CN115444821A - 一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用 - Google Patents

一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用。本发明提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体(简称“Ginposome‑VCR”)，其包括如下质量份数的组分：5‑20份磷脂、0.05‑2份PEG‑DSPE、0.1‑4份人参皂苷、1份长春新碱盐。本发明的人参皂苷长春新碱脂质体对肿瘤细胞的具有靶向作用和增效减毒。

Description

一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用。
背景技术
脂质体是一种定向载药系统，属于靶向给药系统的一种特殊剂型，它可以将药物包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构中双分子层微小囊泡，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在靶向组织中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
CN201610693884.2、CN201811447245.3和CN201811447243.4等三篇专利都公开了以“被动载药“即”薄膜蒸发法”为主，制备以人参皂苷为膜材的脂质体在包载紫杉醇等化疗药物之后，其相关脂质体质量稳定、药效显著等技术优势。
CN200380104235.5和CN200380104175.7等专利公开了一种以磷脂和胆固醇为膜材，以硫酸铵等为梯度的脂质体主动载药的制备方法。
CN201811532448.2，CN201811552395.0等专利公开了一种以磷脂和胆固醇为膜材，以蔗糖八硫酸酯三乙胺为梯度的脂质体主动载药方法。
CN201811305299.6公开了一种以磷脂和胆固醇为膜材，以甲基磺酸铵、4-羟基苯磺酸铵、甲基磺酸三乙胺、4-羟基苯磺酸三乙胺；乙二磺酸铵、丙二磺酸铵、乙二磺酸三乙胺、丙二磺酸三乙胺等为梯度的脂质体主动载药方法。
吴溪，李文静等，正交试验优化硫酸长春新碱脂质体的制备工艺，现代药物与临床，第30卷第6期，2015年6月。该文献公布了以pH梯度法制备长春新碱脂质体的最佳工艺条件，其中，氢化磷脂：胆固醇＝5：2，药物：空白脂质体＝1：20(质量比)，内水相为pH＝4.0枸橼酸缓冲溶液，外水相为pH＝7.2的Na2HPH4缓冲溶液，在60～65℃下水化或孵育，孵育时间30min，可得粒径在110-120nm，包封率≥95％的长春新碱脂质体。但上述方法制备得到的长春新碱脂质体没有主动靶向性、药效学和毒性都较高。
现有技术中，尚未发现用主动载药法制备的“以人参皂苷取代胆固醇作为双分子膜的共载脂质体”。
因此，如何选择一个最佳的复方药物配伍，如何制定最佳的制备工艺，以便生产出一种药效更好、毒性更低，质量和其他指标都能符合药品要求的人参皂苷长春新碱脂质体，以便符合药品申报要求，需要大量的研究工作和技术攻关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的长春新碱脂质体种类较为单一，而提供一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用。本发明的长春新碱脂质体的性质稳定、粒径小、药物包封率高、体内相容性良好、体内释药良好、药效更好和毒性更低。此外，本发明人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法易于实现，利于产业化；可以实现制备工艺与产品性能结合的优化。
本发明提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体(简称“Ginposome-VCR”)，其包括如下质量份数的组分：5-20份磷脂、0.05-2份PEG-DSPE、0.1-4份人参皂苷、1份长春新碱盐。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中，所述的人参皂苷与所述的磷脂形成磷脂膜。
在本发明的某一方案中，较佳地，所述的磷脂膜还包括PEG-DSPE。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中还包括盐溶液。
在本发明的某一方案中，较佳地，所述的磷脂膜的内侧为内水相，所述的磷脂膜的外侧为外水相；所述的长春新碱盐被包封于所述的内水相中；所述的长春新碱为不溶于水的所述的长春新碱盐；较佳地，所述的内水相为盐溶液。
在本发明的某一方案中，所述的内水相为盐溶液。
在本发明的某一方案中，所述的外水相可为生理等渗溶液；例如生理等渗溶液优选为5％葡萄糖水溶液或10％蔗糖水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的长春新碱盐可为硫酸长春新碱通过pH梯度法与盐溶液进行离子交换得到的长春新碱盐(其中硫酸长春新碱中的长春新碱与所述的盐溶液中的阴离子形成所述的长春新碱盐)；所述的盐溶液可为磺酸盐水溶液或蔗糖八硫酸酯盐水溶液；较佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液、甲基磺酸三乙胺水溶液、乙二磺酸铵水溶液、丙二磺酸铵水溶液、乙二磺酸三乙胺水溶液或丙二磺酸三乙胺水溶液；更佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液或乙二磺酸三乙胺水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的盐溶液与所述的硫酸长春新碱的体积质量比可为66.7～200mL/g，例如100mL/g。
在本发明的某一方案中，所述的长春新碱盐可为硫酸长春新碱、蔗糖八硫酸酯长春新碱、甲基磺酸长春新碱、甲基磺酸长春新碱、乙二磺酸长春新碱、丙二磺酸长春新碱、乙二磺酸长春新碱或丙二磺酸长春新碱；更佳地，所述的长春新碱盐为蔗糖八硫酸酯长春新碱、甲基磺酸长春新碱或乙二磺酸长春新碱；例如蔗糖八硫酸酯长春新碱。
在本发明的某一方案中，所述的硫酸长春新碱溶液的浓度为5～20mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL或20mg/mL；优选地为10～15mg/mL。
在本发明的某一方案中，所述的盐溶液的浓度为0.05M-0.975M；例如0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.325M、0.65M、0.975M或0.16M。
在本发明的某一方案中，当所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.05M-0.1M；例如0.05M或0.1M。
在本发明的某一方案中，当所述的盐溶液为乙二磺酸三乙胺水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.16M-0.65M；例如0.2M、0.3M、0.325M、0.65M或0.16M。
在本发明的某一方案中，当所述的盐溶液为甲基磺酸铵水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.325M-0.975M；例如0.325M、0.65M或0.975M。
本发明中，所述的PEG-DSPE的全称为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；所述PEG-DSPE为PEG2000-DSPE。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂选自氢化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和脑磷脂中的一种或多种；较佳地，所述的磷脂为氢化磷脂或蛋黄卵磷脂。
在本发明的某一方案中，所述的硫酸长春新碱与所述的磷脂的质量比可为1:(10～20)；例如，所述的硫酸长春新碱与磷脂的质量比为1:10、1:12、15:1或1:20。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷为选自20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷伪GQ和人参皂苷Rk1中的一种或多种，较佳地，所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1。
在本发明的某一方案中，所述人参皂苷的HPLC纯度≥99％。
在本发明的某一方案中，所述的硫酸长春新碱与所述的人参皂苷的质量比可为1:(0.1～1)；例如所述的硫酸长春新碱与所述的人参皂苷Rg3的质量比为1:0.1、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1：2、1:3或1:4。
