CN115436531B - 一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，采用色谱分离技术获取大曲样品中的非挥发性物质，对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，采用随机森林算法中变量重要性度量对大曲非挥发性物质变量进行优化筛选，获取对大曲质量分类贡献大的物质组成变量，构建大曲质量等级鉴别的判别模型，确定判别准则，对建模样品进行回判，以验证判别效果，将待测大曲样品按照获取的大曲非挥发性物质信息并输入上述构建的判别模型中，输出待测大曲样品的质量分类。本发明通过提取大曲中的非挥发性物质后，通过对非挥发性物质的分析直接判断大曲类型，实现了大曲的标准化鉴定，具有准确性好、稳定高效等优势。
Description
技术领域
本发明属于大曲生产技术领域，特别涉及一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法。
背景技术
酱香型白酒是我国主要香型白酒之—，具有酒体醇厚、酱香突出、空杯留香持久和回味悠长等特点，这种独特的风味与其特殊且充满古风遗韵的酿造工艺息息相关。其中，以小麦为原料制成的酱香型髙温大曲含有多种菌种和酶，在酱香型白酒生产过程中起着菌种剂、糖化、发酵、生香以及提供营养底物的功能，直接关系着酒的产量、风味和质量，堪称白酒的灵魂。在酱香型大曲的制备过程中，由于大曲存储仓库不同位置温度、湿度及环境中气体成分的差异，导致不同发酵程度大曲的产生。在实际生产过程中通常通过颜色将不同发酵程度的大曲分为白曲、黄曲和黑曲。然而，传统的通过目视判断大曲颜色的方法过于依赖生产人员的经验，亟需开发一种数字化的标准对不同发酵程度的大曲进行区分与鉴定。
现有的大曲鉴别方法有根据大曲优势微生物、挥发性风味物质和热焓值等指标，并结合判别分析方法进行数据分析实现大曲质量的判别。如在专利号为201310201060.5、专利名称为“一种构建判别模型鉴别大曲质量的方法”的中国发明专利提供了一种应用固相微萃取和判别分析鉴别大曲质量，该方法是通过大曲风味物质对大曲质量进行评价，但是这种鉴别方法时间长，成本高，且在储存过程大曲中的风味物质易挥发，导致无法准确鉴别。在专利号为201410419220.8、专利名称为“一种构建判别模型鉴别大曲质量的方法”的中国发明专利提供了一种应用454高通量测序技术和多元统计分析鉴别大曲质量，但这种鉴别方法测序时间长，且无法对大曲微生物中的活菌和死菌进行区分，实验操作繁琐；并且采用这种方法不能反映微生物的绝对定量情况。在专利号为CN202010518502.9、专利名称为“一种鉴别大曲质量的方法”的中国发明专利提供了一种差示扫描量热分析技术用于大曲样品分析，该方法是通过热焓值来对大曲质量进行判别，而热焓值是表征大曲系统能量的一个状态函数，是用于大曲性能的间接表征值，因此，难以及时、快速反映整个大曲的质量水平，对于大曲鉴别的判准率难以有效提高。
非挥发性物质是大曲发酵过程中形成的重要产物，对白酒发酵的风味有重要影响，例如白酒中常见的氨基酸类和有机酸类，因此在一定程度上能代表大曲的质量水平。这类化合物在大曲发酵过程由于其不易挥发的化学特性，在大曲发酵和储存过程中能稳定存在于大曲中，因此对于大曲质量水平的鉴别更具有代表性和稳定性。液相色谱-质谱联用仪（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer），简称LC-MS，结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段，具有灵敏度高、适用范围广等特点，对于难挥发、强极性、热不稳定的代谢物分析具有极大优势。近年来，LC-MS作为代谢组学重要的研究手段，广泛应用于药物研究、临床疾病标志物研究等领域中。
发明内容
本发明意在提供一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，通过提取大曲中的非挥发性物质后，通过对非挥发性物质的分析直接判断大曲类型，实现了大曲的标准化鉴定，具有准确性好、稳定高效等优势。
