的溶液和I-2在K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2的存在下反应给出I-3；
步骤2：在N2氛围下，化合物I-3在1,4-二噁烷和H2O中的溶液和I-4在K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2的存在下反应给出I-5；
步骤3：化合物I-5在THF中的溶液随后在NaOH的MeOH溶液的存在下脱保护给出I-6；和
步骤4：化合物I-6在DCM/EtOH中的溶液和I-7在HOAc和NaOAc的存在下反应给出具有式(I)的化合物。
更具体地说，该步骤如下：
步骤1:向化合物I-1在1,4-二噁烷和H2O中的溶液加入I-2，K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2；将该混合物搅拌然后浓缩，溶解在H2O中并用EtOAc萃取；将有机相浓缩并通过快速色谱纯化，给出I-3；
步骤2：向化合物I-3在1,4-二噁烷和H2O中的溶液中加入I-4、K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2；将该混合物在N2氛围下搅拌；蒸发溶剂，用H2O稀释并用EtOAc萃取；合并有机相，浓缩并通过快速色谱纯化给出I-5；
步骤3：向化合物I-5在THF中的溶液加入NaOH的MeOH溶液；将该混合物搅拌0.5～2小时，浓缩并H2O制成浆液；过滤固体并用H2O洗涤；将滤饼减压干燥，然后将固体转移到烧瓶中并加入HCl/MeOH；搅拌1-6小时后，蒸发溶剂，用MeOH制成浆液，过滤，滤饼用MeOH和MTBE(甲基叔丁基醚)洗涤；滤饼干燥后直接用于下一步；
步骤4：向化合物I-6在DCM/EtOH中的溶液加入I-7、HOAc和NaOAc；搅拌5-120分钟后，加入NaBH(OAc)3；将混合物搅拌1-6小时；蒸发溶剂，用H2O稀释并用DCM/iPrOH萃取；合并有机相，浓缩并通过制备型TLC纯化，给出具有式(I)的化合物。
方面2：根据方面1的制备方法，其中A1是CH和A2是CH。
方面3：根据方面1的制备方法，其中A1是N和A2是CH。
方面4：根据方面1的制备方法，其中A1是N和A2是N。
方面5：根据方面1的制备方法，具有式(I)的化合物选自
Figure BDA0003911948700000051
Figure BDA0003911948700000061
方面6：根据方面1的制备方法，其中步骤1的反应发生在80℃。
方面7：根据方面1的制备方法，其中步骤2的反应发生在100℃，在N2氛围下反应18小时。
方面8：根据方面1的制备方法，其中在步骤3中，NaOH在MeOH中的浓度为4％(w/v)。
实例
以下实例旨在纯示例性的，并且不应当视为以任何方式限制。尽管已经做出努力以确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则温度为摄氏度。试剂购自商业供应商，如西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、阿法埃莎公司(Alfa Aesar)或TCI公司，并且除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。除非另有说明，否则下文所述的反应在氮气或氩气的正压力下或在无水溶剂中用干燥管进行；反应烧瓶配有橡胶隔片，用于通过注射器引入底物和试剂；并将玻璃器皿进行烘箱干燥和/或加热干燥。
在400MHz操作的安捷伦公司(Agilent)仪器上记录1H NMR谱。使用CDCl3、CD2Cl2、CD3OD、D2O、d6-DMSO、d6-丙酮或(CD3)2CO作为溶剂以及四甲基硅烷(0.00ppm)或残余溶剂(CDCl3：7.25ppm；CD3OD：3.31ppm；D2O：4.79ppm；d6-DMSO：2.50ppm；d6-丙酮：2.05；(CD3)3CO：2.05)作为参考标准来获得1HNMR光谱。当报告多重峰数时，使用以下缩写：s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、qn(五重峰)、sx(六重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)、dd(双二重峰)、dt(双三重峰)。如果给出耦合常数，则以赫兹(Hz)报告。
LCMS-1：LC-MS光谱仪(安捷伦公司(Agilent)1260Infinity)检测器：MWD(190-400nm)，质量检测器：6120SQ流动相：A：含有0.1％甲酸的水，B：含有0.1％甲酸的乙腈，柱：Poroshell 120 EC-C18，4.6x50mm，2.7pm梯度方法：流速：1.8mL/min时间(min)A(％)B(％)
Figure BDA0003911948700000071
