CN108450663A - 一种畜禽肠屏障保护剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种畜禽肠屏障保护剂及制备方法,采用氯化十六烷基吡啶修饰改性蒙脱石负载百里香酚。经氯化十六烷基吡啶修饰改性的蒙脱石,增加了蒙脱石的层间距、比表面积和疏水性,极大增强了对百里香酚的吸附率。蒙脱石具有很好的生物相容性和胃肠道粘膜亲和性,对所负载的百里香酚具有控释作用,可以更有效发挥百里香酚的抗菌、抗炎症、抗氧化作用,在抗菌活性上有组合增效效应,从而改善仔猪肠屏障。本发明的畜禽肠屏障保护剂可修复、保护肠上皮细胞,维护肠黏膜正常屏障,维护肠道有益微生物菌系,提高畜禽健康水平,提高日增重和饲料转化效率。
Description
技术领域
本发明涉及畜禽肠屏障保护剂及制备方法。
背景技术
肠道对畜禽健康的重要性不可低估。肠黏膜作为肠腔恶劣的环境和机体组织精细调节的体内平衡之间的过滤器,它不仅可以调节着营养素和分子的通过,而且还可避免细菌、毒素和日粮抗原向黏膜下的组织或机体循环系统的渗透。有效的肠道屏障包含许多组成要素,例如黏液层及其相关的微生物组、免疫效应子和细胞间紧密连接的完整性。研究表明,肠屏障功能紊乱能够影响动物的生产性能和健康。肠屏障功能的调节主要依赖于细胞旁路途径,紧密连接在维持肠屏障完整性上起着重要的作用。它们是一类多蛋白复合物,由所谓的“跨膜蛋白”和包括激酶在内的调控分子组成。良好的肠道屏障功能对肠道健康至关重要。屏障功能发生紊乱可能会造成肠腔内物质的渗漏,促进炎症发生,增加肠道疾病暴发的风险。
百里香酚,2-异丙基-5-甲基苯酚,分子式C10H14O,白色或微黄色结晶体。Trevisi(2010)研究表明,饲料中添加百里香酚降低仔猪日釆食量和日增重,提高词料转化率。Janczyk(2008)对断奶仔猪肠道菌群研究中发现,饲料中添加百里香酚对空肠菌群多样性无显著影响。Luna(2010)肉鸡饲喂百里香酚能改善肉鸡的肉质,降低氧化反应。Schone(2006)报道,饲粮中添加55-165mg/kg百里香酚能改善仔猪生产性能。Janczyk(2009)报道,百里香酚在添加量较低的情况下效果不明显,高剂量百里香酚(10g/kg)才能显著改善仔猪肠道微生物菌群。但较高浓度的百里香酚对宿主细胞也会形成毒性作用,造成细胞膜通透性改变、细胞质外泄、DNA损伤。Suntres等(2015)对大鼠口服百里香酚,发现半致死剂量为980mg/kg体重,而通过注射方式让小鼠摄入百里香酚,其半致死剂量更低。因此,在动物生产中应用百里香酚需要注意添加量,不能片面追求抑菌效果加大添加剂量而忽视其对宿主细胞的毒性作用。在体试验发现,给仔猪口服的百里香酚在胃和小肠前段几乎被完全吸收,在1.35h内达到血液浓度峰值,同时尿液中也发现高剂量的百里香酚,在仔猪肠道的半衰期约为2h。在给断奶仔猪饲喂含500mg/kg或2000mg/kg百里香酚的日粮后检测发现,当摄入量升高时,胃和尿液中两者含量也升高,而且2种添加水平下超过90%的百里香酚都在消化道前段被吸收。因此,尽管百里香酚对肠道健康有多方面的功效,但由于其在消化道前段极易被快速吸收进入循环系统,难以到达整个肠道发挥作用,极大限制其功效的发挥。为了让百里香酚能够到达后段肠道并定点释放,在一定时间和空间内达到合适浓度,有必要对百里香酚进行制剂处理或者化学修饰。另外,百里香酚还存在诸多缺陷而限制其在饲料上应用:①强烈的刺激性气味既影响饲料加工又降低畜禽采食量;②百里香酚易氧化,挥发性强,不稳定,必须加大剂量使用;③百里香酚对动物毒性比较强,对大鼠的口服半数致死量为980mg/kg体重;④百里香酚是脂溶性物质,在畜禽肠道中不能有效的溶出,影响了其作用效果。这说明百里香酚必须通过制剂保护处理送达肠道,才有可能发挥抑菌、抗炎、抗氧化及其他作用。Li(2012)等报道,添加100mg/kg麦芽糖糊精包被百里香酚,可显著降低断奶仔猪腹泻指数。采用麦芽糖糊精包被的缺点是生产过程中有效成分热损失大、能耗大,需要大型喷雾干燥设备,设备投入大。