本发明的方案:一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，包括以下步骤：
步骤（1），大曲非挥发性物质的提取：采用色谱分离技术获取大曲样品中的非挥发性物质；
步骤（2），变量筛选与优化：基于步骤（1）所得的大曲非挥发性物质与样品质量等级，对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，采用随机森林算法中变量重要性度量对大曲非挥发性物质变量进行优化筛选，获取对大曲质量分类贡献大的物质组成变量；
步骤（3），建立判别模型：基于步骤（2）所优化的变量信息与样品质量等级，构建大曲质量等级鉴别的判别模型，确定判别准则；
步骤（4），验证模型：对建模样品进行回判，以验证判别效果；
步骤（5），鉴别：将待测大曲样品按照步骤（1）获取的大曲非挥发性物质信息并输入上述构建的判别模型中，输出待测大曲样品的质量分类。
进一步，所述步骤（1）中所述分离技术为LC-MS分离技术。
进一步，所述步骤（1）中大曲样品为出仓黄曲、出仓白曲和出仓黑曲的任一种。
进一步，所述步骤（2）中对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，采用变量重要性度量Mean Decrease Accuracy（平均精度下降）或Mean Decrease Gini（平均基尼下降）。
进一步，所述步骤（2）中优化筛选的原则为下降Mean Decrease Gini变量排序前20种非挥发性物质。
进一步，所述步骤（2）中变量筛选采用R语言构建。
进一步，所述步骤（3）中判别模型的构建及判别模型的构建采用随机森林法。
进一步，所述步骤（3）中判别模型采用R语言构建。
本发明的有益效果为：（1）利用LC-MS分离技术，解决了大曲挥发性风味物质不能全面准确反映大曲质量的优劣。（2）通过随机森林对大曲非挥发性物质进行筛选与优化，同时结合随机森林判别分析构建大曲质量鉴别评价模型并应用于大曲质量等级鉴别，构建了一套适用于出仓黄曲、出仓白曲和出仓黑曲等级鉴别的判别方法，该判别模型一经构建完成，以后在用该模型判别大曲质量时，可以随时调用，无需再进行重复构建，具有操作使用简单、判别准确率高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例2重要性排序排名前20的大曲非挥发性物质变量图示。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，包括以下步骤：
步骤（1），大曲非挥发性物质的提取：采用色谱分离技术获取大曲样品中的非挥发性物质，具体的，色谱分离技术为LC-MS分离技术；大曲样品为拆仓曲，即出仓黄曲、出仓白曲和出仓黑曲的任一种。
步骤（2），变量筛选与优化：基于步骤（1）所得的大曲非挥发性物质与样品质量等级，对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，采用随机森林算法中变量重要性度量对大曲非挥发性物质变量进行优化筛选，获取对大曲质量分类贡献大的物质组成变量；本实施例中，对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，采用变量重要性度量MeanDecrease Accuracy（平均精度下降）或Mean Decrease Gini（平均基尼下降），优化筛选的原则为下降Mean Decrease Gini变量排序前20种非挥发性物质，具体为;步骤（2）中，优化筛选得到的大曲非挥发性物质组成变量为Indolelactic.acid（C169）、N.Acetylglutamic.acid（C184）、L.3.Phenyllactic.acid（C209）、Cantharidin（C185）、Sebacic.acid（C145）、Corilagin（C183）、Nicotinic.acid（C161）、Octadecanedioic.acid（C93）、Glycyl.L.leucine（C186）、Isoferulic.acid（C181）、o.Tyrosine（C150）、Ambroxane（C166）、Pentadecanoic.acid（C194）、X2.Furoic.acid（C192）、X3.Indolepropionic.acid（C170）、Vitamin.B5（C86）、Clotrimazole（C126）、Aspartic.acid（C177）、Glutamic.acid（C202）和Isoliensinine（C160）。