LCMS，LCMS-3：LC-MS光谱仪(安捷伦公司(Agilent)1260 Infinity II)检测器：MWD(190-400nm)，质量检测器：G6125C SQ流动相：A：含有0.1％甲酸的水，B：含有0.1％甲酸的乙腈，柱：Poroshell 120 EC-C18，4.6x50mm，2.7pm梯度方法：流速：1.8mL/min时间(min)A(％)B(％)
Figure BDA0003911948700000072
LCMS-2：LC-MS光谱仪(安捷伦公司(Agilent)1290 Infinity II)检测器：MWD(190-400nm)，质量检测器：G6125C SQ流动相：A：含有0.1％甲酸的水，B：含有0.1％甲酸的乙腈，柱：Poroshell 120 EC-C18，4.6x50mm，2.7pm梯度方法：流速：1.2mL/min时间(min)A(％)B(％)
Figure BDA0003911948700000073
制备型HPLC在柱(150x21.2mm ID,5pm,Gemini NXC 18)上以20ml/min的流速，2ml的注射体积，在室温下进行并在214nm和254nm下UV检测。
在以下实例中，使用以下缩写：
Figure BDA0003911948700000074
Figure BDA0003911948700000081
Figure BDA0003911948700000091
实例1：1-(4-(4-((4-(4-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure BDA0003911948700000092
步骤1：叔丁基4-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基) 哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003911948700000101
向4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.5g，14.4mmol)的二噁烷(35mL)和H2O(7mL)中的溶液中添加叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)哌嗪-1-甲酸酯(1.6g，4.2mmol)、K2CO3(1.6g，12mmol)和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(0.3g，0.4mmol)。将混合物在80℃搅拌6小时。将混合物浓缩，溶于H2O(30mL)中，并用EtOAc(30mL*2)萃取。将有机相浓缩，并通过快速色谱用PE/EA(100:1至7:3)纯化，得到产物(1.9g，86.4％)。
步骤2：叔丁基4-(4-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环戊[4, 5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6- 基)苯基)哌嗪-1-甲酸酯
Figure BDA0003911948700000102
向叔丁基4-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)哌嗪-1-甲酸酯(1.9g，3.4mmol)在二噁烷(30mL)和H2O(6mL)中的溶液中添加7,7-二甲基-2-(2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3,4,7,8-四氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1(6H)-酮(1.4g，3.4mmol)、K2CO3(1.4g，10.0mmol)和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(0.3g，0.3mmol)。将混合物在100℃在N2下搅拌18小时。蒸发溶剂，添加H2O(30mL)，并用EtOAc(50mL*2)萃取。将有机相合并，浓缩，并通过快速色谱用PE/EA(100:1至1:100)纯化，得到产物(1.1g，粗品)。
步骤3：7,7-二甲基-2-(2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d] 嘧啶-4-基)苯基)-3,4,7,8-四氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1(6H)-酮盐酸盐
Figure BDA0003911948700000111
