CN115452982B - 一种注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种同时分离并检测注射用头孢他啶中杂质的方法，利用高效液相色谱法实现注射用头孢他啶中12种已知杂质的分离检测。所述方法能同时灵敏地分离并定量检测出注射用头孢他啶中12种已知杂质，并且，本发明提出的分离检测方法专属性强、定量限和检测限低、重复性和分离度良好。

Description

一种注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法

发明领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种同时分离并定量检测注射用头孢他啶中12种已知杂质的方法。

发明背景

头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)是半合成的第三代广谱头孢菌素，其抗菌活性好，对多种β-内酰胺酶稳定性好。其化学名为：(6R,7R)-7-[[(2Z)-2-(2-氨基-1,3-噻唑-4-基)-2-(1-羟基-2-甲基-1-氧代丙烷-2-基)氧亚氨乙酰]氨基]-8-氧代-3-(吡啶-1-鎓-1-基甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，其结构式为：

有关物质(杂质)及其含量是反映药品纯度的直接指标，控制或降低杂质的数量及其含量是药品质量研究的关键内容。头孢他啶在临床上主要用于治疗由敏感细菌所引起的的多种感染以及重度感染，在合理使用下耐药概率较低，发生副反应较少。和其它β-内酰胺抗生素相似，头孢他啶易受环境因素影响，在生产和存储过程中容易发生反应产生多种杂质，因此需要建立适宜的头孢他啶中杂质分离检测方法，对其杂质谱控制。在注射用头孢他啶中，目前已知的主要杂质结构式如下：

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通过检索国内外文献及专利，检索到以下专利：

中国专利文献CN101650356A中公开了一种用于头孢他啶与舒巴坦钠复方原料和制剂的检测方法：色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相优选为磷酸二氢钾、乙腈和四丁基氢氧化铵，但该方法仅能分离检测头孢他啶和舒巴坦钠这两种单一成分；采用葡聚糖凝胶色谱柱，流动相：磷酸盐缓冲液为流动相A，十二烷基硫酸钠溶液为流动相B，该方法仅能检测其中的一种杂质头孢他啶聚合物，并未涉及到同时分离12种已知杂质。

中国专利文献CN112946138A中公开了一种头孢他啶中杂质的测定方法，主要在于提供一种可以消除检测过程中产生的鬼峰的检测方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B；梯度洗脱的方式进行洗脱，该方法未指出杂质的种类，无法实现杂质的分离检测。

中国专利文献CN114047271A中公开了一种注射用头孢他啶制剂中杂质的检测方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为D-酒石酸盐溶液-四硼酸钠溶液-乙腈，但该方法为等度洗脱，仅实现注射用头孢他啶的7种杂质的分离。

以上现有的专利文件中并未涉及到头孢他啶中已知杂质1～12的同时分离检测方法，无法对杂质谱进行控制，无法准确控制注射用头孢他啶的质量。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种同时分离注射用头孢他啶中杂质的方法，其分离效果显著；同时，对涉及到的杂质进行定量检测，实现了注射用头孢他啶中杂质含量的评估和计算。

采用本发明所述的方法能对注射用头孢他啶中12种已知杂质进行前端质量控制，其具有：专属性强(分离度大于1.5)、灵敏度显著提升(定量限和检测限显著降低，定量限可低至0.1432μg/mL，检测限可低至0.0358μg/mL)、准确性显著提高，测定范围更广(提高了2个数量级)、准确度显著提高(提高了2倍以上)、重复性良好(各已知杂质的极差均小于0.05％)、耐用性良好(检测结果绝对值小于0.1％)等特点，可对注射用头孢他啶中的12种已知杂质进行同时准确定量测定。

本发明具体技术方案如下：

一种注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法，所述检测方法包括如下步骤：配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的12种已知杂质进行检测：

色谱条件中：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；

流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH为3.3～3.5；流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

检测波长：249nm-259nm；

柱温：35-45℃；

流速：1.2～1.4mL/min。

在一些优选的实施方案中，所述色谱柱的种类选用Waters Atlantis T3 C18、Agilent ZORBAX SB-C18或GL Sciences Inertsil ODS-3色谱柱中的任意一种；优选的是，色谱柱选用Waters

T3 C18。

在一些优选的实施方案中，所述色谱柱的规格为：4.6mm×250mm，5.0μm。

在一些优选的实施方案中，所述流动相A的pH范围为3.3～3.5；在一些优选的实施方案中，所述流动相A的pH为3.4。

在一些优选的实施方案中，注射用头孢他啶中的杂质中至少包括杂质1、杂质3、杂质4、杂质6、杂质8、杂质9、杂质11和杂质12；或者，至少包括杂质1、杂质4和杂质6；或者，至少包括杂质8和杂质10；或者，至少包括杂质3、杂质11或杂质12；或者，至少包括杂质5和杂质6。