步骤（3），建立判别模型：基于步骤（2）所优化的变量信息与样品质量等级，采用R语言通过随机森林法构建大曲质量等级鉴别的判别模型，确定判别准则；
步骤（4），验证模型：对建模样品进行回判，以验证判别效果；
步骤（5），鉴别：将待测大曲样品按照步骤（1）获取的大曲非挥发性物质信息并输入上述构建的判别模型中，输出待测大曲样品的质量分类。
实施例2：实验过程
1. 样品信息
本实施例中的样品来源于贵州茅台酒股份有限公司提供的90个高温大曲，其中样品包括：建模样品：出仓黄曲30个、出仓白曲30个、出仓黑曲30个；
测试样品：出仓黄曲15个、出仓白曲15个、出仓黑曲15个。
2. 大曲非挥发性物质的提取
称取20 mg大曲细粉，加入800 μL甲醇提取剂珠打研磨2分钟，取300 μL上清夜冻干后，用100 μL 30%甲醇/水复溶。
LC-MS分析：在正电离模式下的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C8 (1.7 μm,2.1×50 mm)，柱温为60 ℃，流动相流速为0.4 mL/min。流动相A为含有0.1%甲酸（体积比）的水溶液，流动相B为含有0.1%甲酸（体积比）的乙腈溶液。流动相初始比例是5% B相，维持0.5分钟。随后在1.5分钟内线性至40 % B相，在6分钟内线性升至100 % B相。在0.1min内降至5% B相，并维持1.9分钟。升总梯度时间为12分钟。
在负电离模式下的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8 μm, 2.1×50mm)，柱温为55 ℃，流动相流速为0.35 mL/min。流动相A为含有6.5 mM NH4HCO3的水溶液，流动相B为含有6.5 mM NH4HCO3的95% 甲醇/水溶液（体积比）。流动相初始比例是2% B相，维持0.5分钟。随后在1.5分钟内线性升至40 % B相，在6分钟内线性升至100 % B相。在0.1min内降至2% B相，并维持1.9分钟。总梯度时间为12分钟。
质谱参数为离子源 gas 1，离子源gas 2，Curtain gas分别为50 psi，50 psi，35psi。离子源温度为500 ℃，CAD gas为7，Spray voltage在正负离子模式下分别为5500 V和-4500 V。一级质谱扫描范围是80 – 1250 Da，去簇电压（DP）在正负离子模式下分别为80V和-80 V，DP spread 为0 V。一级质谱中，碰撞能（CE）在正负离子模式下分别为10 V和-10V，CE spread为0 V。富集时间0.1s，开启动态背景排除。二级质谱采集模式选择数据依赖的采集方式（IDA），解离模式选择诱导碰撞解离（CID）。Q1分辨率为单位分辨率，二级质谱扫描范围为50 – 1250 Da。去簇电压（DP）在正负离子模式下分别为80 V和-80 V，DP spread 为0 V。碰撞能设置低，中，高三种，分别对应于15V（-15V），30V（-30V），45V（-45V）。富集时间为0.04 s。
基于MetExDB数据库，利用MetEx定性方法对所得特征峰进行分析，经精确质量，色谱保留规律和质谱碎裂规律共同确证，从不同拆仓曲中鉴定出221种代谢物（物质编号为C1，C2，C3，…，C221）与相对含量。
3. 变量筛选与优化
将变量与样品信息输入，利用R语言随机森林算法，采用变量重要性度量MeanDecrease Gini对获得的大曲非挥发性物质变量进行筛选与优化，获得重要性排序前20种非挥发性物质，如图1所示。
4.建立判别模型
通过R语言，采用随机森林分析法，以上述20类大曲非挥发性物质为自变量，以3种高温大曲的判断为因变量，进行随机森林判别分析，构建大曲质量等级的判别模型。
5.验证模型
首先利用交叉验证对建模样品进行回判，以验证判别效果，结果见表1。
