CN115436529A - 一种复方健脾补肾制剂hplc指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱 - Google Patents

一种复方健脾补肾制剂hplc指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱，本发明所提供的构建方法是以制备的复方健脾补肾制剂为样本，将样本制备成溶液，再利用超高效液相色谱仪和高分辨串联质谱，获取指纹图谱，健脾补肾方药物以党参和骨碎补为君药，以刺五加和仙灵脾为臣药，以丹参为佐药，以独活为使药，具有健脾补肾，强筋健骨，活血化瘀的功效，主治脾肾气虚、脾肾阳虚导致的肌少症、骨折后肌肉萎缩等肌肉，骨相关疾病的功效，具有良好的安全性，与市面上应用的化合物相比，具有原料易得，制作工艺简单。

Description

一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹 图谱
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱。
背景技术
中医学及现代医学均认识到肌肉与骨骼在生理、病理上存在着密切联系。《难经·二十四难》记载：“少阴者，冬脉也，伏行而温于骨髓。故骨髓不温，即肉不着骨，骨肉不相亲，即肉濡而却…发无润泽；无润泽者，骨先死。”肌肉作人体最主要的动力组织器官，产生收缩力，对骨骼产生力学(应力)刺激，被骨组织中的骨细胞陷窝-骨小管(力学感受器)所监测，当产生的应力刺激降低时，骨小管感受到现有骨量大于外力作用的需要，则启动骨重建，使骨吸收大于骨形成，导致骨量下降。随着年龄的增长，男性和女性骨骼肌力量均下降，男性趋势较女性更为明显，同时伴随着骨折风险的增加。青年阶段的长期适量运动，可促进骨骼肌的微循环，增强营养物质的代谢，一方面有利于肌力的增强和协调性的平衡，一方面可提高骨骼的质和量，从而降低年老后脆性骨折的发生率。跌倒是导致老年人发生骨质疏松性骨折的危险因素，在日常活动如体位改变、行走、平衡变化，及环境、生理、室内外活动、雪地或非雪地中旅行、滑倒等均可引发跌倒而致骨折；老年人出现跌倒的自身诱因包括：年龄、活动能力、平衡、抓力、慢性疾病、可诱发跌倒的药物等，其中肌肉力量(特别是下肢)是评估和防治老年人跌倒风险的一个重要因素。老年人肌肉强度、水平越低，其跌倒的风险越高。
由此可见，肌肉与骨的密切关系在骨质疏松症和骨质疏松性骨折防治中的重要性。中医学则从“脾主肌肉”、“肾主骨”、“先、后天之本”等论治骨科疾患，《张聿青医案》曰：“脾胃之腐化，尤赖肾中这一点真阳蒸变，炉薪不熄，釜爨方成。”《傅青主女科·妊娠》曰：“脾为后天，肾为先天，脾非先天之气不能化，肾非后天之气不能生。”《医门棒喝》：“脾胃之能生化者，实由肾中元阳之鼓舞，而元阳以固密为贵，其所以能固密者，又赖脾胃生化阴精以涵育耳。”因此，脾肾之间为先天温养后天、后天补养先天的辨证关系。同时，肾虚是骨质疏松症的根本、脾虚是主要环节、血瘀是促进因素，因此，施杞教授在配伍组方时以补肾为主，辅以健脾、活血。
目前，针对老年骨折后出现肌肉萎缩、及肌少症的治疗，仅限血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、β受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂、睾酮、生长激素、生长释放肽，以及一般物理疗法。但仍需要大规模试验来确认上诉方法的有效性和安全性，且上诉方法被认为是有限的。
综上所述，研发一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱，是医药技术领域中急需解决的关键问题。
发明内容
针对现有技术所存在的上述缺点，本发明在于提供一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱，本发明所提供的方法制备的健脾补肾的中药方剂，具有良好的安全性，与市面上应用的化合物相比，具有原料易得，制作工艺简单，具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一方面：提供了一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，所述的构建方法是以制备的复方健脾补肾制剂为样本，将样本制备成溶液，再利用超高效液相色谱仪和高分辨串联质谱，获取指纹图谱，其中：
所述的复方健脾补肾制剂，包括以下质量份数的原料：党参11-13份、骨碎补8-10份、刺五加11-13份、仙灵脾8-10份、丹参11-13份、独活8-10份；
所述的复方健脾补肾制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取党参、骨碎补、刺五加、仙灵脾、丹参和独活，置于浸泡池内浸泡，再煎煮3次，合并煎煮液；
(2)将煎煮液过滤、灭菌后，自然冷却，制得复方健脾补肾制剂。
本发明进一步的设置为：所述的将样本制备成溶液的过程为：
取适量样品溶液于2mL离心管中；然后离心，取上清液，获得样本溶液。