在一些优选的实施方案中，所述梯度洗脱的运行时间为55min。

在一些优选的实施方案中，所述液相条件中，流动相的洗脱梯度为：

保留时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
5	96	4
			8	96	4
16	89	11
			26	84	16
29	80	20
			44	50	50
48	20	80
			49	100	0
55	100	0

在一些优选的实施方案中，色谱条件的检测波长为254nm。

在一些优选的实施方案中，色谱柱的柱温为40℃。

在一些优选的实施方案中，流动相的流速为1.3mL/min。

在一些优选的实施方案中，所述方法还包括供试品溶液和混合杂质对照品溶液的制备：

供试品溶液：称取注射用头孢他啶，用稀释剂溶解，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

混合杂质对照品溶液：称取头孢他啶和杂质1～12对照品，用稀释剂溶解，过滤，取续滤液作为混合杂质对照品溶液。

在一些优选的实施方案中，所述稀释剂为乙腈水溶液。

在一些优选的实施方案中，其中，溶液配制还包括：

杂质定位溶液：分别取杂质1～12对照品，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL溶剂中3μg杂质的溶液，分别作为杂质1～12定位溶液；优选的是，分别取杂质1对照品、杂质3对照品、杂质4对照品、杂质6对照品、杂质8对照品、杂质9对照品、杂质11对照品、杂质12对照品。

本发明提供的注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法，能够更好的控制注射用头孢他啶的质量，更好的对注射用头孢他啶中可能存在的多种已知杂质进行分离与测定。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法，可同时分离注射用头孢他啶中12种已知杂质，其分离效果显著；同时，该方法对本发明涉及到的全部杂质进行了定量检测，实现了注射用头孢他啶中杂质的含量的评估和计算。

采用本发明所述方法能对注射用头孢他啶的质量进行准确控制，其具有：专属性强(分离度大于1.5)、灵敏度显著提高(定量限和检测限显著降低，定量限可低至0.1432μg/mL，检测限可低至0.0358μg/mL)、准确性显著提高，测定范围更广(提高了2个数量级)、准确度显著提高(提高了2倍以上)、重复性良好(各已知杂质检测结果的极差均小于0.05％)、耐用性良好(检测结果绝对值小于0.1％)等特点。

具体来说：

1)采用本发明方法，12种已知杂质特征峰的分离度均大于1.5，各特征峰之间不存在相互干扰，分离度良好，专属性强；

2)检测上述12种已知杂质的定量限和检测限都呈现显著降低的趋势：定量限可低至0.1432μg/mL，其定量限浓度仅为供试品溶液浓度的0.0095％(供试品溶液浓度的0.0095％＝1.5mg/mL*0.0095％＝0.1432μg/mL)，相当于限度浓度的二十分之一以下；检测限低至0.0358μg/mL，其检测限浓度仅为供试品溶液浓度的0.0024％(供试品溶液浓度的0.0024％＝1.5mg/mL*0.0024％＝0.0358μg/mL)，相当于限度浓度的八十四分之一；相较于一般标准要求的最低检测限(μg级别)降低了2个数量级，检测灵敏度良好；

3)在限定浓度范围内，头孢他啶与已知杂质1～12的特征吸收峰面积与其对应浓度之间表现出良好的的线性关系，线性方程的线性相关系数r＞0.999，其中，头孢他啶、杂质3、杂质4、杂质7、杂质9和杂质10为最优，线性相关系数达到了1.0000；相较于一般标准要求的线性相关系数r＞0.99，测定的准确性提高了2个数量级；其检测方法的准确性更高，测定范围更广；

4)上述各已知杂质回收率均保持在95％～104％之间，RSD均小于2.3％，低于各杂质标准检测要求(RSD<5.0％)，准确度提高了两倍以上，方法准确性良好；

5)本发明检测方法对平行样品进行重复性检测，各已知杂质检测结果的极差均小于0.05％，表现出良好的可重复性；

6)改变色谱条件和色谱柱批次，注射用头孢他啶中各已知杂质的检测结果发现，各已知杂质检出量均无明显变化：杂质1、杂质3～11均可检出，以杂质7～11为例，各已知杂质含量变化的绝对值在0.06％以内，其他单杂和总杂含量变化的绝对值在0.1％以内。说明本发明在上述条件范围内均能实现良好、准确的检测效果，并且在上述条件范围内，测定结果不受上述条件变化的影响，其表现出良好且显著的耐用性。