表1建模样品交叉验证结果
注：Y：出仓黄曲；W：出仓白曲；B：出仓黑曲
从表1可以看出，用于建模的样品共90个：出仓黄曲30个、出仓白曲30个、出仓黑曲30个。该判别模型对出仓黄曲的判别准确率为29/30=96.7%，对出仓白曲的判别准确率为30/30=100%，对出仓黑曲的判别准确率为30/30=100%，综合判别准确率为（29+30+30）/（30+30+30）=98.9%，表明所建立的判别模型对大曲质量鉴别的判别较为有效。
6.鉴别
采用判别模型对45个外部的测试样品（出仓黄曲15个、出仓白曲15个、出仓黑曲15个）进行判别，结果见表2。
表2 外部测试样品验证结果
注：Y：出仓黄曲；W：出仓白曲；B：出仓黑曲
从表2可以看出，该二次判别对外部测试样品中出仓黄曲的判别准确率为14/15＝93.3%，对出仓白曲的判别准确率为15/15＝100％，对出仓黑曲的判别准确率为15/15＝100.0%，综合判别准确率为（14+15+15）/（15+15+15）＝97.8%，该结果进一步表明所建立的判别模型对大曲质量鉴别的判别效果较好。
显然，相对于固相微萃取的方式，本申请提供的方法所用时间极少，2小时之内即可完成，而且成本极低，除步骤（1）中LC-MS检测需要用到少许耗材外，整个过程基本无需其他耗材，而该方法的可靠性和准确性方面也远远超过通过微生物和挥发性风味物质建立的质量评价方法。更为重要的是R语言中提供了很多用于构建判别模型的程序包或函数，因此采用R语言构建判别模型可保证非专业人士通过较少的培训也可轻易操作，极大的避免了操作人员不够专业所带来的误判，也避免了企业为培养专业的操作人员所付出的高昂成本。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的特性等常识在此未作过多描述。本发明要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (4)
1.一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1），大曲非挥发性物质的提取：采用色谱分离技术获取大曲样品中的非挥发性物质，所述大曲样品为出仓黄曲、出仓白曲和出仓黑曲的任一种；
步骤（2），变量筛选与优化：基于步骤（1）所得的大曲非挥发性物质与样品质量等级，采用变量重要性度量Mean Decrease Accuracy或Mean Decrease Gini对大曲非挥发性物质变量指标进行筛选与优化，优化筛选的原则为下降Mean Decrease Gini变量排序前20种非挥发性物质，采用随机森林算法中变量重要性度量对大曲非挥发性物质变量进行优化筛选，获取对大曲质量分类贡献大的物质组成变量，变量筛选采用R语言构建；
步骤(2)中，优化筛选得到的大曲非挥发性物质组成变量为吲哚-3-乳酸、N-乙酰-L-谷氨酸、L-3-苯乳酸、斑蝥素、癸二酸、柯里拉京、烟酸、十八烷二酸、甘氨酰-L-亮氨酸、异阿魏酸、DL-O-酪氨酸、降龙涎香醚、十五烷酸、糠酸、吲哚-3-丙酸、维生素B5、克雷唑、天冬氨酸、谷氨酸、异莲心碱；
步骤（3），建立判别模型：基于步骤（2）所优化的变量信息与样品质量等级，构建大曲质量等级鉴别的判别模型，确定判别准则；
步骤（4），验证模型：对建模样品进行回判，以验证判别效果；
步骤（5），鉴别：将待测大曲样品按照步骤（1）获取的大曲非挥发性物质信息并输入上述构建的判别模型中，输出待测大曲样品的质量分类。
2.根据权利要求1所述的一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的分离技术为LC-MS分离技术。
3.根据权利要求1所述的一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中判别模型的构建采用随机森林法。
4.根据权利要求3所述的一种基于大曲非挥发性物质鉴别大曲质量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中判别模型采用R语言构建。
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