CN115428869B - 一种改善肉鸡肠道健康的生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善肉鸡肠道健康的生物制剂及其制备方法与应用，该生物制剂包括姜酚和百里香酚；所述生物制剂的制备方法包括以下步骤：(1)将生姜粉碎，灭菌，加入纤维素酶酶解，取液体，去除溶剂后得到提取物姜酚；(2)将百里叶粉碎，用乙醇浸提，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取，乙醇洗脱萃取液，过树脂柱，滤液低温结晶、过滤、干燥，得到百里香酚提取物；(3)将姜酚和百里香酚的提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，即为改善肉鸡肠道健康的的生物制剂；该生物制剂中姜酚和百里香酚配合使用，通过两种化合物在动物机体内彼此间发挥的生物学作用相互协同功效，从而有助于调节动物肠道菌群结构，缓解肠道炎症反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物饲料添加剂，特别涉及一种改善肉鸡肠道健康的生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
肉鸡肠道健康状况，在其消化、营养吸收和免疫防御中起着至关重要的作用，肠道不仅是消化吸收营养物质的场所，还是维持机体内部动态平衡的屏障。家禽的生长状况与胃肠道功能和健康密切相关。肠道屏障是抵御肠腔内有害物质(如病原体、毒素和抗原等)的结构和功能的总称，包括物理、化学、免疫和微生物屏障。研究表明，家禽的生长易受到营养、环境和饲养管理等因素的影响，使肠道屏障受损，表现出免疫力下降和肠道菌群失衡等，从而导致全身炎症反应、器官衰竭甚至死亡。抗生素一直被用于促进家禽生长和预防疾病，然而随着抗生素对畜禽产品安全及人类健康危害的揭示，开发新型绿色安全的天然替代品成为研究热点。
植物性饲料添加剂(Phytogenic feed additives，PFA)因其绿色无污染，并且能够调节肠道菌群及其代谢物、免疫等而被广泛应用于畜禽养殖中，发挥促进肠道健康等作用。百里香酚是一种从唇形科植物的挥发油中提取出的单体物质，具有广谱抑菌、消炎和提高机体抗氧化等作用。多酚类化合物已被广泛报道对动物健康产生积极影响。百里香酚的抗氧化特性可能与其酚类结构有关，酚类结构可以吸附和中和自由基并表现出氧化还原特性，它具有有效清除和还原超氧阴离子、羟基自由基和DPPH自由基的能力，并且还能激活核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路，提高下游抗氧化酶如血红素加氧酶1(HO-1)的表达，从而提高抗氧化活性。另有研究证实，百里香酚通过抑制NF-κB通路来降低TNF-α和IL-1β的产生以及MPO活性，减轻LPS诱导的小鼠病理损伤。体外试验证明，用百里香酚预处理IPEC-J2细胞可以通过减少上皮细胞中ROS的产生和促炎细胞因子的表达来减轻LPS诱导的屏障功能损伤。体内研究证实百里香酚可通过改善感染产气荚膜梭菌的肉鸡的肠道完整性和调节其免疫反应来减轻肠道损伤。但百里香酚单独使用添加量大，对肉鸡肠道改善效果不理想。
发明内容
发明目的：本发明第一目的是提供一种提高百里香酚对作用效果的改善肉鸡肠道健康的生物制剂；第二目的是提供所述生物制剂的制备方法；第三目的是提供所述生物制剂的应用。
技术方案：本发明所述的一种改善肉鸡肠道健康的生物制剂，包括姜酚和百里香酚。
优选的，姜酚和百里香酚的质量比为1～8：1～4。
本发明所述的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)姜酚的提取：将生姜粉碎，灭菌，加入纤维素酶酶解，取液体，去除溶剂后得到提取物姜酚；
(2)百里香酚的提取：将百里叶粉碎，用乙醇浸提，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取，乙醇洗脱萃取液，过树脂柱，滤液低温结晶、过滤、干燥，得到提取物百里香酚；
(3)生物制剂的制备：将姜酚和百里香酚的提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，即为改善肉鸡肠道健康的的生物制剂。
步骤(1)生姜清洗后，经液氮冷冻研磨，粉碎后过40目筛；过筛后的姜粉121℃高压蒸汽灭菌20min，加入纤维素酶进行酶解法处理，再经超声处理，离心后，利用真空冷冻干燥器对上清进行提取，得到提取物姜酚。
优选的，步骤(1)姜粉与水的质量体积比为1：10g/mL，pH值为6，每克姜粉酶的添加量为0.07g，酶解温度为50℃，酶解时间为35～45min。
步骤(2)，百里香叶片粉碎后过筛分离；过筛后的百里香粉末密封于聚乙烯袋中，加入乙醇溶液浸提，收集提取液进行提纯；先使用微滤膜对提取液进行过滤，将滤液调整到合适pH值用正丁醇进行萃取，回收萃取液加水溶解，调整溶液pH值然后用乙酸乙酯萃取，洗脱萃取液，过大孔树脂柱，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥；
优选的，步骤(2)所述乙醇浸提的乙醇浓度为40～50wt％，乙醇为百里香粉体积的10～20倍，浸提时间为室温浸提4h～6h；所述正丁醇萃取的pH为2.9～3.2，所述乙酸乙酯萃取的pH为2.1～2.6。
优选的，步骤(3)中，所述二甲基亚砜的含量不高于2‰。
本发明所述的生物制剂在制备肉鸡饲料中的应用。
所述肉鸡饲料中包括基础饲粮、姜酚和百里香酚，其中1kg基础饲粮中加入姜酚10～40mg/kg和5～20mg的百里香酚。
发明机理：百里香酚体外抑菌功效会受到致病菌浓度的影响，而在动物体内，可能是由于当肠道中存在外来有害微生物或潜在治病菌时，会影响百里香酚对肠道微生物的改善与调控作用，因此我们推测完整的肠道黏膜屏障功能是保障百里香酚生物活性得到更充分发挥的重要因素。