在本发明的某一方案中，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比可为1:(0.1～5)；例如，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:0.0.5、1:0.1、1:0.25、1:0.5、1:1或1：2。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂的质量分数为10份。
在本发明的某一方案中，所述的PEG-DSPE的质量分数为0.5份。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷的质量分数为1份。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体还包括水。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体不包括胆固醇。
在本发明的某一方案中，长春新碱脂质体中，所述的磷脂、所述的PEG-DSPE、所述的人参皂苷和所述的长春新碱的质量分由于制备过程的损失和工艺的差别存在约10％的误差。
本发明还提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1、将磷脂溶解于溶剂中，加入盐溶液进行水化，得到溶液A1；
步骤2、其为方案1、方案2或方案3；
方案1(高压均质法)包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A2a；
方案2(挤出法)包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1，分别依次通过各孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A2b；
方案3(超声法)包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1进行超声处理，得到溶液A2c；
步骤3、将所述的步骤2中得到的溶液A2a、A2b或A2c在含有所述的生理等渗溶液的透析袋中进行透析，得到溶液A3；
步骤4、将步骤3得到的所述的溶液A3与硫酸长春新碱的水溶液混合，得到A4脂质体；
步骤5、将步骤4得到的所述的A4脂质体与所述的人参皂苷在乙醇中混合，得到A5脂质体。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法还包括如下步骤：将步骤5得到的所述的A5脂质体和PEG-DSPE分散在生理等渗溶液中，得到所述的人参皂苷长春新碱脂质体。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂的用量和种类如前所述。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷的用量和种类如前所述。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的溶剂为本领域此类反应的常规溶剂；较佳地，所述的溶剂为乙醇；例如无水乙醇。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的磷脂与所述的溶剂的质量体积比为1g/1～10mL，例如1g/2mL。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的盐溶液可为硫酸盐水溶液、磺酸盐水溶液或蔗糖八硫酸酯盐水溶液；所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液、甲基磺酸三乙胺水溶液、乙二磺酸铵水溶液、丙二磺酸铵水溶液、乙二磺酸三乙胺水溶液或丙二磺酸三乙胺水溶液。较佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液或乙二磺酸三乙胺水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，较佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯盐水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，较佳地，所述的盐溶液可为0.1-0.65mol/L，例如0.1mol/L、0.325mol/L或0.65mol/L。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，较佳地，所述的盐溶液为0.1mol/L蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液，0.325mol/L硫酸铵水溶液(二价盐)，0.65mol/L甲基磺酸铵水溶液(一价盐)。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，较佳地，所述的水化的温度为55-65℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，较佳地，所述的水化的时间与反应规模相关，所述的水化以溶液均一即可，例如10-4小时，例如10分钟。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的水化为在旋蒸瓶中进行，转速为40～60rp/min，例如50rp/min。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质为在均质机中使用-5～10℃冷冻水冷切循环；较佳地，所述的高压均质为在均质机中使用5～10℃冷冻水冷切循环。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质的压力在800-1500bar之间，例如1200bar。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质的次数可为3-4次，例如4次。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的温度为35-45℃，例如40℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案2中，所述挤出板的孔径为800nm，400nm，200nm，100nm。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的压力为600～800psi；例如800psi。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的次数可为4-10次，例如4次。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案2中，所述的溶液A1，分别依次通过孔径分别为800nm、400nm、200nm、100nm的聚碳酯膜过滤板。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2的方案3中，所述的超声在600W下超声。较佳地，所述的超声为25次；更佳地，所述的超声为开5秒，停5秒。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3中，所述的透析袋的截留分子量为8000～15000；例如，10000。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3中，所述的等渗溶液为5％葡萄糖或10％蔗糖水溶液。
在本发明的某一方案中，步骤3中，所述的溶液A2a、A2b或A2c与所述的等渗溶液的体积比为1:1000。
在本发明的某一方案中，步骤3中，所述的透析的温度为0-10℃，例如4℃。
在本发明的某一方案中，步骤3中，所述的透析的时间以完全去除所述的溶液A2a、A2b或A2c脂质体中外水相中的所述的盐溶液，较佳地，所述的透析的时间为10-18小时，例如12小时。
在本发明的某一方案中，所述的步骤4中，将步骤3得到的所述的溶液A3与所述的硫酸长春新碱水溶液，按照体积比为1：1混合，并于50-60℃水浴中孵育40分钟，即得长春新碱脂质体。具体地，该脂质体内水相为酸根长春新碱不溶盐，该脂质体外水相为等渗溶液。
在本发明的某一方案中，所述的步骤4中，所述的硫酸长春新碱溶液的浓度为5～20mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL或20mg/mL，优选地为10～15mg/mL。
在本发明的某一方案中，所述的步骤5中，将所述的人参皂苷得乙醇溶液缓慢加入到步骤4中的长春新碱脂质体溶液，搅拌，挥发除去大部分乙醇，然后再置于透析袋中透析，以上述步骤3相同的等渗溶液作为透析介质。
在本发明的某一方案中，所述的步骤5中，所述的人参皂苷乙醇溶液的浓度为5～20mg/mL，例如10mg/mL。
在本发明的某一方案中，所述的步骤5中，所述的搅拌时间为30-60分钟，例如45分钟。
