CN115427807A - 用于诱导针对sars-cov-2的免疫的药剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本组发明涉及生物技术、免疫学和病毒学领域。公开了药剂的用途，所述药剂含有基于人类腺病毒血清型26或人类腺病毒血清型5的表达载体，其中基因组中缺失E1和E3位点，并整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒，或者含有基于人类腺病毒血清型25的表达载体，其中基因组中缺失E1和E3位点，并整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒，或者仅含有组分2，用于提供针对SARS‑CV‑2的延长的疫苗接种后免疫。药剂也可含有上述任何两种组分。本组发明能够允许生产提供针对病毒SARS‑CV‑2的延长的疫苗接种后免疫的安全和有效的药剂，并且旨在针对严重急性呼吸综合征病毒SARS‑CoV‑2的群体再接种。
Description
技术领域
这组发明涉及生物技术、免疫学和病毒学。药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的人群的再接种的用途。
背景技术
冠状病毒(COVID-19)是一个庞大的病毒家族，其在人类和动物中引起多种疾病。
COVID-19的最常见的症状包括发热、干咳、呼吸困难和疲劳。喉咙痛、关节痛、流鼻涕和头痛很少发生。该疾病可能具有轻度或重度病程。高龄和慢性病的存在是危险因素。
在疾病发生后，形成细胞介导和抗体介导的免疫应答。分别在70％和100％的COVID-19恢复期的病人(convalescents)中发现了对SARS-CoV-2特异性的CD8+Т细胞和CD4+Т细胞。SARS-CoV-2的S蛋白是T细胞的主要靶点。此外，发现了对M冠状病毒蛋白和N冠状病毒蛋白特异性的T细胞，以及对SARS-CoV-2的nsp3、nsp4、ORF3a和ORF8特异性的较少数量的T细胞。免疫反应偏向Th1(Grifoni等人.“在患有COVID-19疾病的人类和未暴露的个体中T细胞对SARS-CoV-2冠状病毒的应答的靶点(Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals)”.《细胞(Cell.)》.2020年6月25日；181(7):1489–1501.e15)。
抗体免疫应答由主要靶向冠状病毒表面S蛋白的抗体介导。已经表明，负责与人类细胞上的ACE-2受体结合的S糖蛋白的RBD是病毒中和抗体的主要靶点。针对SARS-CoV-2的抗体介导的免疫应答的动力学通过在症状出现后7天至14天内可持续的血清转化(IgM和IgG)来表征。IgG滴度在前3周期间升高，并且到第8周开始降低(Adams ER,Ainsworth M,Anand R.“COVID-19的抗体测试：来自国家COVID科学顾问小组的报告(Antibody testingfor COVID-19:a report from the National COVID Scientific Advisory Panel)”.medRxiv.2020)。此外，已经证明IgG滴度与疾病的严重程度相关。(Gregory A Poland等人.“SARS-CoV-2免疫：3期疫苗候选物的综述和应用(SARS-CoV-2immunity：review andapplications to phase 3vaccine candidates)”.《柳叶刀(Lancet)》.2020年11月14-20日；396(10262):1595–1606)。
迄今为止积累的科学数据指示在经历该疾病的受试者中形成的对COVID-19的相当短期的天然免疫力(https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/facts.html)。这从观察到的抗体水平降低的趋势和冠状病毒再感染的病例中可以明显看出(Akiko Iwasaki.“再感染对COVID-19意味着什么(What reinfections mean forCOVID-19)”.《柳叶刀传染病(Lancet Infect Dis.)》2021年1月；21(1):3–5)。
接种疫苗是传染病预防的最有效的方法。到目前为止，已经开发了几种COVID-19疫苗，它们基于多种冠状病毒抗原。
1)含有完整病毒作为抗原的疫苗。
已知在中国开发的四种候选灭活疫苗。目前有3种疫苗(科兴公司(Sinovac)与国家传染病防治研究所(National Institute for Prevention And Control ofInfectious Diseases)合作；国药集团(Sinopharm)与中国科学院武汉生物制品研究所和中国科学院武汉病毒研究所(Wuhan Institute of Biological Products and WuhanInstitute of Virology of Chinese Academy of Sciences)合作；国药集团与北京生物制品研究所(Beijing Institute of Biological Products)和病毒性疾病控制与预防研究所(Institute of Control And Prevention of Viral Diseases)合作)在III期临床计划中进行研究，并且一种疫苗(中国医学科学院医学生物学研究所(Institute of medicalbiology,Chinese Academy of Medical sciences)在I期/II期临床计划中进行研究。
(Zhang Y等人.“灭活的SARS-CoV-2疫苗在18-59岁健康成人中的安全性、耐受性和免疫原性：一项随机化的、双盲的、安慰剂对照的、1/2期临床试验(Safety,tolerability,and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine inhealthy adults aged 18-59years：a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 1/2 clinical trial)”.《柳叶刀传染病》.2021年2月；21(2):181-192；Xia S等人.“针对SARS-CoV-2的灭活疫苗对安全性和免疫原性结果的影响：2项随机化的临床试验的中期分析(Effect of an Inactivated Vaccine Against SARS-CoV-2 on Safety andImmunogenicity Outcomes:Interim Analysis of 2 Randomized Clinical Trials)”.