姜酚分子由一个芳香环与侧链烷基组成，是生姜辣味物质的主要活性成分(大于75％)，其生物活性很强，姜酚能够通过调控NF-κB信号通路增加ZO-1和claudin-1蛋白的表达以恢复肠道屏障，从而显著逆转脂多糖诱导的回肠炎症反应；还可通过下调Bax和细胞色素c基因表达，抑制caspase-3通路，减轻肠源性脂多糖诱导的回肠细胞凋亡；同时还能通过调控NF-κB、Wnt/β-catenin等通路发挥抗炎作用，通过调控Nrf2/OH-1信号通路，降低ROS水平发挥抗氧化活性，从而预防DSS诱导的溃疡性结肠炎，由此可见，姜酚对肠道黏膜屏障的修复作用十分理想，但姜酚难溶于水(<200μg/L)，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，其在机体内水溶性很低、易在胃肠道环境中降解失活，其分散性差、代谢速度快等问题使其生物利用度受限。而另一种植物提取物-百里香酚生物活性的充分发挥，必须受益于肠道黏膜屏障功能的完整性，否则在外来有害微生物或潜在治病菌存在的前提下，百里香酚对肠道微生物的改善与调控作用均会受到限制，但百里香酚对肠道微生物的调控作用，使得机体的糖脂代谢作用得到充分改善，其次级代谢产物对酚酸类的吸收会产生积极作用。本发明姜酚和百里香酚配合使用，通过两种化合物在动物机体内彼此间发挥的生物学作用相互产生协同功效，姜酚在发挥自身对黏膜屏障功能修复作用的同时，也为百里香酚提供了相对较为理想的肠道环境，使其自身的抗氧化、抑菌、抗炎和对肠道微生态区系的改善等生物学功能可以得到充分发挥，而百里香酚代谢的多级代谢产物，也可能为提高姜酚的生物利用度提供较好的潜在条件，从而有助于调节动物肠道菌群结构，缓解肠道炎症反应。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该生物制剂中姜酚和百里香酚配合使用，通过两种化合物在动物机体内彼此间发挥的生物学作用相互产生协同功效，从而有助于调节动物肠道菌群结构，缓解肠道炎症反应；(2)生物制剂制备方法简单，使用方便，生物利用率高，可以大规模生产应用；(3)该生物制剂应用于肉鸡饲料增强了肉鸡肠道抗氧化能力，改善肠道屏障功能，有效活性成分对肉鸡免疫功能和抗病力的改善具有积极作用，对肉鸡肠道微生物群落具有显著的影响作用，能够增加肉鸡肠道内潜在益生菌的相对丰度，并有效抑制肉鸡肠道内潜在致病菌的相对丰度，对肉鸡肠道健康的调节具有较强的作用效果；(4)姜粉和百里香酚组合后，添加剂量小作用效果强，在高效降低成本的同时，对肉鸡肠道健康的改善也起到了更为理想的效果。
附图说明
图1为本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡死淘汰率的影响；
图2为姜酚制剂、百里香酚制剂和本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡空肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图3为姜酚制剂、百里香酚制剂和本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡回肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图4为姜酚制剂、百里香酚制剂和本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡盲肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图5为低剂量模式下姜酚制剂和百里香酚制剂，以及本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡空肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图6为低剂量模式下姜酚制剂和百里香酚制剂，以及本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡回肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图7为低剂量模式下姜酚制剂和百里香酚制剂，以及本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡盲肠抗氧化相关基因mRNA表达量的影响；
图8为姜酚制剂、百里香酚制剂和本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡盲肠微生物组成的影响；
图9为本发明姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对比于大蒜素-绞股蓝皂苷添加剂对肉鸡死亡率和淘汰率的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
植物提取物的获得与鉴定
1、姜酚的提取与鉴定
姜酚采用生物酶解法提取。具体步骤为：生姜清洗后，经液氮冷冻研磨，粉碎后过40目筛；过筛后的姜粉121℃高压蒸汽灭菌20min，加入纤维素酶进行酶解法处理，反应条件为：料液比为1：10(g/mL)，pH值为6，1g姜粉中酶添加量为0.07g，酶解温度为50℃，酶解时间为35～45min。酶解结束后，经超声处理，超声时间为25～35min，超声温度为50℃，超声功率为180W；然后2500r/min，室温离心20min，然后利用真空冷冻干燥器对上清进行提取，得到提取物姜酚。
姜酚的提取率采用酶标法进行分析。(1)标准工作曲线的绘制：精确称量姜酚标准品500.00mg，使用无水乙醇溶液定容到100mL容量瓶中。用无水乙醇进一步稀释，定容在10mL容量瓶中，将标准溶液稀释成0.00～15.00μg/mL的溶液。(2)使用酶标仪于280nm处测定其吸光度值，空白对照使用无水乙醇；(3)先测定不同浓度标准品，绘制标准品曲线，再计算样品中姜酚的含量。