通过此方法能够准确控制注射用头孢他啶的质量，有利于注射用头孢他啶的质量控制，进行有效的安全推广与应用。

附图说明

图1为本发明实施例1的一种注射用头孢他啶的系统适用性色谱图。

其中，TBTD表示头孢他啶。

图2为本发明实施例1以及实施例2中方法1、方法2和方法3中的一种注射用头孢他啶的杂质5的特征峰的色谱对比图；

图3为本发明实施例5中方法1的一种注射用头孢他啶的混合杂质对照品溶液色谱图。

图4为本发明实施例5中方法2的一种注射用头孢他啶的混合杂质对照品溶液色谱图；

图5为本发明实施例12方法1的分离结果色谱图；

图6为本发明实施例12方法2的分离结果色谱图。

具体实施方式

本发明提供的测定注射用头孢他啶中杂质的方法，对注射用头孢他啶12种已知杂质进行分离，其分离效果显著；同时，本发明对涉及到的全部杂质进行了定量检测，实现了注射用头孢他啶中杂质的含量的评估和计算。

实施例1专属性试验

1-1.溶液配制：

稀释剂(空白稀释剂)：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀。

杂质定位溶液：分别取杂质1～12对照品，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL溶剂中3μg杂质的溶液，分别作为杂质1～12定位溶液。

混合杂质对照品溶液：取头孢他啶及杂质1～12对照品，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL中含头孢他啶1.5mg和杂质1～12各3μg的溶液，作为混合杂质对照品溶液。

供试品溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。(临用新制)

对照溶液：量取上述供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。取上述溶液适量，加水定量稀释制成每1mL中含3μg的溶液，摇匀。

1-2.测试条件：

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters

T3 C18，4.6mm×250mm，5.0μm；

流动相：流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用10％磷酸溶液调节pH3.4)，流动相B：乙腈；

洗脱方式为梯度洗脱，洗脱梯度如下：

保留时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
5	96	4
			8	96	4
16	89	11
			26	84	16
29	80	20
			44	50	50
48	20	80
			49	100	0
55	100	0

柱温：40℃；

流速：1.3mL/min；

进样量：20μL；

1-3.实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果。系统适用性色谱图见附图1，结果见表1。

表1注射用头孢他啶中杂质的系统适用性-混合对照结果

结论：

采用高效液相色谱仪对上述样品进行分离，由试验结果可知：

对空白的稀释剂进行检测，发现稀释剂基线平稳，并且无特征峰，表明空白的稀释剂不干扰供试品溶液中已知杂质的测定；并且由供试品溶液的的谱图(图1)可知，头孢他啶特征峰的保留时间为18.966min。

由杂质1～12定位溶液、供试品溶液和对照溶液的检测结果可以定位各杂质特征峰的保留时间，杂质1～12的保留时间分别为：3.197min、4.127min、7.919min、12.194min、14.607min、15.473min、17.348min、21.676min、23.369min、26.470min、37.364min和40.211min。

采用混合杂质对照品溶液进行测定，发现空白稀释剂不干扰供试品溶液中杂质的检测，混合杂质对照品溶液中头孢他啶与12种杂质的相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，最高达55.91，分离度良好。

由上述实验检测结果可知，本发明提供的测定方法，能同时分离注射用头孢他啶中12种已知杂质，并且头孢他啶和12种已知杂质的色谱峰表现出显著的分离效果，专属性良好。

实施例2色谱柱的选择

溶液配制：采用实施例1方法配制混合杂质对照品溶液。

在实施例1的基础上，改变色谱柱的类型，其他色谱条件保持不变，对注射用头孢他啶中12种杂质进行检测。

其中，实施例1中色谱柱为：Waters

T3 C18，4.6mm×250mm，5.0μm；

改变实施例1的色谱柱类型：

方法1的色谱柱为：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6mm×250mm，5.0μm；

方法2的色谱柱为：GL Sciences Inertsil ODS-3 4.6mm×250mm，5.0μm；

方法3的色谱柱为：Thermo GOLD Aq 4.6mm×250mm，5.0μm。

其他参数和步骤与实施例1相同。精密量取20μL混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果，结果见下表和附图2～3。

结论：

采用实施例1中Waters

T3 C18(4.6mm×250mm，5.0μm)色谱柱，其中12个已知杂质峰和头孢他啶的特征峰分离度均大于1.5，显示出良好的分离度，可同时分离12种已知杂质。

采用实施例2中方法1的Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5.0μm)、方法2的GL Sciences Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm，5.0μm)以及方法3的Thermo GOLD Aq(4.6mm×250mm，5.0μm)色谱柱得到的色谱图，如图2所示，杂质5信噪比分别为40、35和26；实施例2相较于本申请实施例1中杂质5的信噪比106，实施例2远远低于实施例1的结果，二者相差2～5倍以上；导致实施例2方法中的杂质5无法正常检出，无法同时分离12种已知杂质。

因此，采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，能同时分离注射用头孢他啶中的12种杂质。其中，采用Waters

T3 C18(4.6mm×250mm，5.0μm)色谱柱时，分离效果最优。

实施例3流动相的选择

溶液配制：采用实施例1方法配制混合杂质对照品溶液。

在实施例1的基础上，改变流动相的种类，其他色谱条件保持不变，对注射用头孢他啶中12种杂质进行检测。

其中，实施例1中流动相为：流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B为乙腈；

改变实施例1的流动相的种类：

方法1流动相为：流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B为甲醇；

方法2流动相为：流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠4.68g与磷酸二氢钾0.32g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B为乙腈；