在本发明的某一方案中，所述的步骤5中，所述的透析袋的截留分子量为8000～15000，例如，截留分子量为10000。
在本发明的某一方案中，步骤5中，所述的透析的温度为0-10℃，例如4℃。
在本发明的某一方案中，步骤5中，所述的透析的时间以完全去除乙醇盐溶液、未包裹的硫酸长春新碱和人参皂苷为准，较佳地，所述的透析的时间为10-18小时，例如12小时。
在本发明的某一方案中，步骤6中，将PEG-DSPE，溶于步骤3相同的生理等渗溶液中，然后加入到步骤5得到的所述的A5脂质。
在本发明的某一方案中，所述的步骤6中，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比可为1:(0.1～5)；例如，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:0.0.5、1:0.1、1:0.25、1:0.5、1:1或1：2。
在本发明的某一方案中，所述的步骤6中，所述的PEG-DSPE浓度为1-20mg/mL，例如10mg/mL。
所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法还可进一步包括除菌过滤和灌装步骤。所述的除菌过滤和所述的灌装的条件和操作均可为本领域该类工艺中常规的条件和操作。例如，除菌过滤步骤中，采用0.22μm滤膜过滤所述的脂质体。灌装步骤中，灌装于10mL或20mL西林瓶中、压盖和包装。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中不包括胆固醇。
本发明还提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体，其由如上所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的原料包括如下质量分数的组成：5-20份磷脂、0.05-2份PEG-DSPE、0.1-4份人参皂苷、1份硫酸长春新碱。
在本发明的某一方案中，较佳地，所述的人参皂苷长春新碱脂质体由前述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法制备得到。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂、所述的PEG-DSPE和所述的人参皂苷的定义和质量分数如前述所述。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的原料还包括生理等渗溶液和/或盐溶液。
在本发明的某一方案中，所述的盐溶液可为磺酸盐水溶液或蔗糖八硫酸酯盐水溶液；较佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液、甲基磺酸三乙胺水溶液、乙二磺酸铵水溶液、丙二磺酸铵水溶液、乙二磺酸三乙胺水溶液或丙二磺酸三乙胺水溶液；更佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液或乙二磺酸三乙胺水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的生理等渗溶液优选为5％葡萄糖水溶液或10％蔗糖水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％。
本发明还提供了一种脂质体组合物，其包含葡萄糖水溶液和前述的人参皂苷长春新碱脂质体。
在本发明的某一方案中，所述的葡萄糖水溶液为5％葡萄糖水溶液。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体溶液中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的包封率≥80％。
本发明还提供了一种人参皂苷长春新碱脂质体在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用；所述的物质A为如上所述的人参皂苷长春新碱脂质体或为如上所述的人脂质体组合物。
在本发明的某一方案中，所述的应用中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％。
在本发明的某一方案中，所述的应用中，所述人参皂苷的纯度≥99％。
所述的癌症可为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌中的一种或多种。
术语“粒径D90”是指一个样品的累计粒度分布百分数达到90％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占90％。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的人参皂苷长春新碱脂质体对肿瘤细胞具有靶向作用和增效减毒。以实施例中人参皂苷Rg3长春新碱脂质体为例，药效显著优于胆固醇长春新碱脂质体；说明了Rg3在人参皂苷Rg3长春新碱脂质体中起到了更好的“药物、辅料、膜材、靶头”等多种作用。具体地：
(1)药效显著提高。尤其是Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp组、Rg3(1.5)-VCR-PEG/Lp组、Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp和Rh2(1.0)-CPT-PEG/Lp组药效最优，其中，Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp、Rg3(1.5)-VCR-PEG/Lp和Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp的高剂量组(1mg/kg)在第28天，肿瘤抑制率(8-10％)，比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)和Rg3胆固醇长春新碱脂质体(C-Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp)在第28天的肿瘤抑制率(34％和26％)具有显著性优效。同时，该三组实验组的中剂量组(0.75mg/kg)第28天的抑瘤率为14-17％，比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)和Rg3胆固醇长春新碱脂质体(C-Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp)的高剂量组(1mg/kg)第28天抑瘤率(34％和26％)更优，显示出本发明Rg3长春新碱脂质体对传统长春新碱脂质体在药效学上显著优势。
(2)Glut1靶向性显著提高。在荷瘤鼠的Glut1靶向性实验中，所述的人参皂苷脂质体的Glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了4倍以上。
(3)毒副作用显著降低。按本发明的处方制备的脂质体，Rg3长春新碱脂质体(Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp组和Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp组)和Rh2长春新碱脂质体(Rh2(1.0)-VCR-PEG/Lp组和Rh2(2.0)-VCR-PEG/Lp组)在6mg/kg未见死亡，12mg/kg死亡0/6或1/6，24mg/kg时死亡3/6或4/6；而普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)在3mg/kg未见死亡，6mg/kg死亡5/6，12mg/kg全部死亡。说明Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的LD50在12-24mg/kg，胆固醇长春新碱脂质体LD50在3-6mg/kg，显示人参皂苷脂质体比胆固醇脂质体的急性毒性显著性降低。
(4)本发明的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实验药物和器材
实验药物：20(S)-人参皂苷Rg3(简称：Rg3)、人参皂苷伪Rg3(简称：伪Rg3)、人参皂苷Rp1(简称：Rp1)、人参皂苷伪GQ(简称：伪GQ)、人参皂苷Rk1(简称：Rk1)、人参皂苷Rg5(简称：Rg5)、20(S)-人参皂苷Rh2(简称：Rh2)、人参皂苷Rk2(简称：Rk2)、20(S)-人参皂苷Rg2(简称：Rg2)、20(S)-人参皂苷Rh1(简称：Rh1)、20(S)-原人参二醇(简称：PPD)、20(S)-原人参三醇(简称PPT)、硫酸长春新碱等为本领域常规市售可得，例如上海本素医药科技有限公司、上海金和生物制药有限公司、上海源叶生物科技有限公司等。
本发明所述的人参皂苷分子结构式如下：
Figure BDA0003108673440000081