姜酚纯度的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，对提取物产品进行分析。(1)标准样品溶液的制备，用甲醇对姜酚标准品进行定容，于10mL容量瓶中配制为0.1mg/mL储备液。逐级稀释后，用甲醇、乙腈、水的比例为1：1：1涡旋混匀后作为空白溶剂进样。(2)使用液相色谱仪测定，色谱条件：色谱柱为Waters AcquityBEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；以0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱：0～2.0min，5％B；2.0～2.5min，5％～10％B；2.5～20min，10％～25％B；20～35min，25％～65％B；35～45min，65％～100％B；45～50min，100％B；体积流量0.2mL/min；进样量5μL；柱温40℃；检测器为紫外检测器,检测波长为282nm；灵敏度为0.1AFUS。(3)以标准品为参比，计算提取物中姜酚的含量。采用了高效液相色谱法(HPLC)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示姜酚其纯度在98％以上。
2、百里香酚的提取与鉴定
百里香叶片粉碎后通过20目分离筛后用于提取有效成分，样本储存在-20℃待用。百里香酚采用溶剂浸提法提取。具体步骤为：(1)称量100.0g过筛后的百里香粉密封于聚乙烯袋中，加入1.5L浓度为50％的乙醇溶液，加入百里香粉15倍体积、浓度为50％(体积分数)的乙醇溶液，浸提两次，浸取时间为6h，收集浸提液用于后续分离提纯。(2)百里香酚的分离与纯化：先使用1.4μm微滤膜对提取液进行预处理，过滤三次，除去提取液中的悬浮颗粒(果胶、蛋白等)；再将上一步滤液用盐酸调整pH至3.1，以1.8倍体积正丁醇进行萃取两次，每次时间22min，回收正丁醇用于下一步操作；将正丁醇加4.5倍体积水至溶解，用盐酸调整pH至2.4，用体积比为5:3的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取22min；使用75％的乙醇溶液洗脱萃取液，然后通过X-5大孔树脂柱，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥。
百里香酚含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，对提取物产品进行定量分析。(1)标准样品溶液的制备：使用分析天平准确称量出4.950mg的百里香酚标准品，使用无水乙醇定容至10mL，浓度为0.495mg/mL。(2)使用液相色谱仪测定，色谱条件：Waters C18(150mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈-0.5％磷酸水(35∶65)；流速为1.0mL/min；检测器为紫外检测器,检测波长为332nm；灵敏度为0.1AFUS；柱温为25℃；溶解介质为无水乙醇。(3)以标准品为参比，计算提取物中百里香酚的含量。采用了高效液相色谱法(HPLC)对提取物产品进行定量分析以进行鉴定，鉴定结果显示百里香酚其纯度在98％以上。
3、两种植物提取物储备液制备
(1)姜酚提取物制备：称取8.00g姜酚于离心管中，加入20mL二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床4h(37℃，140rpm)，每隔40min取出混匀20s。取出后用无菌水定容至20mL，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/mL的储存液，于4℃冰箱保存备用。
(2)百里香酚提取物：称取8.00g百里香酚于离心管中，加入20mL二甲基亚砜溶解混匀，置于摇床4h(37℃，140rpm)，每隔40min取出混匀20s。取出后用无菌水定容至20mL，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/mL的储存液，于4℃冰箱保存备用。
(3)将两种植物提取物储备液分别稀释，姜酚稀释成20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL；百里香酚稀释成10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL将两种组合制剂按浓度2：1混合后涡旋40s，置于摇床6h(37℃，140rpm)，每隔40min取出混匀20s，制成植物提取物应用液。
实施例2
试验设计
采用完全随机试验设计，选取1日龄、平均体重为(44.65±1.45)g的健康白羽肉鸡(AA)肉仔鸡公鸡雏200只，随机分成4个组，分别为对照组(Con Group)、姜酚组(GinGroup)、百里香酚组(Thy Group)和姜酚-百里香酚组(Gin×Thy Group)，每组5个重复，每个重复10只鸡，各组体重无显著差异(P>0.05)。每个重复置于同一笼(0.9m×0.6m)中。基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，参照《鸡饲养标准》(NY/T33-2004)配制成粉状配合饲粮。对照组饲喂基础饲粮，姜酚组饲喂基础饲粮+60mg/kg比例的姜酚制剂，百里香酚组饲喂基础饲粮+30mg/kg比例的百里香酚制剂，姜酚-百里香酚组饲喂基础饲粮+30mg/kg比例的姜酚制剂+15mg/kg比例的百里香酚制剂(姜酚制剂与百里香酚制剂预先制成姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂)。试验于南京农业大学动物实验中心进行，时间为2021年5月～2021年7月，试验期间肉鸡自由采食和饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。肉鸡采用三层笼养方式进行饲养，鸡舍内采用23h人工光照，1h黑暗处理，温度由1日龄时的34℃逐步降低至21日龄时的24℃，然后保持大致稳定。试验期42d，分为育雏期(1-21日龄)和育成期(22-42日龄)2个阶段。试验第42天，以每个重复为单位，空腹12h后称重，随后从每组中选取10只肉鸡(即每个重复依据平均体重选取2只)进行屠宰及后续样本采集工作。
实施例3
死淘率与生长性能指标测定