其他参数和步骤与实施例1相同。精密量取20μL混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。

结论：

通过上述三种不同类型的流动相对注射用头孢他啶中的杂质进行高效液相色谱分析，发现：

实施例1中，采用流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B：乙腈；二者作为流动相时，得到的谱图中全部杂质均有出峰响应，并且各个特征峰之间的分离度良好，能同时分离12种已知杂质。

实施例3方法1中，采用流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B为甲醇作为流动相时，杂质4、5和6分离度小于1.2，无法同时分离12种已知杂质。

实施例3方法2中，采用流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠4.68g与磷酸二氢钾0.32g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)；流动相B为乙腈；作为流动相时，杂质5和6分离度小于1.2，无法同时分离12种已知杂质。

因此，通过上述不同类型流动相的实验结果证明，采用本发明流动相A(磷酸盐缓冲液)、流动相B(乙腈)作为流动相，能同时分离注射用头孢他啶中12种已知杂质；其中，流动相A选用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH3.4)时，分离效果最好。

采用其他类型流动相种类，均无法同时分离各已知杂质1～12。

实施例4流动相A的pH选择

溶液配制：采用实施例1方法配制混合杂质对照品溶液。

在实施例1的基础上，改变流动相的A的pH，其他色谱条件保持不变，对注射用头孢他啶中12种杂质进行检测。

其中，实施例1中流动相A的pH＝3.4；

改变实施例1的流动相pH：

方法1流动相A的pH为：5.0；

方法2流动相A的pH为：2.5。

其他参数和步骤与实施例1相同。精密量取20μL混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。

结论：

通过上述不同pH条件下的流动相A对注射用头孢他啶中的杂质进行高效液相色谱分析，发现：

实施例1中，控制流动相A的pH＝3.4时，得到的谱图中全部杂质均有出峰响应，并且各个特征峰之间的分离度良好，分离度均大于1.5，能够同时分离12种已知杂质。

实施例4方法1和2中，改变流动相A的pH分别为5.0和2.5，杂质5和杂质6的分离度小于1.2，无法同时分离12种已知杂质。

因此，采用本发明流动相A的pH＝3.3～3.5时，能同时分离注射用头孢他啶中12种已知杂质；其中当流动相A的pH＝3.4时，分离效果最好。

反之，流动相采用3.3～3.5范围以外的pH时，如5.0或2.5，无法分离注射用头孢他啶中12种已知杂质。

实施例5洗脱梯度的选择

溶液配制：采用实施例1方法配制混合杂质对照品溶液。

在实施例1的基础上，改变色谱条件中的的洗脱梯度，其他色谱条件保持不变，对注射用头孢他啶中12种杂质进行检测。

其中，实施例1的洗脱梯度为：

保留时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
5	96	4
			8	96	4
16	89	11
			26	84	16
29	80	20
			44	50	50
48	20	80
			49	100	0
55	100	0

改变实施例1的洗脱梯度：

方法1的洗脱梯度为：

保留时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
4	96	4
			7	96	4
13	89	11
			23	84	16
26	80	20
			34	50	50
39	20	80
			41	100	0
48	100	0

方法2的洗脱梯度为：

保留时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
4	96	4
			10	96	4
17	89	11
			22	84	16
25	80	20
			33	50	50
38	20	80
			40	100	0
46	100	0

其他参数和步骤与实施例1相同。精密量取20μL混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：

通过上述不同洗脱梯度对注射用头孢他啶中的杂质进行高效液相色谱分析，发现：

采用实施例1中流动相洗脱梯度时，得到的谱图中全部杂质均有出峰响应，并且各个特征峰之间的分离度良好，分离度保持在1.9以上，可同时分离12种已知杂质。

实施例5方法1中，改变流动相洗脱梯度得到的谱图(见附图3)发现，全部杂质均有出峰响应，但是各杂质5和杂质6的分离度仅为1.2，无法满足分离度要求，不能同时分离12种已知杂质。

实施例5方法2中，改变流动相洗脱梯度得到的谱图(见附图4)发现，全部杂质均有出峰响应，但是杂质5(限度浓度)的信噪比相当于定量限，无法准确检测杂质5，无法同时分离12种已知杂质。

通过上述流动相洗脱梯度的实验结果证明，采用实施例1的流动相洗脱梯度，主峰(头孢他啶特征峰)和12种杂质的特征峰分离度良好，分离效果显著，能同时分离注射用头孢他啶中12种已知杂质。

