CN115429899A - 试剂的制造方法及利用该制造方法制造的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种试剂的制造方法及利用该制造方法制造的试剂。本发明的试剂的制造方法包含将光增感剂和卟啉类调节剂预先混合的工序。本发明的制造方法进一步包含将光增感剂和卟啉类调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序。根据本发明的试剂的制造方法,可以防止发生人为操作错误,可以在无需在意光增感剂和卟啉类调节剂的添加的顺序或者配比、无需在意溶液pH的情况下使用试剂,并且试剂的保存期限长、稳定性高,在用于例如荧光分光光度测定时可以获得高的准确性和精度。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂的制造方法及利用该制造方法制造的试剂。
背景技术
作为癌症的检查方法之一,已知有下述的方法:对检体给予光增感剂,通过在细胞内经过代谢而转变为卟啉类,如果是正常的健康细胞,则卟啉类立即被代谢为亚铁原卟啉(Heme),几乎不会在细胞内蓄积卟啉类,因此只会发出微弱的荧光,而如果为癌细胞,则使卟啉类代谢为亚铁原卟啉(Heme)的亚铁螯合酶(Ferrochelatase,简称FECH)的活性会降低,因而生成的卟啉类会蓄积在细胞内,通过对由卟啉类发出的荧光进行分光测定(分析)来进行检查。
例如,在非专利文献1中公开了:在使用作为光增感剂之一的5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevuilic acid,以下有时简写为“5-ALA”)甲酯时,可以在正常的皮肤和患有皮肤癌的皮肤之间产生荧光光谱中的差异,由此可以进行癌症诊断。
但是,已知在一部分癌细胞中,会存在将卟啉类排出到细胞外的卟啉类转运蛋白(Porphyrin transporter)发生过表达的情况,如果对这样的细胞仅给予光增感剂,则由于生成的卟啉类会从细胞中被排出,卟啉类的蓄积会减少,因此由卟啉类发出的荧光的强度减弱,变得难以与正常的健康细胞区分开来,有时会无法进行精度良好的分光测定(分析)。为了防止这种情况的发生,可以考虑通过对细胞进一步投予抑制卟啉类从细胞中被排出的卟啉类转运蛋白抑制剂(以下有时简称为“抑制剂”),使得卟啉类转运蛋白的过表达被抑制,细胞中的卟啉类的量不再减少而再次增加,从而可以进行精度良好的分光测定(分析)。另外,为了防止上述情况的发生,还可以考虑对细胞进一步投予铁剂,如果是正常的健康细胞,则所施予的铁剂会将上述的亚铁螯合酶活化,卟啉类会进一步减少,而如果为癌细胞,由于亚铁螯合酶的功能已受损,即使被施予了该铁剂对于亚铁螯合酶的功能也不会带来太大影响,由亚铁螯合酶带来的卟啉类减少的效果不会像正常的健康细胞那样明显,但是由于正常细胞中的卟啉类的量进一步减少,因而可以增大正常细胞与癌细胞之间的卟啉类的量的差异,从而可以将两者区别开来,由此也可以提高检测的精度。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Can Autofluorescence Demarcate Basal Cell Carcinoma fromNormal Skin?A Comparison with Protoporphyrin IX Fluorescence,Renhua NA,etal.,Acta Derm Venereol 2001;81:246-249
发明内容
发明要解决的技术问题
但是,在现有技术中,对于在实际的检查(医疗)现场是以哪种顺序对检体加入光增感剂和抑制剂或者光增感剂和铁剂的具体流程则没有任何的公开。