在整个试验期间每周吉拉尼各组试验鸡的体重，对未达到标准体重90％的试验鸡只则予以淘汰，对各组试验鸡只死淘数量进行记录并统计。于试验开始时对1日龄肉仔鸡以每个重复为单位称取其初始体重，并记录。试验期间分别于21和42日龄，空腹3h后以每个重复为单位测定肉仔鸡的体重，同时统计各组给料量和剩余料量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比，用以评价姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡死淘率和各项生长性能指标的影响效果，结果如图1和表1所示。
表1饲粮添加姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡生长性能的影响
对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡死淘率结果如图1所示：在肉鸡1-21日龄阶段，对照组肉鸡死亡率为4％，淘汰率为4％；姜酚组组肉鸡死亡率为4％，淘汰率为2％；百里香酚组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为4％；姜酚-百里香酚组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为0％。在肉鸡22-42日龄阶段，对照组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为2％；姜酚组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为2％；百里香酚组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为4％；姜酚-百里香酚组肉鸡死亡率为0％，淘汰率为2％。在肉鸡1-42日龄阶段，对照组肉鸡死亡率为6％，淘汰率为6％；姜酚组组肉鸡死亡率为6％，淘汰率为4％；百里香酚组肉鸡死亡率为4％，淘汰率为8％；姜酚-百里香酚组肉鸡死亡率为2％，淘汰率为2％。对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡生长性能结果如表1所示：与对照组相比，在饲粮中添加姜酚制剂、百里香酚制剂或姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂均能极显著提高肉鸡21日龄体重和肉鸡1-21日龄平均日增重(P<0.05)，但对肉鸡42日龄体重、22-42日龄平均日增重和肉鸡1-42日龄平均日增重均无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡1-21日龄平均日采食量、22-42日龄平均日采食量和肉鸡1-42日龄平均日采食量均无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡1-21日龄料重比、22-42日龄料重比和1-42日龄料重比均无显著性影响(P>0.05)。
以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对降低肉鸡养殖过程中的死亡率和淘汰率具有重要作用，提高肉鸡的存活率是保障肉鸡养殖经济效益的重要指标之一，同时虽然生长性能结果中部分指标改善并不具有显著性，但肉鸡存活率的提高表明在肉鸡养殖过程中使用姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可能改善了肉鸡的免疫功能和抗病力。
实施例4
小肠形态结构的测定
在试验期第42天，每个重复选取1只接近重复平均体重的肉鸡进行屠宰，分离空肠、回肠，切取空肠和回肠中间处约1～2cm的肠段，用生理盐水冲洗干净食糜，浸泡于4％多聚甲醛中。将固定好的空肠和回肠组织样品经脱水、包埋、切片、苏木精－伊红染色。用虚拟显微镜对染色的切片进行观察、拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度与隐窝深度的比率，结果如表2所示。
表2饲粮添加姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对42日龄肉鸡小肠形态的影响
由表2可得，与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂，或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可以显著提高肉鸡回肠绒隐比(P<0.05)，但单独添加姜酚制剂对肉鸡回肠绒隐比无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡空肠的绒毛高度、隐窝深度、绒隐比，以及回肠绒毛高度和隐窝深度均无显著性影响(P>0.05)。
虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(姜酚60mg/kg，百里香酚30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量姜酚30mg/kg、低剂量百里香酚15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如表3所示，从表3中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或姜酚制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡空肠的绒毛高度、隐窝深度、绒隐比，以及回肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均无显著性影响(P>0.05)。
表3饲粮添加低剂量姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对42日龄肉鸡小肠形态的影响