Figure BDA0003108673440000091
试验仪器：下述实施例中所使用的仪器为上海本素医药科技有限公司、复旦大学药学院自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下：
安捷伦液相色谱：安捷伦1100一套，奥泰3300ELSD，安捷伦科技(中国)有限公司；
旋蒸蒸发仪：ZX98-1 5L，上海鲁伊工贸有限公司；
超声波清洗机(SB3200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
氮吹仪(HGC-12A，天津市恒奥科技发展有限公司)；
探头超声仪(JYD-650，上海智信仪器有限公司，中国)；
高压均质机(B15，加拿大AVESTIN)；
微型挤出器(Mini-extruder，Avanti Polar Lipids Inc)；
激光粒度分析仪(Nano ZS,英国马尔文公司)；
马尔文粒度仪Malvern Nanosizer ZS90(英国马尔文公司)；
酶标仪(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)；
酶标仪(Infinitie 200，瑞士Tecan Trading Co.，Ltd)；
流式细胞仪(BD Biosciences，USA)；
流式细胞仪(CytoFlex S，Beckman Coulter，Inc.，USA)；
倒置荧光显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
荧光显微镜观察(Zeiss LSM 710，Oberkochen，Germany)；
激光共聚焦显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
共聚焦活体显微镜(Confocal intravital microscopy,IVM)；
正置双光子显微镜(DM5500 Q；Nikon)；
小动物活体光学成像系统(in vivo imaging system,IVIS)(PerkinElmer，USA)；
生物大分子相互作用仪BiaCore T 200仪器(GE，USA)；
洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)；
20L旋转蒸发仪：R5002K，上海夏丰实业有限公司；
冷冻干燥机：FD-1D-80，上海比朗仪器制造有限公司；
冷冻干燥机：PDFD GLZ-1B，上海浦东冷冻干燥设备有限公司；
电子天平：CPA2250(精度0.00001g)，赛多利斯(上海)贸易有限公司；
电子天平：JY3003(精度0.001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
光电显微镜(XDS-1B，重庆光电仪器有限公司)；
细胞培养箱(CCL-170B-8，新加坡ESCO)。
动物和细胞株
动物：BALB/c裸小鼠，鼠龄3-4周，中科院上海药物研究所生产。
肿瘤细胞株：
乳腺癌原位瘤4T1细胞株，复旦大学药学院提供
K562人白血病细胞，购自江苏凯基生物技术股份有限公司
SU-DHL6淋巴癌细胞，购自江苏凯基生物技术股份有限公司
乳腺癌MCF-7细胞株，购自江苏凯基生物技术股份有限公司
硫酸长春新碱含量检测方法：
1)色谱条件：C18色谱柱(Kromasil C18，250×4.6mm，5μm)
2)流动相：二乙胺磷酸缓冲溶液(1.0mL二乙胺溶于60mL水中，用磷酸调pH＝7.0)：甲醇＝60：140(体积比)。
3)检测波长：298nm，流速1.2mL/min，柱温35℃，进样量20μL。
4)计算：记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中硫酸长春新碱的含量。
人参皂苷含量检测方法：
1)色谱条件：Kromasil 100-3.5C4 150mm×4.6mm色谱柱。
2)流动相：乙腈：水＝55:45。
3)检测波长：203nm，流速1mL/min，柱温35℃，进样量10μL。
4)计算：记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中Rg3的含量。
长春新碱(或人参皂苷)包封率检测方法：
取2份待检测脂质体样品各0.5mL，一份用阳离子交换树脂柱吸附5min，去离子水洗脱，收集流出液于25mL容量瓶中，破膜剂破膜后，去离子水定容，HPLC检测得到药物浓度为V1；另一份于25mL容量瓶中，去离子水定容，HPLC法检测药物浓度为V0。包封率＝V1/V0×100％。
简称：硫酸长春新碱(VCR)，氢化磷脂(HSPC)，胆固醇(Cho)，20(S)-人参皂苷Rg3(Rg3)，20(S)-人参皂苷Rh2(Rh2)。
实施例1：人参皂苷空白脂质体在各种离子型水溶液中的稳定性研究
称取处方量的HSPC、人参皂苷，超声溶解于1mL氯仿中，减压浓缩至干，加入10mL水化溶液，水化10分钟，然后超声25次(600W，开5秒，停5秒)，得到各实验组的空白脂质体，检测外观和包封率。
3)实验结果：
Figure BDA0003108673440000111
结果分析：人参皂苷脂质体在纯化水、糖类等中性溶液中稳定，但在离子型水溶液中不稳定，即：
1)传统被动载药法制备的空白人参皂苷脂质体不适用于传统主动载药法制备离子型药物脂质体，例如，盐酸伊立替康、硫酸长春新碱等。
2)传统的pH梯度法，无法用于制备以人参皂苷为膜材的长春新碱脂质体；
3)传统的硫酸铵梯度法，无法用于制备以人参皂苷为膜材的长春新碱脂质体；
实施例2传统主动载药法中磷脂用量对长春新碱包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000112
Figure BDA0003108673440000121
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，药脂比(HSPC/药物)对包封率具有较大影响，当药脂比≥10时，包封率没有显著差异。因此，本发明优选药脂比5-20的磷脂比例。
实施例3传统主动载药法中胆固醇用量对长春新碱包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000122
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，胆固醇可提高脂质体稳定性并提高长春新碱的包封率。当胆固醇/药物≥1.5时，胆固醇的数量对包封率无显著差异。
实施例4传统主动载药法中Rg3用量对长春新碱包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000123
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，HSPC和Rg3同步成膜，然后离子型水溶液水化、5％葡萄糖水透析和载药，无法制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体。
实施例5传统主动载药法中胆固醇用量对Rg3脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000124
Figure BDA0003108673440000131
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，HSPC、Rg3和胆固醇先同步成膜，然后离子型水溶液水化、5％葡萄糖透析，得到Rg3脂质体，该工艺制备的脂质体的Rg3包封率低，离子型水溶液造成了Rg3泄露。
实施例6传统主动载药法中胆固醇用量对Rg3脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000132
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，在透析之后外水相为5％葡萄糖时，Rg3作为药物载入脂质体，Rg3的包封率合格，其中胆固醇的用量对Rg3包封率的影响不大。通过效果实施例1：Glut1的细胞摄取实验中的C6-C-Rg3(后)/Lp组的靶向性实验结果显示：该组的Glut1介导的靶向性差，显示Rg3的葡萄糖基未暴露在脂质体表面，因此Rg3应被包裹于脂质体的内腔中。
实施例7传统主动载药法中Rg3和长春新碱同步载入实验
Figure BDA0003108673440000133
Figure BDA0003108673440000141
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，在不同比例的Rg3和胆固醇用量下，所述的空白脂质体的内水相为蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液，外水相为5％葡萄糖溶液，Rg3和长春新碱为药物，同步载入，长春新碱和Rg3的包封率都不合格。离子型水溶液同时影响了Rg3和硫酸长春新碱的包封率。
实施例8传统主动载药法中先载Rg3再载长春新碱对包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000142