本发明进一步的设置为：所述的离心转速为12000r/min，离心时间为5min。
本发明进一步的设置为：所述的超高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0003894019250000041
T3，柱高2.1mm，内径100mm，粒度1.6μm，柱温：30℃，等度洗脱，流速：0.3ml/min，进样量：5μl，检测波长：190-400nm，流动相比例：A相乙腈，B相0.1％甲酸水溶液。
本发明进一步的设置为：所述的复方健脾补肾制剂，包括以下质量份数的原料：党参12份、骨碎补9份、刺五加12份、仙灵脾9份、丹参12份、独活9份。
本发明进一步的设置为：在步骤(1)中，所述的浸泡时间为1h。
本发明进一步的设置为：在步骤(1)中，所述的煎煮3次每次的时间均为1h，煎煮温度均为120℃。
本发明的第二方面：还提供了一种标准指纹图谱，使用了上述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法所构建的。
本发明所提供的复方健脾补肾制剂的原料功效说明：
党参(Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.)和骨碎补(Davallia mariesiiMoore ex Bak.)为君药，党参是桔梗科党参属植物，多年生草本植物。性味甘，平。归脾、肺经。具有补脾肺气、补血、生津等功效。
骨碎补是骨碎补科骨碎补水龙骨目植物，性味苦，温。归肾、肝经。具有补肾强骨、活血续伤止痛等功效。现代药理及临床研究表明，其具有促增殖分化作用、抗骨质疏松作用、抗炎作用、促进骨折愈合、牙骨细胞保护作用、肾保护作用、防治药物中毒性耳聋、降血脂等作用。
刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.Maxim.)Harms)和淫羊藿(Epimediumbrevicornum Maxim.)为臣药，刺五加是五加科五加属伞形目植物，性味辛、微苦，温；归脾、肾、心经，具有益气健脾、补肾安神等功效。具有增强机体的非特异性抵抗力、提高免疫功能、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、改善心血管功能、解毒等作用。
淫羊藿是小檗科多年生草本植物，在《唐本》中又被称为仙灵脾，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风除湿等功效。淫羊藿早期可促进血肿机化吸收、骨痂的形成；中期刺激骨结构构型、增强骨痂截面力矩作用；后期促进基质的钙化，提高成骨细胞的活性，加速骨重建，进而促进骨质疏松性骨折的愈合。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为佐药，唇形科植物，已鉴定分离出50余种化学成分。性味苦，微寒。归心、肝经。具有活血补血、补脾肺气、生津等功效。旨在骨折早、中期活血化瘀，以清除局部瘀血阻滞经脉，后期活血养血，以使局部气血调衡，骨有所养。
独活(Angelicae Pubescentis Radix)为使药，是伞形科植物重齿毛当归的干燥根，性味辛、苦，微温，归肾、膀胱经，具有祛风湿、止痛、解表等功效
有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
本发明所提供的构建方法是以制备的复方健脾补肾制剂为样本，将样本制备成溶液，再利用超高效液相色谱仪和高分辨串联质谱，获取指纹图谱，健脾补肾方药物以党参和骨碎补为君药，以刺五加和仙灵脾为臣药，以丹参为佐药，以独活为使药，具有健脾补肾，强筋健骨，活血化瘀的功效，主治脾肾气虚、脾肾阳虚导致的肌少症、骨折后肌肉萎缩等肌肉，骨相关疾病的功效，具有良好的安全性，与市面上应用的化合物相比，具有原料易得，制作工艺简单，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明复方健脾补肾样品UPLC-HRMS基峰离子流图(BPC)，其中为负离子模式；
图2为本发明复方健脾补肾样品UPLC-HRMS基峰离子流图(BPC)，其中为正离子模式；
图3为本发明复方健脾补肾样品UPLC紫外色谱图，其中UV 254nm；
图4为本发明LHYY健脾补肾样品主要成分鉴定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例：
本发明提供了一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，所提供的构建方法是以制备的复方健脾补肾制剂为样本，将样本制备成溶液，再利用超高效液相色谱仪和高分辨串联质谱，获取指纹图谱，其中：
复方健脾补肾制剂，包括以下质量份数的原料：党参11-13份、骨碎补9g、刺五加12g、仙灵脾9g、丹参12g、独活9g；
复方健脾补肾制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取党参、骨碎补、刺五加、仙灵脾、丹参和独活，置于浸泡池内浸泡，再煎煮3次，合并煎煮液。