以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对提高肉鸡回肠绒隐比具有重要作用，绒毛高度和隐窝深度分别是肠道消化和吸收功能以及细胞成熟率的主要指标，绒隐比的降低会减少成熟的肠上皮细胞的数量，不利于肠道发育，绒隐比的提高，意味着姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可能提高了肉鸡肠道的消化吸收功能，并且对肉鸡回肠绒隐比的提升作用优于单一提取物添加模式，同时当单独运用低剂量的姜酚制剂(30mg/kg)或百里香酚制剂(15mg/kg)时，对肉鸡42日龄小肠形态基本不会产生显著改变表观指标的作用。
实施例5
肉鸡免疫功能和抗氧化能力指标的测定
在试验期第42天每个重复选取2只接近该重复平均体重的鸡，肉鸡空腹12h(可自由饮水)后进行屠宰采集样品，完整取出肉鸡胸腺、法氏囊和脾脏，剪去周边组织，用滤纸擦干后称重，同时计算免疫器官指数，其中免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/屠宰前活重(kg)。同时在解剖后，采集血清样品于无菌采血管中，空肠、回肠和盲肠食糜样品于2mL无菌冻存管中，保存于液氮中。另外用预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净空肠、回肠和盲肠组织组织后，用无菌载玻片刮取各肠段黏膜装于2mL无菌冻存管中，并放置于液氮中保存待用，用于常规成分和抗氧化功能检测；抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量按照检测试剂盒中的说明书进行测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。同时分析抗氧化相关基因mRNA表达量，用Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取总RNA，并使用微量分光光度计(Thermo,ND-2000)检测RNA浓度。用ⅢAll-in-one RT Super MixPerfect for qPCR试剂盒将RNA反转录成cDNA,反转录后的cDNA分装后置于-80℃保存。根据ChamQ SYBR qPCR试剂盒(Vazyme，南京)说明书进行操作:2×ChamQ SYBR qPCR MasterMix 10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，50×ROX Reference Dye1 0.4μL，cDNA 2μL，加ddH2O至20μL，反应条件:95℃30s；95℃10s，60℃30s，共40个循环。熔解曲线测定程序:95℃15s，60℃1min，95℃15s。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA相对表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。
表4饲粮添加姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对42日龄肉鸡免疫器官指标的影响
(1)对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡42日龄免疫器官指标结果如表4所示：与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂、或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可以显著提高肉鸡42日龄法氏囊指数(P<0.05)，并且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡器官指数的提升作用明显优于单一提取物添加模式，但单独添加百里香酚制剂对肉鸡42日龄法氏囊指数无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，单独添加百里香酚制剂，或添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡42日龄胸腺指数和脾脏指数均无显著性影响(P>0.05)。
(2)对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡血清和肠道抗氧化功能结果分析如表5所示：与对照组相比，在饲粮中添加姜酚制剂、百里香酚制剂，以及姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂均可以显著提高肉鸡血清中总抗氧化能力(T-AOC)的含量(P<0.05)，并且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂作用显著高于单一提取物添加模式(P<0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加姜酚制剂、百里香酚制剂，以及姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量均无显著性影响(P>0.05)。
表5饲粮添加姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对42日龄肉鸡血清和肠道抗氧化指标的影响