Figure BDA0003108673440000151
结果分析：采用传统主动载药法中的乙醇注入法，采用了不同比例的Rg3和胆固醇比例，在透析之后，所述的空白脂质体的内水相为蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液，外水相为5％葡萄糖溶液，先载入Rg3，再载入硫酸长春新碱，所制备的Rg3长春新碱共载脂质体的包封率都不合格。
实施例9不同制备方法对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000152
Figure BDA0003108673440000161
结果分析：
1)被动载药(薄膜法)无法制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体；
2)普通主动载药法无法制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体；
3)普通主动载药法，先载Rg3再载长春新碱，或Rg3与长春新碱同步载入，无法制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体；
4)普通主动载药法，先载长春新碱再Rg3，可制备得到合格的Rg3长春新碱共载脂质体。利用该方法制备的脂质体，经本发明应用实施1：Glut1的细胞摄取实验，C6-Rg3(后)-VCR/Lp组实验结果表明：利用该方法制备的Rg3脂质体具有显著的Glut1介导的主动靶向作用，证明Rg3是嵌入在磷脂双分子膜中，其中Rg3分子中的葡萄糖基(Glc)裸露在脂质体外表面。
实施例10 Rg3用量对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000171
结果分析：
1)采用上述的乙醇注入法，可制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体，具体地，该脂质体的内水相为蔗糖八硫酸酯长春新碱盐，该脂质体的外水相为5％葡萄糖等渗溶液，该脂质体的双分子膜为氢化磷脂和Rg3，其中Rg3分子中的葡萄糖基(Glc)裸露在脂质体外表面，该脂质体膜材中不含胆固醇。
2)所述的Rg3长春新碱脂质体，当HSPC:Rg3:VCR＝10:0.1～4:1时，Rg3和长春新碱的包封率良好。随着Rg3用量上升，Rg3和长春新碱的包封率急剧下降。
3)本发明Rg3的使用范围为HSPC：Rg3：VCR＝10:0.1～4:1。
实施例11不同盐对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000172
Figure BDA0003108673440000181
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，蔗糖八硫酸酯三乙胺、甲基磺酸铵、甲基磺酸三乙胺、乙二磺酸铵、丙二磺酸铵、乙二磺酸三乙胺和丙二磺酸三乙胺、枸橼酸缓冲溶液均能满足Rg3长春新碱脂质体的制备，包封率都合格。
实施例12不同盐浓度对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000182
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，1)蔗糖八硫酸酯三乙胺浓度低于0.05M时，将包封率不能满足的工艺要求；当浓度≥0.1M时，包封率无显著差别。2)乙二磺酸三乙胺浓度低于0.16M时，包封率无法满足工艺要求；浓度在0.32M和0.65M时，包封率无显著差别。3)甲基磺酸铵浓度低于0.325M时，包封率无法满足工艺要求；浓度在0.65M和0.975M时，包封率无显著差别。
实施例13不同人参皂苷对皂苷长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000183
Figure BDA0003108673440000191
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，20(S)-Rg3、20(S)-Rh2、Rg5、Rk1、Rp1、伪Rg3、伪GQ和PPD等皂苷制备的共载脂质体，其包封率符合质量要求；而20(R)-Rg3和PPT等皂苷制备的共载脂质体，其包封率不符合质量要求。
实施例14不同均质方法对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000192
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，在粒径控制的三个常用方法(超声法、高压均质法、推挤过膜法)，均能符合工艺要求。
实施例15不同磷脂对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000193
Figure BDA0003108673440000201
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，氢化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和脑磷脂所制备的Rg3长春新碱共载脂质体的包封率符合药品申报要求，PEG-DSPE不符合要求。
实施例16不同长春新碱浓度对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000202
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，在药物浓度为5～20mg/mL时，包封率都合格，特别是药物浓度为10-15mg/mL时最佳。当药物浓度低于5mg/mL，包封率不合符药品质量要求。
实施例17不同生理等渗溶液对Rg3长春新碱共载脂质体包封率的影响实验
Figure BDA0003108673440000203
结果分析：采用本发明的乙醇注入法，5％葡萄糖和10％蔗糖水溶液对Rg3和长春新碱包封率无显著差别，0.9％生理盐水不适用。
实施例18Rg3长春新碱脂质体的制备
1.处方：HSPC 10g，Rg3 1g，硫酸长春新碱1g，无水乙醇适量，5％葡萄糖注射液适量，注射用水适量，0.1M蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液适量。
2.操作方法：
步骤(1)：成膜和水化
称取处方量的HSPC，溶于20mL无水乙醇中，加入100mL 0.1M的蔗糖八硫酸酯三乙胺，55～60℃水化10分钟，挥发除去大部分乙醇，制备得到内外水相均是蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液的空白脂质体粗品；
步骤(2)：推挤过膜
将步骤(1)的空白脂质体溶液在压力600-800psi，依次通过孔径分别为800nm、400nm、200nm、100nm的聚碳酯膜过滤板各4次，最终得到粒径小于100nm内外水相均是蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液的空白脂质体。
步骤(3)：透析
将步骤(2)的空白脂质体置于截留分子量为10000的透析袋中，以5％葡萄糖水溶液作为透析介质，4℃透析12小时，样品与透析介质体积比为1：1000，透析期间每4小时更换1次透析液，完全去除空白脂质体外水相中的硫酸铵，得到由5％葡萄糖组成的外水相由蔗糖八硫酸酯三乙胺为内水相的空白脂质体。
步骤(4)：载入长春新碱
将步骤(3)中的空白脂质体与浓度为10mg/mL的硫酸长春新碱水溶液，按照体积比为1：1混合，并于50-60℃水浴中孵育40分钟，即得长春新碱脂质体。具体地，该脂质体内水相为蔗糖八硫酸酯长春新碱不溶盐，该脂质体外水相为5％葡萄糖水溶液。
步骤(5)：嵌入Rg3
将100mL 10mg/mL的Rg3乙醇溶液于20-30℃下，缓慢加入到步骤(4)的长春新碱脂质体溶液，搅拌30分钟，挥发除去大部分乙醇，然后再置于截留分子量为10000的透析袋中，以5％葡萄糖水溶液作为透析介质，4℃透析12小时，样品与透析介质体积比为1：1000，透析期间每4小时更换1次透析液，完全去除乙醇溶剂、无机盐、未包裹的硫酸长春新碱和Rg3，即得Rg3长春新碱脂质体。
步骤(6)：添加PEG-DSPE
准确称取0.2g PEG-DSPE，溶于300mL5％葡萄糖中，然后加入到步骤(5)的Rg3长春新碱脂质体溶液，得到长春新碱和Rg3浓度都是约2mg/mL的Rg3长春新碱脂质体溶液。
步骤(7):除菌过滤
将步骤(6)的Rg3长春新碱脂质体过0.22μm滤膜。
步骤(8)：灌装
将步骤(7)溶液灌装于10mL或20mL西林瓶中，压盖，包装，即得。
经检测，上述脂质体，长春新碱浓度＝4.49mg/mL，Rg3浓度＝4.53mg/mL，粒径D90＝101nm，Rg3包封率＝98.89％，长春新碱包封率＝97.82％。
实施例19 PEG-DSPE用量对Rg3长春新碱共载脂质体稳定性的影响