在检查(医疗)现场,如果对检体加入的光增感剂和抑制剂或者铁剂的顺序不同或者两者的调配不同,则所得的检查结果自然也会变得不同,从而无法获得准确且高精度的检查结果。例如对于卟啉类转运蛋白发生了过表达的细胞,即使施予光增感剂,生成的卟啉类也会不断地被排出到细胞外。而如果对这样的细胞先加入光增感剂、然后再加入抑制剂,则使卟啉类蓄积的效果还是会减弱,从而还是会影响检查结果的准确性和精度。
另外,在分别添加光增感剂和抑制剂或者铁剂时,根据操作者水平的不同,有可能会产生制备操作的错误,从而导致制备浓度产生错误、或者使用量产生错误等人为的错误。而且,如果分别处理光增感剂和抑制剂或铁剂时,还存在误将光增感剂先投入或者将其中一种重复投予的误操作,由此产生使检查精度降低的问题。
此外,在进行检查时,一般使用光增感剂和抑制剂或铁剂的溶液。已知有一些光增感剂在溶解于水等制成溶液时会急速劣化,因此,如果将其与抑制剂或铁剂溶液混合,则混合溶液的使用期限会受到光增感剂溶液的牵制而变短。而且,如本领域中公知的那样,混合溶液的保存本身就是很困难的,这样就变成使用者每次使用时都要现制作混合溶液,使得使用过程变得繁琐。
进而,如果以液体状态输送光增感剂和抑制剂或铁剂,则重量和体积都很大,从而导致输送成本增加。
因此,本发明的目的在于提供在对检体加入光增感剂和抑制剂或铁剂时可以防止在检查(医疗)现场添加的顺序不同或两者的配比不同、由此能够获得准确且高精度的检查结果的试剂的制造方法。
另外,本发明的目的还在于提供使得光增感剂和抑制剂或铁剂的向检查(医疗)现场运送、在现场的保管等变得容易的试剂的制造方法。
此外,本发明的目的还在于提供具有保存期限长、稳定性高的优异特性的试剂。
用于解决技术问题的手段
为了实现上述目的,本发明涉及一种试剂的制造方法,其包含将光增感剂和卟啉类调节剂(以下有时简称为“调节剂”)预先混合的工序。
通过将光增感剂和调节剂预先混合,可以避免前述的人为错误的发生,可以避免重复投予试剂的情况。通过供给者以按适当的量预先混合了光增感剂和调节剂的状态提供试剂,可以省去使用者制备各试剂的工序和时间,并且可以避免使用者以错误的使用量使用试剂的情况的发生。另外,如上所述,如果先投入光增感剂、后加入调节剂,则卟啉类蓄积的效果会减弱,而通过将它们预先混合,可以避免以错误的顺序给予试剂的情况。而且,通过将它们预先混合,使用者可以在无需在意投予的顺序的情况下使用试剂。
另外,在上述制造方法中,可以进一步包含将所述光增感剂和所述卟啉类调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序。
通过进一步进行冷冻干燥,将所述混合物制成固体,可以发挥出能够延长混合试剂的保存期限的效果。另外,通过利用冷冻干燥制成固体状,可以大幅度减少输送时的体积和重量。进而,通过制成固体状,还可以提高对于低温或高温导致的劣化的耐受性。
另外,在上述制造方法中,在所述预先混合之前,可以进一步包含预先添加第一pH调节成分的工序。
另外,在上述制造方法中,可以按照pH达到中性~碱性的方式添加所述第一pH调节成分。
另外,在上述制造方法中,可以对所述光增感剂添加所述第一pH调节成分。
另外,在上述制造方法中,在所述预先混合之后,可以进一步包含添加第二pH调节成分的工序。
另外,在上述制造方法中,可以按照pH达到6.8~7.8的方式添加所述第二pH调节成分。
另外,在上述制造方法中,所述光增感剂可以为5-氨基乙酰丙酸或其酯、或者它们的盐。
另外,在上述制造方法中,所述卟啉类调节剂可以为卟啉类转运蛋白抑制剂和/或铁剂。
进而,本发明还涉及一种利用上述的本发明的制造方法制造的试剂。
关于所述的试剂,其可以被用于荧光分光光度测定。
发明效果
根据本发明,可以提供在对检体加入光增感剂和卟啉类调节剂时可以防止在检查(医疗)现场添加的顺序不同或人为操作错误、由此能够获得准确且高精度的检查结果的试剂的制造方法。
另外,根据本发明,可以提供使得光增感剂和卟啉类调节剂的向检查(医疗)现场运送、在现场的保管等变得容易的试剂的制造方法。