与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂能够显著提高肉鸡空肠中总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量(P<0.05)，且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂的效果优于单一添加组，但对肉鸡空肠中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)的含量无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，或单独添加百里香酚制剂对肉鸡空肠中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量均无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂能够显著提高肉鸡回肠中总抗氧化能力(T-AOC)的含量(P<0.05)，且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂的效果优于单一添加组，但对肉鸡回肠中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)的含量无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，或单独添加百里香酚制剂能够显著提高肉鸡回肠中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量(P<0.05)，但提升效果低于姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂的作用，同时对肉鸡回肠中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)的含量无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂能够显著提高肉鸡盲肠中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量(P<0.05)，且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂的效果优于单一添加组，但对肉鸡盲肠中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)的含量无显著性影响(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，或单独添加百里香酚制剂对肉鸡盲肠中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量均无显著性影响(P>0.05)。
(3)虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(姜酚60mg/kg，百里香酚30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量姜酚30mg/kg、低剂量百里香酚15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如表6所示，从表6中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或姜酚制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡血清和肠道抗氧化功能指标中的总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)的含量均无显著性影响(P>0.05)。以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚(均低剂量组合)改善肉鸡肠道健康制剂对提高肉鸡血清和肠道中的总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量具有重要意义，并且对肉鸡抗氧化指标的提升作用优于单一提取物添加模式。
表6饲粮添加低剂量姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡血清和肠道抗氧化指标的影响
(4)对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡空肠、回肠和盲从的抗氧化相关基因结果分析如图2、图3和图4所示。从图2中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可以显著提高肉鸡空肠中抗氧化基因Nrf2、HO-1和GPX的mRNA表达量(P<0.05)，但是对NQO1和SOD1的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂，或单独添加百里香酚制剂对肉鸡空肠中抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。从图3中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可以显著提高肉鸡回肠中抗氧化基因Nrf2、SOD1和GPX的mRNA表达量(P<0.05)，但是对HO-1和NQO1的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂可以显著提高肉鸡回肠中抗氧化基因Nrf2的mRNA表达量(P<0.05)，但是对HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂对肉鸡回肠中抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。从图4中可以看出，与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂可以显著提高肉鸡盲肠中抗氧化基因Nrf2、SOD1和GPX的mRNA表达量(P<0.05)，但是对HO-1和NQO1的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂可以显著提高肉鸡盲肠中抗氧化基因GPX的mRNA表达量(P<0.05)，但是对Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。与对照组相比，在饲粮中单独添加百里香酚制剂对肉鸡盲肠中抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。