进一步的，浸泡时间为1h。
进一步的，煎煮3次每次的时间均为1h，煎煮温度均为120℃。
(2)将煎煮液过滤、灭菌后，自然冷却，制得复方健脾补肾制剂。
其中，将样本制备成溶液的过程为：
取适量样品溶液于2mL离心管中；然后离心，取上清液，获得样本溶液。
进一步的，离心转速为12000r/min，离心时间为5min。
本发明中，超高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0003894019250000081
T3，柱高2.1mm，内径100mm，粒度1.6μm，柱温：30℃，等度洗脱，流速：0.3ml/min，进样量：5μl，检测波长：190-400nm，流动相比例：A相乙腈，B相0.1％甲酸水溶液。
在本实施例中，流动相梯度，如表1所述。
表1：流动相梯度
Figure BDA0003894019250000082
在本实施例中，采用Agilent Q-TOF 6545 LC/MS高分辨串联质谱，由安捷伦科技有限公司提供。高分辨串联质谱的质谱条件：质谱检测模式：ESI-Negative/Positive ionmode。质谱参数如表2所示。
表2：Mass parameters(Agilent 6545 Q-TOF LC-MS)
Figure BDA0003894019250000083
Figure BDA0003894019250000091
此外，本发明数据采集软件为MassHunter Workstation Software LC/MS DataAcquisition for 6200series TOF/6500series Q-TOF(version B.06.01)，数据处理软件为MassHunter Workstation Software Qualitative Analysis(version B.07.00)。鉴定时优先将质谱数据与MassHunter PCDL Manager(version B.08.00)数据库进行匹配，根据各色谱峰得分信息对化合物进行初步筛选，进一步根据各色谱峰一级、二级信息等对化合物进行确认。
实验结果：
按照实施例的方法所构建的标准指纹图谱的，如图1-3所示。
采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对健脾补肾复方样品进行分析，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，从健脾补肾复方样品中鉴定出44个化合物，如图4所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法是以制备的复方健脾补肾制剂为样本，将样本制备成溶液，再利用超高效液相色谱仪和高分辨串联质谱，获取指纹图谱，其中：
所述的复方健脾补肾制剂，包括以下质量份数的原料：党参11-13份、骨碎补8-10份、刺五加11-13份、仙灵脾8-10份、丹参11-13份、独活8-10份；
所述的复方健脾补肾制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取党参、骨碎补、刺五加、仙灵脾、丹参和独活，置于浸泡池内浸泡，再煎煮3次，合并煎煮液；
(2)将煎煮液过滤、灭菌后，自然冷却，制得复方健脾补肾制剂。
2.根据权利要求1所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的将样本制备成溶液的过程为：
取适量样品溶液于2mL离心管中；然后离心，取上清液，获得样本溶液。
3.根据权利要求2所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的离心转速为12000r/min，离心时间为5min。
4.根据权利要求1所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure FDA0003894019240000011
T3，柱高2.1mm，内径100mm，粒度1.6μm，柱温：30℃，等度洗脱，流速：0.3ml/min，进样量：5μl，检测波长：190-400nm，流动相比例：A相乙腈，B相0.1％甲酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的复方健脾补肾制剂，包括以下质量份数的原料：党参12份、骨碎补9份、刺五加12份、仙灵脾9份、丹参12份、独活9份。
6.根据权利要求1所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的浸泡时间为1h。
7.根据权利要求1所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的煎煮3次每次的时间均为1h，煎煮温度均为120℃。
8.一种标准指纹图谱，其特征在于，使用了根据权利要求1-7任一项所述的一种复方健脾补肾制剂HPLC指纹图谱的构建方法所构建的。
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