向叔丁基4-(4-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)哌嗪-1-甲酸酯(1.1g，1.4mmol)在THF(10mL)中的溶液中添加在MeOH中的NaOH(4％，3mL)。将混合物在20℃-30℃搅拌1小时，浓缩并用H2O(30mL)浆化。将固体过滤，并用H2O(30mL)洗涤。将滤饼在减压下干燥。将固体转移到烧瓶中，并添加HCl/MeOH(4N，30mL)。将混合物在20℃-30℃搅拌3小时。蒸发溶剂，并用MeOH浆化，过滤，并将滤饼用MeOH(30mL)和MTBE(20mL)洗涤。将滤饼干燥并直接用于下一步。1H NMR(400MHz,DMSO)δH 12.54(s,1H),8.77(s,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),7.57-7.39(m,3H),6.99(d,J＝8.4Hz,2H),6.62(s,1H),6.50(s,1H),4.18(br,3H),3.84(br,1H),3.15(s,4H),2.84(s,4H),2.56(s,2H),2.50(br,2H),2.41(s,2H),2.11(s,3H),1.21(s,6H)。[M+H]+＝572.3。
步骤4：1-(4-(4-((4-(4-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环 戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)哌 嗪-1-基)甲基)哌啶-1-基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure BDA0003911948700000112
向7,7-二甲基-2-(2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3,4,7,8-四氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1(6H)-酮(114mg，0.2mmol)在DCM/EtOH(5:1，30mL)中的溶液中添加1-(4-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)苯基)哌啶-4-甲醛(60mg，0.2mmol)HOAc(1滴)和NaOAc(32.8mg，0.4mmol)。在20℃-30℃搅拌60分钟后，添加NaBH(OAc)3(127mg，0.6mmol)。将混合物在20℃-30℃搅拌3小时。蒸发溶剂，添加H2O(30mL)，并用DCM/iPrOH(10:1，30mL*3)萃取。将有机相合并，浓缩，并通过制备型TLC用DCM/MeOH(10:1)纯化，得到产物(53mg，31％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δH 12.55(s,1H),10.27(s,1H),8.77(s,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),7.51-7.36(m,3H),7.13(d,J＝8.8Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.8Hz,2H),6.63(s,1H),6.50(s,1H),4.18(br,3H),3.84(br,1H),3.74-3.67(m,4H),3.24(br,4H),2.69-2.64(m,4H),2.56(s,2H),2.55-2.50(m,3H),2.41(s,2H),2.30-2.06(m,5H),1.87-1.65(m,3H),1.21(s,9H)；[M+H]+＝857.5。
实例2：1-(4-(4-((4-(4-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure BDA0003911948700000121
用类似于实例1的程序合成标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO)δH 12.71(s,1H),10.28(s,1H),8.83(s,1H),8.20(s,1H),7.90(d,J＝6.9Hz,2H),7.47(d,J＝17.7Hz,3H),7.36(d,J＝6.9Hz,2H),7.13(d,J＝7.5Hz,2H),6.93(d,J＝7.6Hz,2H),6.78(s,1H),6.51(s,1H),4.19(s,3H),3.85(s,1H),3.69(d,J＝6.7Hz,4H),2.97(d,J＝8.6Hz,3H),2.72-2.62(m,5H),2.17(d,J＝19.8Hz,6H),1.87-2.10(m,3H),1.85-1.63(m,8H),1.15-1.25(m,9H)；[M+H]+＝856.5。
实例3：1-(4-(4-((4-(5-(4-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-1,3,4,6,7,8-六氢-2H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure BDA0003911948700000122