(5)虽然从实际结果中可以发现在单一模式添加时仍有部分指标产生了积极的变化，但对添加剂的用量要求为已报道文献中的最低标准(姜酚60mg/kg，百里香酚30mg/kg)，且为本试验组合制剂使用量的数倍，为此通过模拟组合制剂中的添加剂剂量，对单一模式(低剂量姜酚30mg/kg、低剂量百里香酚15mg/kg)添加的使用效果进行了分析，其对比结果如图5、图6和图7所示，从图5、图6和图7中可以看出，与对照组相比，百里香酚制剂或姜酚制剂单一模式同比于组合制剂添加剂量时，对肉鸡空肠、回肠和盲肠中抗氧化相关基因Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GPX的mRNA表达量影响均不显著(P>0.05)。
以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对改善肉鸡42日龄的免疫器官指数、血清和肠道抗氧化指标，以及肠道抗氧化相关基因的mRNA表达量具有重要作用，并且对肉鸡免疫能力的提升作用明显优于单一提取物添加模式。
实施例6
肠道黏膜屏障指标的测定
肠道黏膜紧密连接相关基因表达的测定方法为：称取0.2g空肠、回肠和盲肠黏膜置于1.5mL无菌保存管中，加入1mL预冷的Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)充分匀浆，按照说明书要求分别提取各肠段黏膜中的总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)测定RNA浓度和纯度(1.8<OD260/280<2.2)。将符合标准的RNA稀释到同一水平浓度后使用HiScript III All-in-one RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将RNA反转录成cDNA分装保存于-20℃冰箱。利用QuanStudio7 Flex荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行荧光定量PCR反应，参照荧光定量试剂盒说明书(ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行qPCR反应体系的配制。20μL反应体系如下：ChamQ SYBR qPCR Master Mix(2×)10μL，ROX Reference Dye 1(50×)0.4μL，上下游引物(10μmol·L-1)各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O6.8μL。qPCR反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，持续40个循环，之后95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。使用β-actin作为内参基因，所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA相对表达量。
表7饲粮添加姜酚制剂、百里香酚制剂和姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡肠道黏膜屏障指标的影响
对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡空肠、回肠和盲肠黏膜紧密连接相关基因结果分析如表7所示：与对照组相比，在饲粮中添加姜酚制剂、百里香酚制剂，以及姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂均可以显著提高肉鸡血清中总抗氧化能力(T-AOC)的含量(P<0.05)，并且姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂作用显著高于单一提取物添加模式(P<0.05)。与对照组相比，在饲粮中添加姜酚制剂、百里香酚制剂，以及姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对肉鸡血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量均无显著性影响(P>0.05)。依据试验结果数据我们推断，低剂量添加模式下，单一植物提取物添加对肉鸡空肠、回肠和盲肠黏膜紧密连接相关基因各项指标均不会产生显著影响。
以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对改善肉鸡42日龄空肠、回肠和盲肠黏膜紧密连接相关基因具有重要作用，并且对肉鸡肠道黏膜屏障功能的提升作用明显优于单一提取物添加模式。
实施例7
肠道微生物区系相关指标的测定
基于16S rRNA的微生物群分析的测定方法为：称取0.3g盲肠食糜样品按照CTAB提取DNA法提取样品中的总DNA，接着使用Nanodrop ND-2000分光光度计(Thermo FisherScientific,Inc.,Massachusetts,USA)测定DNA浓度和纯度，并将提取的DNA保存在-80℃，直至分析。使用正向引物343F(TACGGRAGGCAGCAG)和反向引物798R(AGGGTATCTAATCCT)用于扩增细菌16S rDNA基因的V3-V4区。循环参数如下：94℃预变性5min，94℃反应30s，56℃反应30s，72℃反应20s，持续26个循环，之后72℃ 5min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，在Illumina MiSeq平台上对PCR产物进行了高通量焦磷酸测序。使用FLASH软件将paired-endclean reads整合成原始标签，最小重叠量为10bp，错配错误率为2％。在特定的过滤条件下，用QIIME(版本1.9.1)对原始标签的噪声序列进行过滤，得到高质量测序标签。使用UPARSE(版本9.2.64)将高质量测序标签聚类为相似度≥97％的操作分类单元OTU。基于SILVA数据库(版本132)，使用RDP分类器(版本2.2)通过naive Bayesian模型将代表性OTU序列进行分类，置信阈值范围为0.8。使用Krona(版本2.6)对各个分类法的丰度统计数据进行可视化处理。Venn图、堆叠图和基于bray curtis距离的主坐标分析Principalcoordinates analysis，PCoA均通过R软件包进行可视化处理。使用QIIME(版本1.9.1)计算α多样性指数，并用R软件进行展示。