当控制流动相洗脱梯度为方法1或者2时，无法同时分离12种已知杂质。

实施例6破坏性试验

强制降解试验是在较为剧烈的条件下，如采用强光照射、高温、高湿、酸碱破坏及水解还有氧化破坏等方法，加速对样品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，来评估分析方法的有效性和适用性。同时采用光二极管阵列检测，进行峰纯度检查：降解实验所得的图谱中，当杂质及主峰峰纯度角小于纯度阈值时，判断该该测定方法满足测定的要求。

6-1.溶液配制：

稀释剂：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀。

未降解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置100mL量瓶中，加稀释剂解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得未降解样品；(临用新制)

酸降解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，精密加入1mol/L盐酸溶液1mL，室温放置10min，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得酸降解样品；

碱降解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，精密加入0.05mol/L氢氧化钠1mL，室温放置3min，精密加入0.05mol/L盐酸溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得碱降解样品；

氧化降解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，精密加入3％过氧化氢溶液1mL，室温放置10分钟，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得氧化降解样品；

水解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，精密加入水1mL，置30℃水浴中2h，取出，放冷，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得水解样品；

光照降解溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置光照箱(5000±500lx)中5day，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得光照降解样品；

6-2.实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图和结果，其结果见表2～3。

表2注射用头孢他啶中杂质的系统适用性检测结果

注：“ND”表示未检出；“-”表示小于0.02％。

表3注射用头孢他啶中杂质的破坏试验结果

结论：

通过高效液相色谱对未降解样品和各降解条件下样品进行检测，结果如下：

与未降解样品相比，注射用头孢他啶内容物在各降解条件下得到的样品中(表2)，除了杂质1、杂质3、杂质4和杂质12外，其他8种已知杂质(杂质2、杂质5～11)和未知杂质的含量均发生了明显的变化，本品对酸、碱、氧化、水、光照均不稳定。各降解条件下，主峰(头孢他啶的特征峰)与其相邻杂质特征峰间的分离度均大于1.5；已知杂质最小分离度均大于1.2(表3)，专属性良好。

以上结果表明此分析方法在各降解条件下均具有有效性和适用性。

本发明以上内容，对注射用头孢他啶中的12种已知杂质进行了分离，其中所有杂质峰均可分离。同时，以下内容中，本发明还对所涉及的全部杂质进行了定量检测(以下以10种杂质为例)，实现了对注射用头孢他啶中杂质含量的评估和计算。

实施例7线性试验

7-1.溶液配制：

稀释剂：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀。

杂质储备液：称取杂质1、3、5～11各10mg，分别置于不同10mL量瓶中，加稀释剂适量，超声使溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质1、3、5～11储备液。

供试品溶液：称取头孢他啶对照品15mg置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

线性储备液：量取供试品溶液10mL，置100mL量瓶中，加入以上杂质1、3、5～11的储备液各3mL，取杂质4(10mg)加水溶解并转移至上述容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质1、3～11线性储备液。

线性溶液：分别量取上述线性储备液2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL、0.25mL置于5个不同10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为线性200％溶液、线性150％溶液、线性100％溶液、线性50％溶液和线性25％溶液；分别精密量取上述线性储备溶液1.0mL、0.5mL、0.25mL、0.1mL置于4个不同100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀线性10％溶液、线性5％溶液、线性2.5％溶液和线性1％溶液。

7-2.实验步骤及结论：

精密量取上述线性溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图和结果，结果见表3。

表3注射用头孢他啶中杂质方法学-线性结果

成分	标准曲线	线性与范围	线性相关系数r
				头孢他啶	y＝40367.0274x+4392.4106	0.0653～5.2235μg/mL	r＝0.9999
杂质1	y＝29989.4030x+1206.0874	0.3749～2.9995μg/mL	r＝0.9996
				杂质3	y＝26519.8428x+951.6527	0.1432～2.8633μg/mL	r＝1.0000
杂质4	y＝26596.5612x+1789.1053	0.2689～21.5102μg/mL	r＝1.0000
				杂质5	y＝26847.3662x-1812.6784	0.7596～6.0767μg/mL	r＝0.9995
杂质6	y＝26642.9741x+740.3105	0.4091～3.2729μg/mL	r＝0.9997
				杂质7	y＝33697.3999x+1173.0425	0.1568～6.2720μg/mL	r＝1.0000
杂质8	y＝39747.9426x+244.7054	0.1568～3.1357μg/mL	r＝0.9998
				杂质9	y＝28985.0855x+1257.2441	0.1514～6.0563μg/mL	r＝1.0000
杂质10	y＝22818.3503x+454.0337	0.3713～2.9702μg/mL	r＝1.0000
				杂质11	y＝23691.6907x+858.9336	0.1562～3.1237μg/mL	r＝0.9999