另外,根据本发明,可以提供具有保存期限长、稳定性高的优异特性的试剂。
附图说明
图1为显示5-ALA与新生霉素的混合物的稳定性评价中利用高效液相色谱法得到的5-ALA的含量变化的图。
图2为显示5-ALA与新生霉素的混合物的稳定性评价中利用高效液相色谱法得到的新生霉素的含量变化的图。
图3为显示5-ALA与铁剂的混合物的稳定性评价的结果的图。
具体实施方式
下面,对本发明的试剂制造方法及利用该制造方法制造的试剂的实施方式进行详细说明。
(实施方式1)
实施方式1-1
本发明的实施方式1-1的试剂的制造方法包含将光增感剂和卟啉类调节剂预先混合的工序。
具体地可以如下实施。分别称量光增感剂的粉末和调节剂的粉末,将称量后的光增感剂和调节剂以粉末的状态混合,然后在混合粉末中加入水等溶剂制成溶液。
通过将光增感剂和调节剂预先混合,可以避免前述的人为错误的发生,可以避免重复投予试剂的情况。通过供给者以按适当的量预先混合了光增感剂和调节剂的状态提供试剂,可以省去使用者制备各试剂的工序和时间,并且可以避免使用者以错误的使用量使用试剂的情况的发生。另外,如上所述,如果先投入光增感剂、后加入调节剂,则卟啉类蓄积的效果会减弱,而通过将它们预先混合,可以避免以错误的顺序给予试剂的情况。而且,通过将它们预先混合,使用者可以在无需在意投予的顺序的情况下使用试剂。
利用本发明的实施方式1-1的试剂的制造方法获得的试剂例如可以如下进行使用。将达到目标的最终浓度的量的所述试剂投予给检体,检体摄入光增感剂和调节剂,然后对所述检体进行荧光分光光度测定。
实施方式1-2
就本发明的实施方式1-1的试剂的制造方法而言,可以进一步包含将上述光增感剂和调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序(以下将此制造方法作为本发明的实施方式1-2)。
具体地可以如下实施。分别称量光增感剂的粉末和调节剂的粉末,将称量后的光增感剂和调节剂以粉末的状态混合,然后在混合粉末中加入水等溶剂制成溶液,进而,对该溶液实施冷冻干燥,制成固体。
根据本领域的经验规则已知,有一部分光增感剂溶于水等中制成溶液时会发生急速的劣化。例如前述的5-ALA在与水混合后会发生急速的劣化,在很短时间内(数小时~几十小时)就不能再使用了。由此,如果是其与调节剂的混合溶液,则该混合溶液的使用期限会受到该5-ALA的牵制而变得很短。另外,如前所述,混合溶液的保存是困难的,使用者不得不在每次使用时都现制作混合溶液。相对与此,通过实施冷冻干燥而制成固体,可以发挥出延长混合试剂的保存时间的效果。此外,如果分别对光增感剂和调节剂进行输送,则所需容器的数量或者体积都会很大,从而会导致输送成本增大,而且如果是以液体状态输送光增感剂和调节剂,也会使得重量和体积增大,从而同样地导致输送成本增大。而通过实施冷冻干燥制成固体状,可以大幅度减少输送时的体积和重量。另外,通过制成固体状,还可以提高对于低温或高温导致的劣化的耐受性。
通过进一步包含将光增感剂和调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序的本发明实施方式1-2的试剂的制造方法获得的试剂例如可以如下进行使用。在所得固体中加入规定量的水等溶剂,再次将其制成溶液,然后将达到目标的最终浓度的量的溶液投予给检体,检体摄入光增感剂和调节剂,然后对所述检体进行荧光分光光度测定。
实施方式1-3
本发明的实施方式1-3的试剂的制造方法包含将光增感剂和卟啉类调节剂预先混合的工序。
具体地可以如下实施。分别称量光增感剂的粉末和调节剂的粉末,在称量后的光增感剂的粉末和调节剂的粉末中分别加入水等溶剂,分别制成溶液,然后将光增感剂的溶液和调节剂的溶液按照目标比例混合。
通过本发明的实施方式1-3的试剂的制造方法获得的试剂例如可以如下进行使用。将达到目标的最终浓度的量的试剂投予给检体,检体摄入光增感剂和调节剂,然后对所述检体进行荧光分光光度测定。