制备方法：取上述实施例18步骤(5)的Rg3长春新碱脂质体溶液，然后按本实施例处方加入不同浓度的PEG-DSPE水溶液，其他后续步骤同实施例18，然后将各处方制剂置于2-8℃冰箱，考察脂质体溶液的稳定性。
Figure BDA0003108673440000211
Figure BDA0003108673440000221
结果分析：
1)未添加PEG-DSPE，Rg3长春新碱脂质体在2-8℃保存3个月后，粒径快速上升，Rg3和长春新碱的泄漏率明显上升；
2)当PEG-DSPE/HSPC≤0.025时，在2-8℃保存3个月后，Rg3长春新碱脂质体的粒径显著上升，包封率显著下降，不合格稳定性质量要求。其中，PEG-DSPE/HSPC＝0.025，3个月的稳定性数据可接受。
3)当PEG-DSPE/HSPC≥0.025时，在2-8℃保存3个月后，Rg3长春新碱脂质体的粒径稳定、Rg3和长春新碱的包封率较稳定，符合药品申报要求。
4)当PEG-DSPE/HSPC≥0.05时，粒径和包封率没有显著差别。
5)本发明PEG-DSPE的保护范围为0.1～2。
应用实施例1：Glut1的细胞摄取实验
1)实验目的：通过对比载荧光素的Rg3脂质体和胆固醇脂质体在4T1细胞上的摄取来观察Rg3脂质体是否在肿瘤细胞上有更多的摄取；通过添加葡萄糖抑制剂等证明Glut1靶向机制；通过Glut1靶向验证本发明的人参皂苷位于磷脂双分子膜中，并且葡萄糖基裸露在脂质体外表面。
2)实验方法：为了比较4T1对各实验组的摄取，探讨脂质体的摄取机制，将4T1细胞按2×105的细胞密度接种于12孔板中，对于实验组+葡萄糖、实验组+根皮苷和实验组+槲皮素组，12小时后分别用20mM的葡萄糖溶液、根皮苷溶液和槲皮素溶液代替培养基。这三种溶质应在无葡萄糖培养基中溶解，孵育1小时后，加入各实验组药物(紫外荧光显色剂的浓度为100ng/ml)，孵育4小时后，消化，用新鲜PBS溶液洗涤，采用流式细胞仪进行分析。
3)实验组制备方法：所述操作条件同本发明实施例的操作条件。
方法1(被动载药)：将处方量的HSPC、人参皂苷和/或胆固醇、荧光探针(香豆素)和/或药物，溶于适量乙醇和氯仿的混合溶剂中(体积比1：1)，减压浓缩至干，纯化水水化，超声，然后按本应用实施例的实验方法检测荧光强度。
方法2(主动载药)：将处方量的HSPC、Rg3和荧光探针，超声溶解于适量乙醇中，加入0.325M硫酸铵溶液水化10分钟，然后超声25次(开5秒停5秒)，用5％葡萄糖溶液透析，再依次载入(和/或)药物，再次透析除去游离药物，(和/或)适量PEG-DSPE，得到各实验组的脂质体溶液，然后按本应用实施例的实验方法检测荧光强度。
方法3(主动载药)：将处方量的HSPC和荧光探针，超声溶解于适量乙醇中，加入0.325M硫酸铵溶液水化10分钟，然后超声25次(开5秒停5秒)，用5％葡萄糖溶液透析，再依次载入药物或Rg3，再次透析除去游离药物，(和/或)加入适量PEG-DSPE，得到各实验组的脂质体溶液，然后按本应用实施例的实验方法检测荧光强度。
Figure BDA0003108673440000231
Figure BDA0003108673440000241
实验结果1如下：
Figure BDA0003108673440000242
Figure BDA0003108673440000251
实验结论：
1)采用传统被动载药法(薄膜蒸发法)，靶向性实验数据证明：无法制备合格的Rg3长春新碱共载脂质体。
2)采用传统的主动载药法，具体地：
i)在透析之前加入Rg3，酸根溶液造成Rg3在脂质体中发生泄露，从而造成脂质体制备失败。
ii)在透析之后加入Rg3，可分两种情况：
a)Rg3在硫酸长春新碱之前加入，因药物产生的离子型溶液导致脂质体中的Rg3严重泄漏，从而脂质体制备失败；
b)Rg3在硫酸长春新碱之后加入，脂质体制备成功。
上述两个条件基本相同，两者先后顺序虽然不同，但都存在离子型溶液，却产生了不同的结果，机制尚不明确。
1)适量加入PEG-DSPE影响了Glut1介导的靶向性，提示PEG-DSPE的用量有限制。
2)本实验提示，本发明所述的Rg3长春新碱共载脂质体，须按实施例18相同或相似的方法制备。
实验结果2如下：
Figure BDA0003108673440000261
由上述结果此可见，随着Glut1底物和抑制剂的加入，C6-C/Lp的荧光强度无显著改变，但阻止了C6-Rg3/Lp的细胞摄取，证明人参皂苷Rg3脂质体通过与Glut1相互作用增强其摄取效率，从而证明Rg3位于脂质体的膜上，Rg3的葡萄糖基(Glc)裸露在脂质体表面。
应用实施例2：人乳腺癌(MCF-7)体内药效学研究
1)试验方法：将肿瘤细胞株(MCF-7)注入小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3(接种后7d)时，将小鼠随机分组(n＝8每组)治疗，每组尾静脉注射空白溶剂(5％葡萄糖，Blank)、普通胆固醇长春新碱脂质体注射剂组(C-VCR/Lp组)和各实验组，剂量按长春新碱计高中低三组(2mg、1mg、0.5mg)，每7天给一次药，持续到第28天，给药的同时测量肿瘤的长度、宽度和记录体重。计算肿瘤体积(V)的公式为:V＝(W2×L)/2。长度(L)为实体瘤的最长直径，宽度(W)是垂直于长度的最短直径。在第28天实验结束，所有动物均处死，取出肿瘤进行影像学和组织学检测。抑瘤率T＝(未给药组肿瘤-测试组肿瘤质量)/未给药组肿瘤质量。
备注：长春新碱+Rg3＝1mg/kg+1mg/kg，表示药物浓度，下同。
2)实验组如下：
Figure BDA0003108673440000262
3)试验结果如下：
Figure BDA0003108673440000263
Figure BDA0003108673440000271
结论：
1)质量比Rg3/VCR＝1.0、1.5和2.0，在药效学上，无显著差别。
2)Rg3长春新碱脂质体的体内药效学比C-VCR/Lp组和Rg3胆固醇长春新碱脂质体组(C-Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp)具有显著优效，其中，Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp、Rg3(1.5)-VCR-PEG/Lp和Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp的高剂量组(2mg/kg)在第28天，肿瘤抑制率(8-10％)，比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)和Rg3胆固醇长春新碱脂质体(C-Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp)在第28天的肿瘤抑制率(34％和26％)具有显著性优效。同时，该三组实验组的中剂量组(1mg/kg)第28天的抑瘤率为14-17％，比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)和Rg3胆固醇长春新碱脂质体(C-Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp)的高剂量组(2mg/kg)第28天抑瘤率(34％和26％)更优，显示出本发明Rg3长春新碱脂质体对传统长春新碱脂质体在药效学上显著优势。
K562人白血病细胞体内药效学研究
试验方法：将处于对数生长期的K562白血病细胞液，离心洗涤去除牛血清，用BMEM基础培养基，配制成1×106的细胞密度的混悬细胞液，然后向NOD/SCID小鼠的尾静脉注射上述细胞液0.5ml，以流式技术检测外周血的CD13的表达，以确定建模是否成功，建模成功，配制20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml不同浓度样品和对照组，尾静脉注射0.5ml(低、中、高给药剂量分别为：0.5mg/kg，1mg/kg，2mg/kg)，分别在0,5,10,15,20天注射给药，眼眶静脉取血；分别观察小鼠体重变化、生存时间、白细胞数量及CD13表达，21天处死小鼠。
用酶标仪在参考波长630nm，检测波长450nm条件下测定光密度值(OD)，以空白对照处理的肿瘤细胞为对照组计算存活率。
细胞存活率(％)＝OD450(样品)/OD450(对照)×100％；
其中，OD490(样品)为实验组的OD值，OD490(对照)为空白对照组的OD值。
备注：VCR+Rg3＝1mg/kg+1mg/kg，表示药物给药剂量，下同。
针对K562人白血病细胞体内药效学的研究数据如下。
项目 Blank C-VCR/Lp组 Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp Rh2(1.0)-VCR-PEG/Lp
给药剂量 / 2mg/kg 2mg/kg+2mg/kg 2mg/kg+2mg/kg
5天肿瘤抑制率 -31％ 43％ 22％ 25％
10天肿瘤抑制率 -35％ 29％ 9％ 12％
20天肿瘤抑制率 -48％ 20％ 4％ 3％
结果显示：