结论：

通过对上述线性溶液进行分析发现：

头孢他啶在0.0653～5.2235μg/mL浓度范围内(相当于限度浓度(3.0μg/mL)的2.5％～200％)，其线性方程为y＝40367.0274x+4392.4106，线性相关系数(r)＝0.9999，大于0.999，头孢他啶的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质1在0.3749～2.9995μg/mL浓度范围内(相当于杂质1限度浓度(3.0μg/mL)的25％～200％)，其线性方程为y＝29989.4030x+1206.0874，线性相关系数(r)＝0.9996，大于0.999，杂质1的峰面积面积与浓度线性关系良好；

杂质3在0.1432～2.8633μg/mL浓度范围内(相当于杂质3限度浓度(3.0μg/mL)的10％～200％)，其线性方程为y＝26519.8428x+951.6527，线性相关系数(r)＝1.0000，大于0.9999，杂质3的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质4在0.2689～21.5102μg/mL浓度范围内(相当于杂质4限度浓度(10.0μg/mL)的2.5％～200％)，线性方程为y＝26596.5612x+1789.1053，线性相关系数(r)＝1.0000，大于0.9999，杂质4的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质5在0.7596～6.0767μg/mL浓度范围内(相当于杂质5限度浓度(3.0μg/mL)的25％～200％)，其线性方程为y＝26847.3662x-1812.6784，线性相关系数(r)＝0.9995，大于0.999，杂质5的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质6在0.4091～3.2729μg/mL浓度范围内(相当于杂质6限度浓度(3.0μg/mL)的25％～200％)，其线性方程为y＝26642.9741x+740.3105，线性相关系数(r)＝0.9997，大于0.999，杂质6的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质7在0.1568～6.2720μg/mL浓度范围内(相当于杂质7限度浓度(3.0μg/mL)的5％～200％)，其线性方程为y＝33697.3999x+1173.0425，线性相关系数(r)＝1.0000，大于0.9999，杂质7的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质8在0.1568～3.1357μg/mL浓度范围内(相当于杂质8限度浓度(3.0μg/mL)的10％～200％)，其线性方程为y＝39747.9426x+244.7054，线性相关系数(r)＝0.9998，大于0.999，杂质8峰面积与浓度线性关系良好；

杂质9在0.1514～6.0563μg/mL浓度范围内(相当于杂质9限度浓度(3.0μg/mL)的5％～200％)，其线性方程为y＝28985.0855x+1257.2441，线性相关系数(r)＝1.0000，大于0.9999，杂质9的峰面积与浓度线性关系良好；

杂质10在0.3713～2.9702μg/mL浓度范围内(相当于杂质10限度浓度(3.0μg/mL)的25％～200％)，其线性方程为y＝22818.3503x+454.0337，线性相关系数(r)＝1.0000，大于0.9999，杂质10峰面积与浓度线性关系良好；

杂质11在0.1562～3.1237μg/mL浓度范围内(相当于杂质11限度浓度(3.0μg/mL)的10％～200％)，其线性方程为y＝23691.6907x+858.9336，线性相关系数(r)＝0.9999，大于0.999，杂质11峰面积与浓度线性关系良好；

以上结果表明，头孢他啶和杂质1、3～11在线性范围内的线性相关系数r均大于0.999，峰面积和浓度呈良好线性关系。其中，线性相关系数r最优能达到1.0000；相较于一般标准要求的线性相关系数r＞0.99，测定的准确性提高了2个数量级以上；其检测方法的准确性更高，测定范围更广。

实施例8定量限和检测限试验

8-1.溶液配制：

稀释剂：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀。

供试品溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。(临用新制)

定量限溶液：分别取实施例7中线性溶液采用稀释剂定量稀释至各杂质峰的信噪比约为10，此时溶液浓度为定量限浓度；

检测限溶液：分别取实施例7中线性溶液采用稀释剂定量稀释至各杂质峰的信噪比约为3，此时溶液浓度为检测限浓度。

8-2.实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图和结果，结果见表4。

表4注射用头孢他啶中杂质的定量限和检测限考察结果

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结论：

采用上述分离条件，对注射用头孢他啶中杂质1、3～11的定量限和检测限进行检测，结果如下：

上述杂质的定量限呈现显著降低的趋势：杂质1、杂质3～11的定量限均不高于0.7754μg/mL；其中杂质3的定量限最低(0.1432μg/mL)，其定量限浓度仅为供试品溶液浓度的0.0095％(供试品溶液浓度的0.0095％＝1.5mg/mL*0.0095％＝0.1432μg/mL)，相当于限度浓度的二十分之一；

上述杂质的检测限呈现显著降低的趋势：杂质1、杂质3～11的检测限均不高于0.1551μg/mL；其中杂质3的定量限最低(0.0358μg/mL)，其检测限浓度仅为供试品溶液浓度的0.0024％(供试品溶液浓度的0.0024％＝1.5mg/mL*0.0024％＝0.0358μg/mL)，相当于限度浓度的八十四分之一，检测灵敏度良好；相较于一般标准要求的最低检测限(μg级别)降低了2个数量级，检测灵敏度提升显著；