实施方式1-4
就本发明的实施方式1-3的试剂的制造方法而言,可以进一步包含将上述光增感剂和调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序(以下将此制造方法作为本发明的实施方式1-4)。
具体地可以如下实施。分别称量光增感剂的粉末和调节剂的粉末,在称量后的光增感剂的粉末和调节剂的粉末中分别加入水等溶剂,分别制成溶液,然后将光增感剂的溶液和调节剂的溶液按照目标比例混合,进而,对该混合溶液实施冷冻干燥,制成固体。
通过进一步包含将光增感剂和调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序的本发明实施方式1-4的试剂的制造方法获得的试剂例如可以如下进行使用。在所得固体中加入规定量的水等溶剂,再次将其制成溶液,然后将达到目标的最终浓度的量的溶液投予给检体,检体摄入光增感剂和调节剂,然后对所述检体进行荧光分光光度测定。
作为本发明上述实施方式中的冷冻干燥的工序,根据所使用的光增感剂和调节剂,使用本领域通常的冷冻干燥的方法来进行。作为条件,例如可以列举出在-40~-45℃的温度下冷冻干燥24~48小时,但冷冻干燥的条件并不限定于此。
另外,就本发明上述实施方式的试剂的制造方法而言,还可以在所述预先混合之前进一步包含预先添加第一pH调节成分的工序。
对于一些光增感剂,例如前述的5-ALA,其溶液本身是强酸性的,且越为酸性的状态则越为稳定。如果溶液为中性,比酸性的情况下保存性要差,而如果溶液为碱性,则在常温下会在数小时内发生分解。另一方面,对于一些抑制剂,有时只能在中性~碱性的状态下才能溶解,这样的话就会变得与要使用的光增感剂的特性变得不和。对于铁剂也是,根据种类的不同会受到pH的影响,存在如果不是特定的pH范围则不会溶解的类型。在使用这样的光增感剂和抑制剂或铁剂的情况下,既要防止光增感剂的分解或变性,又要促进抑制剂或铁剂的溶解以使得其不会从溶液中溶出,为此,例如可以追加在所述预先混合之前预先添加第一pH调节成分的工序。
具体地可以如下实施。首先制作为酸性的光增感剂的溶液。然后利用作为第一pH调节成分的氢氧化钠等将该溶液的pH调节为中性~碱性。接着混合抑制剂或铁剂,并立即进行冷冻干燥,由此获得本发明的试剂。作为上述中性~碱性,例如可以列举出pH为6.6~8的范围。
通过预先添加第一pH调节成分,在使用一些特定的光增感剂和抑制剂或铁剂时,也可以获得本发明的混合试剂,而且使用者在使用本发明的试剂时也可以无需在意pH,使得试剂的使用变得便利。
另外,就本发明上述实施方式的试剂的制造方法而言,还可以在所述预先混合之后进一步包含添加第二pH调节成分的工序。
在将制备好的混合试剂的溶液对细胞等检体投予时,为了防止对细胞造成伤害,可以在该制备好的混合试剂的溶液中添加第二pH调节成分,使溶液pH达到例如6.8~7.8,由此可以顺利地进行检查而无需担心对细胞产生不良影响。
作为上述第一pH调节成分和第二pH调节成分,根据所要调节的pH的范围使用本领域公知的pH调节剂即可。
另外,就本发明上述实施方式的试剂的制造方法而言,还可以进一步包含预先混合溶血剂的工序。通过将对红细胞具有溶血作用的溶血剂进一步混合,即使在检体中混入了血液时,也可以保持溶液的光学上的透明性(特别是对蓝色光的透射性),由此可以保证后续的例如荧光分光光度检查的准确性和精度。
下面,对本发明的光增感剂和卟啉类调节剂进行具体说明。
作为本发明的光增感剂,可以列举出5-氨基乙酰丙酸、LASERPHYRIN、Photophrin、Radachlorin、Temoorfin、紫红素-18(purpurin-18),其中,从对生物体或细胞的影响少、而且粉末状态下稳定、易于溶于水且比较廉价的观点出发,优选5-氨基乙酰丙酸,其具有通过从细胞外被投予而增加细胞内卟啉类(原卟啉(Proto porphyrin)IX等)的量的作用,但只要同样地具有增加细胞内的卟啉类的作用的化学物质,则也可以是5-ALA的酯或它们的盐。