《美国医学会杂志(JAMA)》.2020年9月8日；324(10):951-960.Xia S等人，“灭活的SARS-CoV-2疫苗BBIBP-CorV的安全性和免疫原性：一项随机化的、双盲、安慰剂对照的1/2期试验(Safety and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine,BBIBP-CorV：arandomised,double-blind,placebo-controlled,phase 1/2 trial)”.《柳叶刀传染病》.2021年1月；21(1):39-51.doi:10.1016/S1473-3099(20)30831-8。Epub 2020年10月15日.PMID:33069281；PMCID:PMC7561304.Che Y等人.“在健康成人中进行的灭活的SARS-CoV-2疫苗的随机化的、双盲的和安慰剂对照的II期试验(Randomized,double-blinded andplacebo-controlled phase II trial of an inactivated SARS-CoV-2vaccine inhealthy adults)”.《临床传染病(Clin Infect Dis.)》2020年11月9日)。
2)含有全长S蛋白作为抗原的疫苗。
已知三种基于多种血清型的腺病毒的疫苗，它们表达SARS-CoV-2的全长S蛋白的基因。康希诺生物股份有限公司(CanSino Biological Inc.)和北京生物技术研究所(Beijing Institute of Biotechnology)已经开发了基于人类腺病毒血清型5的疫苗；牛津大学，阿斯利康(Oxford University,AstraZeneca)——基于黑猩猩腺病毒的疫苗；俄罗斯卫生部FGBU N.F.Gamaleya国家流行病学和微生物学研究中心(FGBU N.F.GamaleyaNational Research Center For Epidemiology And Microbiology,Ministry of Healthof Russia)——基于人类腺病毒血清型26和血清型5的疫苗。此外，已知DNA疫苗，其含有SARS-CoV-2的全长S蛋白的基因，并且是由伊诺维奥制药公司(Inovio Pharmaceuticals)与国际疫苗研究所合作开发的。
(Zhu F等人.“重组腺病毒5型载体化的COVID-19疫苗的安全性、耐受性和免疫原性：一项剂量递增、开放标签、非随机化的、人类首次试验(Safety,tolerability,andimmunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine：adose-escalation,open-label,non-randomised,first-in-human trial)”.《柳叶刀》.2020年6月13日；395(10240):1845-1854.van Doremalen N等人.“ChAdOx1 nCoV-19疫苗预防恒河猴的SARS-CoV-2肺炎(ChAdOx1 nCoV-19vaccine prevents SARS-CoV-2pneumonia in rhesus macaques)”.《自然(Nature)》.2020年10月；586(7830):578-582.Logunov DY等人.“两种制剂中基于rAd26和rAd5载体的异源初始增强COVID-19疫苗的安全性和免疫原性：来自俄罗斯的两项开放、非随机化的1/2期研究(Safety andimmunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boostCOVID-19vaccine in two formulations：two open,non-randomised phase 1/2studiesfrom Russia)”.《柳叶刀》.2020年9月26日；396(10255):887-897)。
3)疫苗，其中具有两个脯氨酸取代的全长S蛋白(K986P和V987P)用作抗原。
已知两种疫苗，其基于含有编码具有脯氨酸取代的SARS-CoV-2的S蛋白的mRNA的脂质纳米颗粒(莫德纳公司(Moderna)与国家过敏和传染病研究所(National Instituteof Allergy And Infectious Diseases)合作；德国生物新技术公司(BioNTech)与复星制药(Fosun Pharma)和辉瑞(Pfizer)合作)。此外，已知由诺华公司(Novavax)开发的蛋白质亚单位疫苗是；在该疫苗中，SARS-CoV-2的全长S蛋白具有两个脯氨酸取代(K986P和V987P)并且在弗林蛋白酶切割位点中具有三个突变(R682Q、R683Q和R685Q)。已经由杨森制药公司(Janssen Pharmaceutical Companies)开发了另一种基于人类腺病毒血清型26的疫苗，该疫苗表达SARS-CoV-2的全长S蛋白，其具有两个脯氨酸取代(K986P和V987P)和在弗林蛋白酶切割位点中的两个突变(R682S和R685G)。
(L.Baden等人.“mRNA-1273 SARS-CoV-2疫苗的功效和安全性(Efficacy andSafety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine)”.《新英格兰医学杂志(N Engl JMed.)》,2020年12月30日；L.Jackson“一种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗——初步报告(AnmRNA Vaccine against SARS-CoV-2-Preliminary Report)”.《新英格兰医学杂志》,2020年11月12日；383(20):1920-1931.Keech C等人.“SARS-CoV-2重组刺突蛋白纳米颗粒疫苗的1-2期试验(Phase 1-2 Trial of a SARS-CoV-2Recombinant Spike ProteinNanoparticle Vaccine)”.《新英格兰医学杂志》,2020年12月10日；Tostanoski L等人.“Ad26疫苗预防仓鼠的SARS-CoV-2严重临床疾病(Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters)”.《自然医学(Nat Med.)》2020 Nov；26(11):1694-1700.doi:10.1038/s41591-020-1070-6.Epub 2020年9月3日)。
4)含有S蛋白的RBD作为抗原的疫苗