控释系统对药物的释放部位、速度和方式具有选择性和可控性,可实现目标物的靶向传输和控缓释,提高其利用率和作用效果。控释技术的关键是控释载体的选择。蒙脱石是由颗粒极细的含水硅铝酸盐组成的层状矿物,在其片层结构中,中间的铝氧八面体亚层借助氧原子通过共价键连接着两个硅氧四面体亚层,形成三明治结构,层厚约1nm,长宽约100nm。铝氧八面体亚层和硅氧四面体亚层均可发生类质同象置换,使蒙脱石结构层带负电荷,在晶体构造层间形成可交换的阳离子和水分子。蒙脱石高比表面积和强吸/脱附力特性使其与药物可发生插层、物理化学吸附和离子交换反应,可作为控释药物载体,具有吸附量大、稳定性高、价格低廉、无毒等特性,开发潜力巨大。近年来,蒙脱石作为药物载体,尤其是经过修饰的蒙脱石作为药物控释载体的研究越来越受到学者和产业界的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种畜禽肠屏障保护剂及制备方法。
畜禽肠屏障保护剂的制备方法包括以下步骤:
1)将蒙脱石,连同氯化钠,加水搅拌均匀,制成浓度为10%~20%的悬浮液矿浆(本发明中矿浆浓度均指浆液中固体矿粒的重量百分数,下同),室温钠化后,水洗若干次,用水重新制成浓度为15%~35%的矿浆;
2)将氯化十六烷基吡啶,于搅拌下缓慢加入到步骤1)的矿浆中,室温连续搅拌反应一定时间;
3)取百里香酚以及乙醇,将百里香酚溶解于乙醇中,于搅拌下将上述的百里香酚乙醇溶液缓慢加入步骤2)的矿浆中,室温连续搅拌反应一定时间;
4)步骤3)的反应液脱水,所得的滤饼烘干、粉碎,得到畜禽肠屏障保护剂。
上述方案中,各步骤中的参数可采用如下优选参数。
作为优选,步骤1)中,所述氯化钠的添加量为蒙脱石重量的7%~15%。
作为优选,步骤1)中,室温钠化时间为10~15小时,水洗次数为3~5次。
作为优选,步骤2)中,所述氯化十六烷基吡啶的添加量为蒙脱石重量的8%~15%。
作为优选,步骤2)中,室温连续搅拌反应时间为2~6小时。
作为优选,步骤3)中,所述百里香酚的添加量为蒙脱石重量的3%~8%。
作为优选,所述的乙醇采用50%~100%乙醇(本发明中乙醇的百分比均指乙醇的体积百分数,下同),乙醇的重量为百里香酚重量的1~1.5倍。
作为优选,步骤3)中,室温连续搅拌反应时间为2~5小时。
本发明的另一目的在于提供一种由上述任一方法制备的畜禽肠屏障保护剂。
本发明中使用的蒙脱石、氯化十六烷基吡啶、百里香酚均是市售商品。制备方法的浆液脱水工艺,可因地制宜,选用离心或过滤等方法进行脱水。脱水后所得的滤饼采用真空低温干燥。烘干可选用常规粉碎设备粉碎。
本发明畜禽肠屏障保护剂的使用方法是:按0.05~0.15%添加剂量拌入畜禽配合饲料中。本发明的优点是:
(1)蒙脱石作为控释载体,具有高比表面积和强吸/脱附力特性、稳定性高、价格低廉、无毒等特性。
(2)氯化十六烷基吡啶为阳离子季铵盐类化合物,是一种表面活性剂,为非抗生素类杀菌剂。经氯化十六烷基吡啶修饰改性的蒙脱石,增加了蒙脱石的层间距和比表面积,并使蒙脱石表面形成有机相,提高蒙脱石表面疏水性,极大增强了对百里香酚的吸附率。
(3)蒙脱石具有很好的胃肠道粘膜亲和性和控释性能,可有效避免百里香酚在前段消化道的吸收且不影响其抑菌效果,有利于百里香酚全肠道控制释放,从而更有效发挥百里香酚的抗菌、抗炎症、抗氧化、保护肠粘膜等作用,而且可以显著降低百里香酚的毒性。