[化学结构式1]
作为5-ALA的酯的例子,以上述[化学结构式1]中(A)的变形例示出。例如当(A)为氢时即为5-ALA。
作为(A)基团的例子,例如可以举出直链烷基(linear alkyl group)、支链烷基(branched alkyl group)、环烷基(cycloalkyl group)、芳基(aryl group)、芳烷基(aralkyl group)等。
作为5-ALA的盐的例子,以上述[化学结构式1]中(B)的变形例示出。例如当(B)为HCl(盐酸)、(A)为氢时即为5-ALA盐酸盐。
作为(B)的盐的例子,例如可以举出盐酸盐(hydrochloride)、氢溴酸盐(hydrobromide)、氢碘酸盐(hydroiodide)、磷酸盐(phosphate)、甲基磷酸盐(methylphosphate)、乙基磷酸盐(ethylphosphate)、亚磷酸盐(phosphite)、连二磷酸盐(hypophosphate)、硝酸盐(nitrate)、硫酸盐(sulfate)、醋酸盐(acetate)、丙酸盐(propionate)、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)、琥珀酸盐(succinate)、草酸盐(oxalate)、乳酸盐(lactate)、酒石酸盐(tartrate)、乙醇酸盐(glycolate)、甲磺酸盐(methanesulfonate)、丁酸盐(butyrate)、戊酸盐(valerate)、柠檬酸盐(citrate)、富马酸盐(fumarate)、马来酸盐(maleate)、苹果酸盐(malic acid salt)等酸加成盐、以及钠盐、钾盐、钙盐等金属盐、铵盐、烷基铵盐等,但并不限定于这些。
作为光增感剂,只要具有增加细胞内的卟啉类的作用,则也可以使用除上述列举的物质以外的光增感剂。
卟啉类转运蛋白抑制剂
对于作为本发明的卟啉类调节剂的卟啉类转运蛋白抑制剂,只要是具有对将蓄积在细胞内的卟啉类排出到细胞外的“卟啉类转运蛋白”的作用产生抑制的物质即可,作为其例子,可以列举出Ko-143、新生霉素(Novobiocin)、烟曲霉毒素C(Fumitremorgin C)、依克立达(Elacridar)、Tariquidar、酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosinkinase inhibitors,例如伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib))、黄酮类(Flavonoids,例如染料木黄酮(Genistein)、柚皮素(Naringenin)、刺槐素(Acacetin)、山柰酚(Kaempferol))、雌酮(Estrone)等针对ATP结合盒亚家族G成员2(ATP-binding cassette subfamily Gmember 2,以下有时简写为ABCG2)的抑制剂;环孢菌素A(cycloporin A)、XR9576、GF120918等针对ATP结合盒亚家族B成员1(ATP-bindingcassette subfamily B member 1,以下有时简写为ABCB1)的抑制剂;Dynasore、MITMAB等针对发动蛋白(Dynamin)的抑制剂、β-雌二醇(β-estradiol)、雌激素酮(Estrone)、依托泊苷(Etoposide)、槲皮苷(Quercetin)、利血平(Reserpine)、维拉帕米(Varapamil)等,但并不限定于这些。另外还需要说明的是,所列举的例子只是列举抑制剂的种类,并不是对抑制剂所针对的抑制对象的“卟啉类转运蛋白”的种类进行限定。
铁剂