用类似于实例1的程序合成标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO)δH 12.62(s,1H),10.27(s,1H),8.79(s,1H),8.73(s,1H),8.10(d,J＝9.0Hz,1H),7.46(d,J＝18.9Hz,3H),7.13(d,J＝8.5Hz,2H),6.93(d,J＝7.9Hz,3H),6.69(s,1H),6.50(s,1H),4.17(d,J＝8.7Hz,3H),3.85(s,1H),3.68(d,J＝6.8Hz,4H),3.58(s,4H),2.67(dd,J＝13.8,9.1Hz,4H),2.56(s,2H),2.46(s,4H),2.41(s,2H),2.22(d,J＝6.3Hz,2H),2.14(s,3H),1.82(d,J＝12.3Hz,2H),1.73(s,1H),1.21(s,8H)；[M+H]+＝858.4。
细胞降解
细胞处理
在康宁96孔板(目录号3799)中的细胞培养基[RPMI1640(吉博科公司(Gibco)，不含酚红，目录号11835-030)、10％热失活FBS、1％PS(吉博科公司，目录号10378)]中以20000个细胞/孔以15μl/孔的体积接种TMD-8细胞。用稀释于0.2％DMSO中的化合物处理TMD-8细胞，根据以下方案进行稀释：(1)在DMSO中从1mM通过6倍稀释制备500×储备溶液，包括总计8个剂量；(2)在细胞培养基中通过转移0.5μl 500×储备溶液至125μl培养基中制备2×溶液；(3)将15μl的2×溶液添加至细胞并孵育6h。
HTFR测定
处理6h后，向每个孔中添加10μl 4x裂解缓冲液；密封板并在平板振荡器上在室温下孵育30min；细胞裂解后，将16μL细胞裂解液转移至PE 384孔HTRF检测板；向每个孔中添加4μL预混合的HTRF抗体；用平板密封器覆盖平板，以1000rpm旋转1min，在室温下孵育过夜；在具有HTRF方案的BMG PheraStar上读数(337nm-665nm-620nm)。
通过以下公式计算化合物的抑制(降解)百分比：化合物的抑制百分比＝100-100×(低信号对照)/(高对照-低对照)，其中信号＝每个测试化合物组
低对照＝仅裂解缓冲液(不含细胞)，表明BTK已完全降解；
高对照＝添加DMSO且不含化合物的细胞组，表明无BTK降解的微板读数；
Dmax是抑制(降解)的最大百分比。
化合物的IC50(DC50)值可通过拟合以下公式获得
Y＝下部+(上部-下部)/(1+((IC50/X)^坡面))
其中，X和Y为已知值，且IC50、坡面、上部和下部为通过软件拟合获得的参数。Y是抑制百分数(由公式计算)，X是化合物的浓度；IC50是达到50％抑制时化合物的浓度。IC50值越小，化合物的抑制能力越强。反之亦然，IC50值越高，化合物的抑制能力越弱；坡面表示拟合曲线的斜率，通常约为1*；下部表示通过数据拟合获得的曲线的最小值，通常为0％±20％；上部表示通过数据拟合获得的曲线的最大值，通常为100％±20％。通过使用Dotmatics数据分析软件进行计算和分析来拟合实验数据。
表1.实例1至实例3的降解结果
Figure BDA0003911948700000141
前述实例和某些实施例的描述应被视为是说明性的，而非限制由权利要求所限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的情况下，可以使用上述特征的许多变化和组合。所有这些变化都旨在落入本发明的范围之内。引用的所有参考文献都通过引用以其全文并入本文。
应当理解，即使本文提到了现有技术出版物，但所述提及并不构成承认出版物形成任何国家的本领域公知常识的一部分。

Claims (8)

1.一种具有式(I)的化合物的制备方法：
Figure FDA0003911948690000011
其中：A1和A2各自独立地选自CH和N；
Figure FDA0003911948690000012
步骤1：化合物I-1在1,4-二噁烷和H2O中的溶液和I-2在K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2的存在下反应给出I-3；
步骤2：在N2氛围下，化合物I-3在1,4-二噁烷和H2O中的溶液和I-4在K2CO3和Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2的存在下反应给出I-5；
步骤3：化合物I-5在THF中的溶液随后在NaOH的MeOH溶液的存在下脱保护给出I-6；和
步骤4：化合物I-6在DCM/EtOH中的溶液和I-7在HOAc和NaOAc的存在下反应给出具有式(I)的化合物。
2.根据权利要求1的制备方法，其中A1是CH和A2是CH。
3.根据权利要求1的制备方法，其中A1是N和A2是CH。
4.根据权利要求1的制备方法，其中A1是N和A2是N。
5.根据权利要求1的制备方法，具有式(I)的化合物选自
Figure FDA0003911948690000021
6.根据权利要求1的制备方法，其中步骤1的反应在80℃进行。
7.根据权利要求1的制备方法，其中步骤2的反应在100℃，N2氛围下进行18小时。
8.根据权利要求1的制备方法，其中在步骤3中，NaOH在MeOH中的浓度为4％(w/v)。
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