(4)本发明添加剂所负载的氯化十六烷基吡啶和百里香酚在抗菌活性上有组合增效和协同效应,实验发现对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等都有抗菌协同作用。
(5)蒙脱石由于其表面特殊的物理化学性质,对各种病毒、病原菌以及所产生的毒素等有优良的吸附能力;蒙脱石在消化道可形成胶体保护膜,并能加速受损粘膜上皮细胞的修复和再生,起到加强、修复、保护消化道粘膜屏障的作用。
(6))本发明的饲料添加剂,可修复、保护肠上皮细胞,维护肠黏膜正常屏障,维护肠道有益微生物菌系,提高畜禽健康水平,提高日增重和饲料转化效率。
(7)本发明实施方法简便,适宜工业化生产,成本较低。本发明所制得的畜禽肠屏障保护剂易于与饲料混合,形成均匀分散系,使用方便;
具体实施方式
本发明结合以下实例作进一步的说明。
实施例l:
1)将蒙脱石,连同相当于蒙脱石重量15%的氯化钠,加水搅拌均匀,制成浓度为10%的悬浮液矿浆,室温钠化10小时,水洗3次,用水重新制成浓度为15%的矿浆;
2)将相当于蒙脱石重量15%的氯化十六烷基吡啶,于搅拌下缓慢加入到步骤1)的矿浆中,室温连续搅拌反应6小时;
3)称取蒙脱石重量8%的百里香酚,称取百里香酚等重量的100%乙醇,将百里香酚溶解于乙醇中。于搅拌下将上述的百里香酚乙醇溶液缓慢加入步骤2)的矿浆中,室温连续搅拌反应5小时;
4)步骤3)的反应液离心脱水,所得的滤饼真空干燥、粉碎,得到畜禽肠屏障保护剂。
采用美国国立临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的肉汤稀释法测定最小抑菌浓度,结果表明,原粉百里香酚对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为350,300,400μg/mL;本发明的畜禽肠屏障保护剂对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(以百里香酚计)分别为150,100,150μg/mL。
选用120头28±1日龄“杜长大”仔猪,按胎次一致、体重相近、公母各半的分组方法,采用随机区组设计共设4组,即对照组:基础日粮组;试验Ⅰ组:基础日粮组+150mg/kg原粉百里香酚;试验Ⅱ组:基础日粮+本发明的肠黏膜屏障保护剂(含60mg/kg百里香酚,添加量为试验Ⅰ组的40%);试验Ⅲ组:基础日粮+本发明的肠黏膜屏障保护剂(百里香酚含量与试验Ⅰ组相同)。每组设3个重复,每重复10头仔猪。饲喂2周。结果如下
与对照组相比,试验组腹泻率显著下降(P<0.05);试验II组与试验I组差异不显著(P>0.05),试验III组与试验I组差异显著(P<0.05)。试验组间日采食量、料重比差异不显著。
与对照组相比,试验组血浆D-乳酸和内毒素含量显著降低;试验II组内毒素含量与试验I组差异不显著(P>0.05),试验III组血浆D-乳酸和内毒素含量与试验I、II组差异显著(P<0.05)。
与对照组相比,试验I组空肠内容物大肠杆菌/乳酸杆菌比率显著下降,试验II组和III组空肠内容物和结肠内容物大肠杆菌/乳酸杆菌比率显著下降;试验II组空肠内容物和结肠内容物大肠杆菌/乳酸杆菌比率与试验I组差异不显著(P>0.05);试验III组结肠内容物大肠杆菌/乳酸杆菌比率显著低于试验I组(P<0.05);试验II组与试验III组空肠内容物菌群数量差异不显著(P>0.05)。