试验结果表明本实验方法可以满足注射用头孢他啶中已知杂质的同时分离及其质量控制要求，灵敏度显著提高。

实施例9回收率试验

9-1.溶液配制：

稀释剂：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀。

杂质储备液：分别称取杂质1、3、5～11各10mg，分别置不同10mL量瓶中，加稀释剂适量，超声使溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质1、3、5～11的储备液。

准确度储备溶液：量取以上杂质储备液各3mL，置100mL量瓶中，取杂质4(10mg)加水溶解并转移至上述容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度储备溶液。

准确度对照品溶液：量取上述准确度储备溶液10mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

准确度溶液：称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置100mL量瓶中，平行称取9份，平均分为3组，分别精密加入上述准确度对照品溶液5mL、10mL、15mL，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别作为50％、100％、150％准确度溶液。

9-2.实验步骤及结论：

精密量取上述各准确度供试品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图和结果，结果见表5。相对标准偏差计算公式如下：

表5注射用头孢他啶中杂质的方法学-回收率结果

结论：

通过测定50％、100％、150％准确度溶液(相当于限度浓度)，结果发现杂质1、3～11的组内平均回收率和组间平均回收率均在95％～104％之间，杂质1、杂质3～11的RSD均小于2.3％，远小于各杂质标准检测要求(RSD<5％)，准确度提高2倍以上，表明本方法用于检测上述杂质1、3～11，准确度良好。

实施例10重复性试验

通过重复测定同批样品来考察系杂质含量的变化，以验证并获取方法重复性。

10-1.溶液配制：

稀释剂：取乙腈5mL，加水稀释至100mL，摇匀；

供试品溶液：精密称取注射用头孢他啶(含头孢他啶150mg)，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得(临用新制)，平行配制6份，记作：样1～样6。

对照溶液：精密量取上述供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。取上述溶液适量，加水定量稀释制成每1mL中含3μg的溶液，摇匀，作为对照溶液。

10-2.实验步骤及结论：

精密量取上述样1～样6供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，结果见表6。

表6注射用头孢他啶中杂质的精密度测试结果

注：“ND”为未检出。

结论：

通过平行测定6份同批样品，结果发现各已知杂质检出量均无明显变化：杂质1、杂质3～11均可检出，以杂质7～11为例，各已知杂质极差均小于0.03％，其他最大单杂杂质和总杂也含量均无明显变化，其极差小于0.05％，，表明本发明的检测方法的可重复性良好。

实施例11耐用性试验

通过微量改变方法参数考察系统适用性的变化和测定结果不受影响的承受程度。本品耐用性考察了在实施例1的检测条件的基础上，改变检测波长(±5nm)、柱温(±5℃)、流速(±0.2mL/min)、流动相A称样量、流动相A的pH值(±0.1)以及更换不同批次色谱柱等条件下变化情况对测定结果各已知杂质的影响。溶液配制及其他色谱条件同实施例1，耐用性结果如下所示。

表7耐用性试验结果

结论：

耐用性试验结果显示，在实施例1的基础上，在检测波长249～259nm、流速1.1～1.5mL/min、柱温35～45℃、流动相A称样量(十二水合磷酸二氢钠：磷酸二氢钾＝(3.96～3.24)：(1.26～1.54)、流动相pH3.3～3.5以及不同批次色谱柱条件下，结果发现各已知杂质检出量均无明显变化，杂质1、杂质3～11均可检出，以杂质7～11为例，各已知杂质含量变化的绝对值在0.06％以内，其他单杂和总杂含量变化的绝对值在0.1％以内。试验表明本方法在检测波长、流速、柱温、流动相A称样量、流动相A的pH值及更换不同批次色谱柱条件下，采用本发明方法检测注射用头孢他啶中杂质的耐用性良好。

实施例12不同注射液用头孢他啶的分离实验

参考实施例1方法，分别采用：

方法1：悦康药业(200301Y)注射用头孢他啶；

方法2：原研厂家葛兰素史克(生产批号：CW3E)注射用头孢他啶；

配制供试品溶液，进行分离检测，方法和实施例1保持一致。

结论：

图5和图6的结果显示，方法1悦康药业(200301Y)注射用头孢他啶样品中能检出8个杂质，包括杂质2、杂质5、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、杂质11和未知杂质1；并且各杂质含量较小，杂质间分离度均大于1.5，分离效果良好；

方法2原研厂家葛兰素史克的注射用头孢他啶样品中能检出15个杂质，包括杂质2、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质11和未知杂质1～8；杂质个数较多，杂质含量较大，但各杂质间分离度均大于1.5，分离效果良好。

通过上述实验结果可知，使用本发明方法对不同生产厂家、不同生产批次、不同生产工艺条件下得到的注射用头孢他啶，均能实现对其中的多种杂质的同时分离，并且分离效果不受其他未知杂质的影响，测试得到的分离效果显著。

对比例1～3

参照对比文件的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的12种已知杂质进行分离检测。

对比文件1：孙雪奇,王野,刘峥,刘华,罗慧萍,袁军,胡昌勤.注射用头孢他啶杂质.研究药物分析杂志Chin J Pharm Anal,2012,32(12):2234-2239.