对于作为本发明的卟啉类调节剂的铁剂,可以列举出柠檬酸亚铁钠(CAS 50717-86-7)、葡萄糖酸亚铁水合物(CAS 22830-45-1)、硫酸铁(II)七水合物(CAS 7782-63-0)等。可以没有限制地使用本领域中公知的用于活化上述亚铁螯合酶的铁剂。
关于本发明的光增感剂的使用浓度,例如在使用5-ALA作为光增感剂时,优选按照最终浓度达到1μM~10mM的方式进行制备,更优选按照最终浓度达到0.01mM~10mM的方式进行制备,但能够使用的浓度并不限定于此。
关于本发明的抑制剂的使用浓度,根据抑制剂的不同而有很大的差异,基本在1nM~100mM的范围内进行使用,优选以1nM~10mM的范围进行使用,但能够使用的浓度并不限定于此。
关于本发明的铁剂的使用浓度,可以列举出1μM~10mM的范围,但并不限定于此。
(实施方式2)
本发明的实施方式2涉及一种试剂,其是利用本发明上述实施方式1的制造方法制造的。
利用本发明的制造方法制造的试剂的保存期限长,且稳定性高。
例如以光增感剂为5-ALA、抑制剂为新生霉素为例进行说明。
根据SBI Pharmaceutical制的药品情报详情(interview form)可知,5-ALA的溶液保存时间为24小时。而根据面向美国输出食品肉类认证机构的源自牛肉的肠出血性大肠杆菌026、045、0103、0111、0121、0145及0157的检查方法、和日本农林水产省附件US-A1-1(平成30年11月9日)可知,新生霉素的溶液保存时间为1年。因此,如果将这两者混合制成混合溶液,可以预料得到混合溶液的保存时间会非常短,只有24小时,这是因为5-ALA的溶液保存时间只有24小时的缘故。
另一方面,根据上述SBI Pharmaceutical制的药品情报详情(interview form)可知,5-ALA的固体保存时间为3年。而关于新生霉素的固体保存时间,由于混合有新生霉素的培养基粉末的保存时间为1年以上,因此新生霉素的固体保存时间至少也可以为1年以上,由此可知,如果将这两者混合以固体形态进行保存,可以期待保存时间会达到1年以上。因而,如果将本发明的光增感剂和抑制剂的混合物例如进行冷冻干燥制成固体,也可以期待会有1年以上的保存时间。
实施例
1、重量的比较
以下,以光增感剂为5-ALA(盐酸盐形式)、抑制剂为新生霉素为例进行实验,示出由冷冻干燥带来的重量减轻效果。将结果示于下述表1。
表1
2ml份<sup>※1</sup>的重量 | |
溶液的重量 | 2g |
粉末的重量 | 1752μg<sup>※2,3</sup> |
两者的比 | 1142:1 |
※1:细胞培养皿中常用的液体量
※2:以5-ALA(盐酸盐形式)的分子量为167.59、新生霉素的分子量为634.6进行计算
※3:将5-ALA设为5mmol/L、将新生霉素设为60μmol/L
由上述表1可知,经过冷冻干燥的工序,重量减轻效果达到了3个数量级的差异,可知具有在大量输送时或者保存时降低成本的效果。
2、溶液pH的影响
以下,以光增感剂为5-ALA、抑制剂为新生霉素为例进行实验,示出溶液pH对光增感剂和抑制剂产生的影响。
取5-ALA和新生霉素的混合粉末放入容器中,添加水制成溶液。由于5-ALA使得溶液变为酸性,可见新生霉素没有完全溶解而有析出。对该溶液添加NaOH溶液,则可见因溶液变为碱性而新生霉素发生溶解,溶液变得透明,进一步再对该溶液添加醋酸溶液,则溶液又变为酸性,新生霉素再次析出,溶液变得白浊。
由此可知,根据光增感剂和抑制剂的不同,溶液的pH会对光增感剂和抑制剂的混合溶液产生影响。因此,通过预先调节混合溶液的pH,可以制得对检查不会产生不良影响的试剂,从而保证检查的准确性和精度。
3、稳定性评价
3.1光增感剂与抑制剂的混合物的稳定性评价