与对照组相比,试验I组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比率显著增加,试验II组和III组空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比率显著增加;试验II组十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比率与试验I组差异不显著(P>0.05);试验III组绒毛高度/隐窝深度比率显著高于试验I组(P<0.05),试验II组与试验III组十二指肠绒毛高度/隐窝深度比率差异不显著(P>0.05)。
上述结果表明,使用本发明的畜禽肠屏障保护剂(含60mg/kg百里香酚)在缓解仔猪腹泻和保护肠屏障上可以达到150mg/kg原粉百里香酚的作用效果。使用本发明的畜禽肠屏障保护剂(含150mg/kg百里香酚)在缓解腹泻和保护肠屏障上的效果显著优于150mg/kg原粉百里香酚。与原粉百里香酚相比,本发明的畜禽肠屏障保护剂可有效避免百里香酚在前段消化道的吸收,有利于百里香酚全肠道控制释放,能促进肠道后段肠屏障的改善,从而更有效发挥百里香酚的作用。
实施例2:
1)将蒙脱石,连同相当于蒙脱石重量7%的氯化钠,加水搅拌均匀,制成浓度为20%的悬浮液矿浆,室温钠化15小时,水洗5次,用水重新制成浓度为35%的矿浆;
2)将相当于蒙脱石重量8%的氯化十六烷基吡啶,于搅拌下缓慢加入到步骤1)的矿浆中,室温连续搅拌反应2小时;
3)称取蒙脱石重量3%的百里香酚,称取百里香酚重量1.5倍的50%乙醇,将百里香酚溶解于乙醇中。于搅拌下将上述的百里香酚乙醇溶液缓慢加入步骤2)的矿浆中,室温连续搅拌反应2小时;
4)步骤3)的反应液过滤脱水,所得的滤饼真空干燥、粉碎,得到畜禽肠屏障保护剂。
在体重约为20kg的杜长大生长猪日粮中添加0.15%本发明的畜禽肠屏障保护剂,饲喂28天,生长猪平均日增重显著提高,显著降低了结肠内容物大肠杆菌/乳酸杆菌比率,显著提高了结肠上皮细胞跨膜电阻TEER,显著降低了结肠上皮对荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(4kDa-FITC dextran,FD4)的通透性,显著提高结肠粘膜中occludin,claudin-1紧密连接蛋白表达。结果显示,饲粮中添加含0.15%(质量百分数)本发明的畜禽肠屏障保护剂可以提高生长猪的生长性能,抑制有害菌的增殖,提高肠上皮细胞紧密连接蛋白表达和肠上皮屏障功能。
在蛋鸡日粮中添加0.15%本发明的畜禽肠屏障保护剂,有效控制斑点蛋,改善蛋壳光洁度,合格蛋率提高1.7个百分点。肠屏障分析的结果表明,添加0.15%本发明的畜禽肠屏障保护剂可使小肠和盲肠内容物中大肠杆菌和产气荚膜梭菌数减少,使空肠、回肠和盲肠粘膜中occludin,claudin-1紧密连接蛋白表达均显著升高。
实施例3:
1)将蒙脱石,连同相当于蒙脱石重量10%的氯化钠,加水搅拌均匀,制成浓度为15%的悬浮液矿浆,室温钠化12小时,水洗3次,用水重新制成浓度为20%的矿浆;
2)将相当于蒙脱石重量10%的氯化十六烷基吡啶,于搅拌下缓慢加入到步骤1)的矿浆中,室温连续搅拌反应5小时;
3)称取蒙脱石重量5%的百里香酚,称取百里香酚重量1.3倍的75%乙醇,将百里香酚溶解于乙醇中。于搅拌下将上述的百里香酚乙醇溶液缓慢加入步骤2)的矿浆中,室温连续搅拌反应5小时;
4)步骤3)的反应液过滤脱水,所得的滤饼真空干燥、粉碎,得到畜禽肠屏障保护剂。