对比文件2：苑华,张冬,黄亚龙,常旸.梯度洗脱HPLC法检查头孢他啶原料药中的有关物质.中国药房China Pharm,2013,24(45):4286-4288.

对比文件3：CN114047271A一种注射用头孢他啶制剂中有关物质的检测方法。

表8本申请与对比文件杂质对比

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表9本申请与对比文件色谱条件对比

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参照对比文件1、对比文件2和对比文件3的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的12种已知杂质进行分离检测，结果如下所示

结论：

通过分离结果可知，在对比文件1和对比文件2的检测条件下，杂质5与杂质6之间的分离度分别为1.14和1.02，远远低于本发明实施例的各杂质特征分的分离效果1.5；并且对比文件1和对比文件2检测条件下，其杂质5的特征峰强度太低，信噪比均小于50，相较于本发明实施例的信噪比(106)，降低了一半以上，因此无法分离出杂质5的特征峰，不能实现杂质5的检出。

与此同时，采用对比文件3的检测条件和检测方法，也无法实现本发明注射用头孢他啶中的12中杂质的同时分离。

综上所述，由上述结果可知，采用的分离检测条件12种已知杂质特征峰的分离度均大于1.5，各杂质的特征峰之间不存在相互干扰，分离度良好，专属性强；

采用本发明方法进行检测，定量限和检测限都呈现显著降低的趋势：检测的杂质定量限低至0.1432μg/mL，相当于杂质限度浓度的二十分之一以下；检测限低至0.0358μg/mL，相当于杂质限度浓度的八十四分之一以下，检测灵敏度良好；相较于一般标准要求的最低检测限(μg级别)降低了2个数量级，检测灵敏度显著提升；

在限定浓度范围内，头孢他啶与杂质1～12的特征吸收峰面积与其对应浓度之间表现出良好的的线性关系，线性方程的线性相关系数r＞0.999；最优达到了1.0000，相较于一般标准要求的线性相关系数r＞0.99，测定的准确性提高了2个数量级；其检测方法的准确性更高，测定范围更广；

上述12种已知杂质回收率均保持在95％～104％之间，RSD均小于2.3％，远小于各杂质标准检测要求(RSD<5％)，准确度提高2倍以上，方法准确度良好；

本发明检测方法对平行样品进行重复性检测，12种已知杂质的检测结果的极差均小于0.05％，表现出良好的可重复性；

改变色谱条件和色谱柱批次，注射用头孢他啶中各已知杂质的检出量均无明显变化，杂质1、杂质3～11均可检出，各已知杂质检测结果绝对值均小于0.1％，表现出良好且显著的耐用性。

本发明所采用的检测注射用头孢他啶中12种已知杂质的方法为最优分离方法，可准确地对注射用头孢他啶的检出杂质进行定量质控，从而最终保证药品安全、有效且质量可控。采用的高效液相色谱方法专属性强，灵敏度高，能够对注射用头孢他啶的12种杂质准确定量测定。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种注射用头孢他啶中杂质的分离检测方法，所述检测方法包括如下步骤：配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的杂质进行检测；

色谱条件包括：

色谱柱：Waters

T3 C18；

流动相：

流动相A为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH为3.3～3.5；所述磷酸盐缓冲液制备方法如下：取十二水合磷酸氢二钠3.6g与磷酸二氢钾1.4g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸溶液调节pH；

流动相B为乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱，洗脱梯度如下表：

保留时间/min 流动相A/％ 流动相B/％ 0 100 0 5 96 4 8 96 4 16 89 11 26 84 16 29 80 20 44 50 50 48 20 80 49 100 0 55 100 0

所述注射用头孢他啶的杂质及结构式如下：

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2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为3.4。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5.0μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，色谱条件的检测波长为252～256nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，色谱条件的检测波长为254nm。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，色谱柱的柱温为40℃。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，色谱柱的柱流速1.2～1.4mL/min。

8.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，色谱柱的柱流速为1.3mL/min。

9.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，溶液配制：

供试品溶液：称取注射用头孢他啶，加稀释剂溶解，作为供试品溶液；

混合杂质对照品溶液：称取头孢他啶及杂质1～12对照品，加稀释剂溶解并稀释，作为混合杂质对照品对照溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，所述稀释剂是乙腈水溶液。

11.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，溶液配制还包括：

杂质定位溶液：分别取杂质1～12对照品，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL溶剂中3μg杂质的溶液，分别作为杂质1～12定位溶液。

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