将5-ALA和新生霉素的混合物的粉末和液体在50℃的环境中进行72小时的加速老化实验,并利用高效液相色谱法对5-ALA与新生霉素的量的变化进行监测。将监测结果示于图1和图2。其中,图1为显示利用高效液相色谱法得到的5-ALA的含量变化的图,图2为显示利用高效液相色谱法得到的新生霉素的含量变化的图。如图1所示,在粉末状态下,5-ALA在不同时间点的测试结果稳定,含量基本没有变化,但在溶液状态下,5-ALA的浓度随着经时时间的延长显著降低。另一方面,如图2所示,新生霉素在粉末状态下和溶液状态下经时后浓度都是基本没有变化。
由此验证了:如前文所述,在光增感剂溶于水等中制成溶液时会发生急速的劣化,这样在很短时间内就不能再使用了,由此,如果是其与调节剂的混合溶液,则该混合溶液的使用期限会受到该光增感剂的劣化的牵制而变得很短,而相对与此,如果使用光增感剂与调节剂的混合物的经冷冻干燥制成的粉末,可以发挥出延长混合试剂的保存时间的效果。
3.2光增感剂与铁剂的混合物的稳定性评价
进行混合有5-ALA和铁剂(葡萄糖酸亚铁水合物,FERROUS GLUCONATE DIHYDRATE,CAS号为22830-45-1)的粉末和液体的加速保存试验。试验在50℃的环境下、最长实施到24小时。对于粉末的检体,在进行比色评价之前,按照达到与液体检体相同的浓度的方式加水溶解。
具体的检体和操作条件如下:
W:水(对照用)
P0:粉末/加热前将放入在冰箱中的试剂直接溶于水
P1:粉末/加热后将粉末加热24小时后溶于水
L0:液体/加热前制备溶液后立即保管在冰箱中
L1:液体/加热后将液体在50℃下加热3小时(水分蒸发掉的部分加水补足)
将试验结果示于图3。如图3所示,以粉末状态保存的样品在加热24小时后也未见颜色发生变化(即样品P1和P0相比颜色未发生变化)。而液体状态保存的样品在加热3小时时即变为红褐色(即加热3小时后的样品L1与样品L0相比,颜色变深,发生了变化),认为该颜色的变化是由铁剂的氧化而导致的。
由此验证了:5-ALA与铁剂的混合物粉末的稳定性优异,而将两者在液体状态下保存时则容易发生氧化,是不稳定的。
以上就本发明的实施方式进行了记载,但对于本领域技术人员来说,各种变形或修正都是清楚的,这种变形或修正只要是不脱离本发明的范围,则应该理解为包括在其中。
产业上的可利用性
根据本发明的试剂的制造方法,可以防止发生人为操作错误,可以在无需在意光增感剂和卟啉类调节剂的添加的顺序、无需在意溶液pH的情况下使用试剂,并且试剂的保存期限长、稳定性高,在用于例如荧光分光光度测定时可以获得高的准确性和精度。
Claims (11)
1.一种试剂的制造方法,其包含将光增感剂和卟啉类调节剂预先混合的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法,其进一步包含将所述光增感剂和所述卟啉类调节剂的混合物进行冷冻干燥的工序。
3.根据权利要求1所述的制造方法,其中,在所述预先混合之前,进一步包含预先添加第一pH调节成分的工序。
4.根据权利要求3所述的制造方法,其中,按照pH达到中性~碱性的方式添加所述第一pH调节成分。
5.根据权利要求3所述的制造方法,其中,对所述光增感剂添加所述第一pH调节成分。
6.根据权利要求1所述的制造方法,其中,在所述预先混合之后,进一步包含添加第二pH调节成分的工序。
7.根据权利要求6所述的制造方法,其中,按照pH达到6.8~7.8的方式添加所述第二pH调节成分。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的制造方法,其中,所述光增感剂为5-氨基乙酰丙酸或其酯、或者它们的盐。
9.根据权利要求1~7中任一项所述的制造方法,其中,所述卟啉类调节剂为卟啉类转运蛋白抑制剂和/或铁剂。
10.利用权利要求1~9中任一项所述的制造方法制造的试剂。
11.根据权利要求10所述的试剂,其被用于荧光分光光度测定。
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