将21日龄罗斯308肉鸡分为3个组:空白对照组;热应激(HS)组;热应激(HS)添加含0.1%(质量百分数)本发明的畜禽肠屏障保护剂。空白对照组鸡舍温度22℃;其余各组鸡舍温度08:00—18:00为33℃,18:00至次日08:00为22℃。饲养试验期为21d。结果表明:与空白对照组相比,HS组肉鸡平均日增重和平均日采食量显著降低;盲肠内容物大肠杆菌和梭菌数显著上升;盲肠粘膜跨膜电阻值显著下降,荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FD4)通透性显著升高。与HS组相比,HS+本发明的畜禽肠屏障保护剂组平均日增重、平均日采食量和料重比差异不显著,盲肠粘膜FD4通透性显著下降,盲肠内容物大肠杆菌和梭菌数显著下降。结果显示,热应激使肉鸡生长性能下降,肠屏障功能受损,饲喂本发明的畜禽肠屏障保护剂可改善上述变化。
在断奶仔猪日粮中分别添加60mg/kg原粉百里香酚,本发明的畜禽肠屏障保护剂(含60mg/kg百里香酚),饲喂21天。结果发现,与对照组相比,添加60mg/kg原粉百里香酚对仔猪日增重和腹泻率均没有显著影响,对仔猪肠道微生态、肠粘膜炎症因子表达、肠形态、血清抗氧化能力的显著均不显著。与对照组相比,添加本发明的畜禽肠屏障保护剂(含60mg/kg百里香酚),显著降低了仔猪腹泻率,改善了仔猪肠道微生态、肠形态、抗氧化能力,降低了肠粘膜炎症因子表达,而且上述指标和添加60mg/kg原粉百里香酚组相比差异显著。上述结果表明,本发明的畜禽肠屏障保护剂,可有效避免百里香酚在前段消化道的吸收,有利于百里香酚全肠道控制释放,更有效发挥百里香酚的抗菌、抗炎症、抗氧化作用,从而改善仔猪肠屏障。
Claims (10)
1.一种畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,方法的步骤如下:
1)将蒙脱石,连同氯化钠,加水搅拌均匀,制成浓度为10%~20%的悬浮液矿浆,室温钠化后,水洗若干次,用水重新制成浓度为15%~35%的矿浆;
2)将氯化十六烷基吡啶,于搅拌下缓慢加入到步骤1)的矿浆中,室温连续搅拌反应一定时间;
3)取百里香酚以及乙醇,将百里香酚溶解于乙醇中,于搅拌下将上述的百里香酚乙醇溶液缓慢加入步骤2)的矿浆中,室温连续搅拌反应一定时间;
4)步骤3)的反应液脱水,所得的滤饼烘干、粉碎,得到畜禽肠屏障保护剂。
2.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤1)中,所述氯化钠的添加量为蒙脱石重量的7%~15%。
3.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤1)中,室温钠化时间为10~15小时,水洗次数为3~5次。
4.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤2)中,所述氯化十六烷基吡啶的添加量为蒙脱石重量的8%~15%。
5.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤2)中,室温连续搅拌反应时间为2~6小时。
6.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤3)中,所述百里香酚的添加量为蒙脱石重量的3%~8%。
7.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,所述的乙醇采用50%~100%乙醇,乙醇的重量为百里香酚重量的1~1.5倍。
8.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤3)中,室温连续搅拌反应时间为2~5小时。
9.如权利要求1所述的畜禽肠屏障保护剂的制备方法,其特征在于,步骤4)中,所述的脱水采用过滤或离心方式。
10.一种由权利要求1~9任一所述方法制备的畜禽肠屏障保护剂。
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