1)Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的药效学无显著差别；
2)Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的药效学比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)具有显著优效。
SU-DHL6淋巴癌细胞：根据上述体内药效学实验方法，针对SU-DHL6淋巴癌细胞体内药效学的研究数据如下。
项目 Blank C-VCR/Lp组 Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp Rh2(1.0)-VCR-PEG/Lp
给药剂量 / 2mg/kg 2mg/kg+2mg/kg 2mg/kg+2mg/kg
7天肿瘤抑制率 -26％ 59％ 41％ 37％
14天肿瘤抑制率 -35％ 51％ 34％ 29％
21天肿瘤抑制率 -52％ 42％ 19％ 21％
28天肿瘤抑制率 -77％ 36％ 11％ 10％
结果显示：
1)Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的药效学无显著差别；
2)Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的药效学比普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)具有显著优效。
应用实施例3：急性毒性(LD50)研究(SD大鼠)
1)实验方法：大鼠160～260g，6～9周龄，每组6只，给药方式：缓慢静推(约1mL/min)，给药频率：3次/天。
本试验供试品长春新碱剂量设置为3，6，12和24mg/kg/天，供试品中含Rg3根据处方剂量计算。同时设置溶媒对照组(5％葡萄糖注射液)、普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/Lp组)、Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp、Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp、Rh2(1.0)-VCR-PEG/Lp、Rh2(2.0)-VCR-PEG/Lp，缓慢静推(约1mL/min)，3次/天，每次给药间隔至少4h。
2)实验组制备方法：根据处方要求，依实施例18方法制备。
Figure BDA0003108673440000291
3)实验结果如下表：
Figure BDA0003108673440000292
通过以上实验显示，
1)Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的急性毒性无显著差别；
2)Rg3长春新碱脂质体(Rg3(1.0)-VCR-PEG/Lp组和Rg3(2.0)-VCR-PEG/Lp组)和Rh2长春新碱脂质体(Rh2(1.0)-VCR-PEG/Lp组和Rh2(2.0)-VCR-PEG/Lp组)在6mg/kg未见死亡，12mg/kg死亡0/6或1/6，24mg/kg时死亡3/6或4/6；而普通胆固醇长春新碱脂质体组(C-VCR/LP组)在3mg/kg未见死亡，6mg/kg死亡5/6，12mg/kg全部死亡。说明Rg3长春新碱脂质体和Rh2长春新碱脂质体的LD50在12-24mg/kg，胆固醇长春新碱脂质体LD50在3-6mg/kg，显示人参皂苷脂质体比胆固醇脂质体的急性毒性显著性降低(6/6，在/后面的数字表示测试老鼠的总数，/前面的数字表示死亡老鼠的数据)。

Claims (10)

1.一种人参皂苷长春新碱脂质体，其特征在于，其包括如下质量份数的组分：5-20份磷脂、0.05-2份PEG-DSPE、0.1-4份人参皂苷、1份长春新碱盐。
2.如权利要求1所述的人参皂苷长春新碱脂质体，其特征在于，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中，所述的人参皂苷与所述的磷脂形成磷脂膜；
和/或，所述的长春新碱盐为硫酸长春新碱通过pH梯度法与盐溶液进行离子交换得到的长春新碱盐；
和/或，所述的长春新碱盐为硫酸长春新碱、蔗糖八硫酸酯长春新碱、甲基磺酸长春新碱、甲基磺酸长春新碱、乙二磺酸长春新碱、丙二磺酸长春新碱、乙二磺酸长春新碱或丙二磺酸长春新碱；更佳地，所述的长春新碱盐为蔗糖八硫酸酯长春新碱、甲基磺酸长春新碱或乙二磺酸长春新碱；例如蔗糖八硫酸酯长春新碱；
和/或，所述的磷脂选自氢化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和脑磷脂中的一种或多种；较佳地，所述的磷脂为氢化磷脂或蛋黄卵磷脂；
和/或，所述的人参皂苷为选自20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷伪GQ和人参皂苷Rk1中的一种或多种，较佳地，所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
和/或，所述人参皂苷的HPLC纯度≥99％；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体还包括水；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体不包括胆固醇。
3.如权利要求2所述的人参皂苷长春新碱脂质体，其特征在于，所述的磷脂膜还包括PEG-DSPE；
和/或，所述的磷脂膜的内侧为内水相，所述的磷脂膜的外侧为外水相；所述的长春新碱盐被包封于所述的内水相中；所述的长春新碱为不溶于水的所述的长春新碱盐；较佳地，所述的内水相为盐溶液；所述的外水相优选为生理等渗溶液；例如生理等渗溶液为5％葡萄糖水溶液或10％蔗糖水溶液；
和/或，所述的长春新碱盐为硫酸长春新碱通过pH梯度法与盐溶液进行离子交换得到的长春新碱盐；所述的盐溶液为磺酸盐水溶液或蔗糖八硫酸酯盐水溶液；较佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液、甲基磺酸三乙胺水溶液、乙二磺酸铵水溶液、丙二磺酸铵水溶液、乙二磺酸三乙胺水溶液或丙二磺酸三乙胺水溶液；更佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液或乙二磺酸三乙胺水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液；
和/或，所述的硫酸长春新碱与所述的人参皂苷的质量比为1:(0.1～1)；例如所述的硫酸长春新碱与所述的人参皂苷Rg3的质量比为1:0.1、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1：2、1:3或1:4；
和/或，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:(0.1～5)；例如，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:0.0.5、1:0.1、1:0.25、1:0.5、1:1或1：2；
和/或，所述的硫酸长春新碱与所述的磷脂的质量比为1:(10～20)；例如，所述的硫酸长春新碱与磷脂的质量比为1:10、1:12、15:1或1:20；
和/或，所述的盐溶液与所述的硫酸长春新碱的体积质量比为66.7～200mL/g，例如100mL/g；
和/或，所述的硫酸长春新碱溶液的浓度为5～20mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL或20mg/mL；优选地为10～15mg/mL；
和/或，所述的盐溶液的浓度为0.05M-0.975M；例如0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.325M、0.65M、0.975M或0.16M；
更佳地，当所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.05M-0.1M；例如0.05M或0.1M；
和/或，当所述的盐溶液为乙二磺酸三乙胺水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.16M-0.65M；例如0.2M、0.3M、0.325M、0.65M或0.16M；
和/或，当所述的盐溶液为甲基磺酸铵水溶液时，所述的盐溶液的浓度为0.325M-0.975M；例如0.325M、0.65M或0.975M；
所述的磷脂的质量分数为10份；
和/或，所述的PEG-DSPE的质量分数为0.5份；
和/或，所述的人参皂苷的质量分数为1份；
和/或，所述PEG-DSPE为PEG2000-DSPE。
4.一种人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤1、将磷脂溶解于溶剂中，加入盐溶液进行水化，得到溶液A1；
步骤2、其为方案1、方案2或方案3；