对照组、姜酚组、百里香酚组，以及姜酚-百里香酚组肉鸡盲肠食糜菌群在门水平和属水平上的结果分析如图8所示。其中优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)(图8A)。单因素方差分析显示(图8C-E)，与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂能够显著提高肉鸡肠道微生物区系中Firmicutes的相对丰度(P<0.05)和Fusobacteria的相对丰度(P<0.05)，而Bacteroidetes的相对丰度显著降低(P<0.05)。同时，与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂、或单独添加百里香酚制剂，对肉鸡肠道微生物区系的菌门水平影响较小。其中Firmicutes的相对丰度和Fusobacteria的相对丰度对于维持肉鸡的糖脂代谢和机体生理生化进程具有重要意义，而Bacteroidetes的相对丰度降低有益于微生物区系的稳态。属水平上相对丰度前二十的的菌属分布如图8B所示，其中优势菌属为拟杆菌属(Bacteroides)、另枝菌属(Alistipes)、Ruminococcaceae UCG-014、Ruminococcus torques group。单因素方差分析显示(图8F-J)，与对照组相比，在饲粮中添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂能够显著提高肉鸡肠道微生物区系中Alistipes的相对丰度(P<0.05)和Ruminococcus_1的相对丰度(P<0.05)，而Bacteroides和Parabacteroides的相对丰度显著降低(P<0.05)，而Christensenellaceae R-7group的相对丰度与对照组相比有增加的趋势(P＝0.075)。同时，与对照组相比，在饲粮中单独添加姜酚制剂、或单独添加百里香酚制剂，对肉鸡肠道微生物区系的菌属水平影响较小。依据试验结果数据我们推断，低剂量添加模式下，单一植物提取物添加对肉鸡盲肠微生物区系的各项指标均不会产生显著影响。其中Alistipes相对丰度和Ruminococcus_1相对丰度的提高，Bacteroides相对丰度和Parabacteroides相对丰度的降低，是肠道内潜在有益菌提高、潜在有害菌降低的重要表现，有益于肉鸡肠道微生物区系的稳态。
以上结果表明，饲粮添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂对改善肉鸡42日龄盲肠微生物区系门、属水平的组成与结构具有重要作用，并且对肉鸡盲肠微生物区系的改善作用明显优于单一提取物添加模式。
对比例1
采用等量的大蒜素代替实施例2中的姜酚、等量的绞股蓝皂苷代替实施例2中的百里香酚，并按本发明后续的实施例3中对肉鸡死亡率和淘汰率进行测定实验，大蒜素-绞股蓝皂苷组(All×GYP)与姜酚-百里香酚组(Gin×Thy)肉鸡1-21日龄、22-42日龄和1-42日龄三个阶段的死亡率和淘汰率结果分析如图9所示。
从图9可以看出，与在饲粮中添加大蒜素-绞股蓝皂苷相比，添加姜酚-百里香酚改善肉鸡肠道健康制剂均能显著降低肉鸡在1-21日龄的死亡率、22-42日龄的淘汰率，以及1-42日龄的死亡率和淘汰率(P<0.05)。
对比发现，两种组合制剂的叠加与协同作用在本试验中产生了较为理想的实际效果，但并非任意两两组合均可产生叠加及协同效应，同时也不是任何可以通过肠道黏膜屏障修复作用与微生态改善肠道微生物组成的物质如大蒜素-绞股蓝皂苷组合便可以改善肉鸡的各项生理指标，进而降低肉鸡死亡率和淘汰率。而采用大蒜素-绞股蓝皂苷的组合在前期预试验中发现二者混合时会产生相互抑制的作用。
Claims (8)
1.一种改善肉鸡肠道健康的生物制剂，其特征在于，包括姜酚和百里香酚，姜酚和百里香酚的质量比为 2:1。
2.一种权利要求1所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）姜酚的提取：将生姜粉碎，灭菌，加入纤维素酶酶解，取液体，去除溶剂后得到提取物姜酚；
（2）百里香酚的提取：将百里叶粉碎，用乙醇浸提，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取，乙醇洗脱萃取液，过树脂柱，滤液低温结晶、过滤、干燥，得到百里香酚提取物；
（3）生物制剂的制备：将姜酚和百里香酚的提取物用二甲基亚砜溶解后，加水过滤制成储存液，即为改善肉鸡肠道健康的生物制剂。
3.根据权利要求2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述二甲基亚砜的含量不高于2‰。
4.根据权利要求2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述乙醇浓度为40~50wt%，所述乙醇为百里香粉体积的10~20倍。
5.根据权利要求2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述正丁醇萃取的pH为2.9~3.2。
6.根据权利要求2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙酸乙酯萃取的pH为2.1~2.6。
7.一种权利要求1所述的生物制剂在制备肉鸡饲料中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉鸡饲料中包括基础饲粮、姜酚和百里香酚，其中1kg基础饲粮中加入姜酚10~40mg/kg和5~20mg的百里香酚。
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