方案1包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A2a；
方案2包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1，分别依次通过各孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A2b；
方案3包括如下步骤：
将步骤1得到的所述的溶液A1进行超声处理，得到溶液A2c；
步骤3、将所述的步骤2中得到的溶液A2a、A2b或A2c在含有所述的生理等渗溶液的透析袋中进行透析，得到溶液A3；
步骤4、将步骤3得到的所述的溶液A3与硫酸长春新碱的水溶液混合，得到A4脂质体；
步骤5、将步骤4得到的所述的A4脂质体与所述的人参皂苷在乙醇中混合，得到A5脂质体。
5.权利要求4述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法，其特征在于，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法还包括步骤6：将步骤5得到的所述的A5脂质体和PEG-DSPE分散在生理等渗溶液中，得到所述的人参皂苷长春新碱脂质体；
和/或，所述的磷脂和人参皂苷的种类和用量如权利要求1-3任一项所述；
和/或，所述的步骤1中，所述的溶剂为乙醇；例如无水乙醇；
和/或，所述的步骤1中，所述的磷脂与所述的溶剂的质量体积比为1g/1～10mL，例如1g/2mL；
和/或，所述的步骤1中，所述的水化的温度为55-65℃；
和/或，所述的水化的时间与反应规模相关，所述的水化以溶液均一即可，例如10-4小时，例如10分钟；
和/或，所述的步骤1中，所述的水化为在旋蒸瓶中进行，转速为40～60rp/min，例如50rp/min；
和/或，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质为在均质机中使用-5～10℃冷冻水冷切循环；较佳地，所述的高压均质为在均质机中使用5～10℃冷冻水冷切循环；
和/或，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质的压力在800-1500bar之间，例如1200bar；
和/或，所述的步骤2的方案1中，所述的高压均质的次数为3-4次，例如4次；
和/或，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的温度为35-45℃，例如40℃；
和/或，所述的步骤2的方案2中，所述挤出板的孔径为800nm，400nm，200nm，100nm；
和/或，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的压力为600～800psi；例如800psi；
和/或，所述的步骤2的方案2中，所述挤出的次数为4-10次，例如4次；
和/或，所述的步骤2的方案2中，所述的溶液A1，分别依次通过孔径分别为800nm、400nm、200nm、100nm的聚碳酯膜过滤板；
和/或，所述的步骤2的方案3中，所述的超声在600W下超声；
和/或，所述的超声为25次；较佳地，所述的超声为开5秒，停5秒；
和/或，所述的步骤3中，所述的透析袋的截留分子量为8000～15000；例如，10000；
和/或，所述的步骤3中，所述的等渗溶液为5％葡萄糖或10％蔗糖水溶液；
和/或，步骤3中，所述的溶液A2a、A2b或A2c与所述的等渗溶液的体积比为1:1000；
和/或，步骤3中，所述的透析的温度为0-10℃，例如4℃；
和/或，步骤3中，所述的透析的时间以完全去除所述的溶液A2a、A2b或A2c脂质体中外水相中的所述的盐溶液，较佳地，所述的透析的时间为10-18小时，例如12小时；
和/或，所述的步骤4中，所述的硫酸长春新碱溶液的浓度为5～20mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL或20mg/mL，优选地为10～15mg/mL；
和/或，所述的步骤5中，所述的人参皂苷乙醇溶液的浓度为5～20mg/mL，例如10mg/mL；
和/或，所述的步骤5中，所述的搅拌时间为30-60分钟，例如45分钟；
和/或，所述的步骤5中，所述的透析袋的截留分子量为8000～15000，例如，截留分子量为10000；
和/或，步骤5中，所述的透析的温度为0-10℃，例如4℃；
和/或，步骤5中，所述的透析的时间以完全去除乙醇盐溶液、未包裹的硫酸长春新碱和人参皂苷为准，较佳地，所述的透析的时间为10-18小时，例如12小时；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法还进一步包括除菌过滤和灌装步骤；例如，除菌过滤步骤中，采用0.22μm滤膜过滤所述的脂质体；灌装步骤中，灌装于10mL或20mL西林瓶中、压盖和包装；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％；
较佳地，所述的步骤6中，将PEG-DSPE，溶于步骤3相同的生理等渗溶液中，然后加入到步骤5得到的所述的A5脂质；
和/或，所述的步骤4中，将步骤3得到的所述的溶液A3与所述的硫酸长春新碱水溶液，按照体积比为1：1混合，并于50-60℃水浴中孵育40分钟，即得长春新碱脂质体；
和/或，所述的步骤5中，将所述的人参皂苷得乙醇溶液缓慢加入到步骤4中的长春新碱脂质体溶液，搅拌，挥发除去大部分乙醇，然后再置于透析袋中透析，以上述步骤3相同的等渗溶液作为透析介质；
和/或，所述的步骤6中，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:(0.1～5)；例如，所述的硫酸长春新碱与所述的PEG-DSPE的质量比为1:0.0.5、1:0.1、1:0.25、1:0.5、1:1或1：2；
和/或，所述的步骤6中，所述的PEG-DSPE浓度为1-20mg/mL，例如10mg/mL。
6.一种人参皂苷长春新碱脂质体，其特征在于，其由如权利要求4或5所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法制备得到。
7.一种人参皂苷长春新碱脂质体，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的原料包括如下质量分数的组成：5-20份磷脂、0.05-2份PEG-DSPE、0.1-4份人参皂苷、1份硫酸长春新碱；
较佳地，所述的磷脂、所述的PEG-DSPE和所述的人参皂苷的定义和质量分数如权利要求2或3所述；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体由如权利要求4或5所述的人参皂苷长春新碱脂质体的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的人参皂苷长春新碱脂质体，其特征在于，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的原料还包括生理等渗溶液和/或盐溶液；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％；
和/或，所述的生理等渗溶液为5％葡萄糖水溶液或10％蔗糖水溶液；
较佳地，所述的盐溶液为磺酸盐水溶液或蔗糖八硫酸酯盐水溶液；更佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液、甲基磺酸三乙胺水溶液、乙二磺酸铵水溶液、丙二磺酸铵水溶液、乙二磺酸三乙胺水溶液或丙二磺酸三乙胺水溶液；还佳地，所述的盐溶液为蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液、甲基磺酸铵水溶液或乙二磺酸三乙胺水溶液；例如蔗糖八硫酸酯三乙胺水溶液。
9.一种脂质体组合物，其特征在于，其包含葡萄糖水溶液和如权利要求1-3或6-8中任一项所述的人参皂苷长春新碱脂质体；
较佳地，所述的葡萄糖水溶液为5％葡萄糖水溶液；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体溶液中，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的包封率≥80％。
10.一种物质A在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用；所述的物质A为如权利要求1-3或6-8所述的人参皂苷长春新碱脂质体或如权利要求9所述的脂质体组合物；
较佳地，所述的癌症为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌中的一种或多种；
和/或，所述的人参皂苷长春新碱脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥80％；
和/或，所述的应用中，所述人参皂苷的纯度≥99％。
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