含有RBD二聚体(残基319-537为串联重复序列)的蛋白亚单位疫苗已经由安徽智飞龙科马生物制药有限公司(Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical)与中国科学院微生物研究所合作开发。此外，已知基于脂质纳米颗粒的疫苗，该脂质纳米颗粒含有编码RBD-三聚体(通过添加来自T4纤维蛋白原(fibritin)的foldon结构域而三聚体化)的mRNA(德国生物新技术公司与复星制药和辉瑞合作)(Mulligan M等人，“COVID-19 RNA疫苗BNT162b1在成人中的I/II期研究(Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccineBNT162b1 in adults)”.《自然》.2020年10月；586(7830):589-593.Dai L.“针对COVID-19、MERS和SARS的β冠状病毒疫苗的通用设计(A Universal Design of BetacoronavirusVaccines against COVID-19,MERS,and SARS)”.《细胞(Cell)》.2020年8月6日；182(3):722-733.e11.Dai L等人.“针对COVID-19的疫苗的病毒靶标(Viral targets forvaccines against COVID-19)”.《自然评论免疫学(Nat Rev Immunol.)》2021年2月；21(2):73-82)。
目前世界上已授权生产8种预防COVID-19的疫苗。临床研究结果显示，使用这些疫苗的免疫导致产生针对SARS-CoV-2的抗体介导的和细胞介导的免疫应答。然而，每种类型的疫苗如何提供持久的接种后保护性免疫尚未确定。专家认为，它可能显示出个体间的可变性，并且根据多种估计，持续1至2年。此类持续时间决定了需要开发待用于人类的再接种的COVID预防的特异性药剂。
然而，选择再接种药剂是一项具有挑战性的任务。
在开发用于再接种的特定预防的药剂的过程中，人们应该牢记由加强的免疫在人体中产生的效应，这些效应对于抗感染免疫的整体结构(包括其保护特性)具有相当大的影响。
已知使用包含多种抗原的疫苗(例如灭活的疫苗)导致形成针对每种抗原的免疫应答。然而，在这种情况下，与仅包含这一种抗原的疫苗相比，对于给定抗原的免疫水平较低(免疫应答稀释的效应)。此外，病原体结构中的一些抗原可能是非保护性的，并且针对此类抗原的T细胞克隆和B细胞克隆的形成不会有助于免疫的整体保护性，从而干扰对保护很重要的细胞克隆的形成。
基于上述，可以得出结论，包含一种或多种具有显著保护特性的蛋白质的疫苗对于再接种更有前景。在这种情况下，再接种将与额外的刺激(加强)和同等重要的将免疫应答集中于病原体的抗原决定簇有关，无论初始免疫如何，这对于人类保护来说都是最重要的。
从现有技术水平上来说，用于针对冠状病毒感染的再接种的药剂还未知。
RF专利第2731342号(2020年9月1日公布)中公开的技术方案被要求保护的发明的作者选择作为原型。从这一专利中已知用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂的变体。
-含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
-含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；并且还包含组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
-含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
此外，在这一专利中，公开了药剂的指定变体用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的用途，包括以至少一周的时间间隔依次施用有效量的组分1和组分2。
这一药剂的缺点是未描述其用于延长疫苗接种后免疫的用途。
因此，本发明的背景表明需要开发一种药剂，其可以用于针对由SARS-CoV-2病毒引起的疾病的再接种。
发明内容
要求保护的这组发明的技术问题是开发提供针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种后免疫延长的药剂。
技术结果是产生了提供针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种后免疫延长的安全且有效的药剂。
所述技术结果是通过使用一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起的疾病的再接种来实现的，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；和/或含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3的表达盒。
此外，公开了所述药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒，或仅含有组分2。
此外，公开了另一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
所述药剂以液体形式或冻干形式使用。
更重要的是，用于液体形式的缓冲液以重量％计含有：
此外，重构的冻干剂含有缓冲液，所述缓冲液以重量％计由以下构成：
此外，在使用期间，组分1和组分2处于分开的容器中。
附图说明
图1
说明了通过评估由SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD8+淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的液体形式的所开发的药剂在志愿者中评估免疫效力的结果。
Y轴–增殖细胞的量，％。
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图2
说明了通过评估由SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD4+淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的液体形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
Y轴–增殖细胞的量，％。
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图3
说明了通过评估由SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD8+淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
Y轴–增殖细胞的量，％。
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图4
说明了通过评估由SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD4+淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
Y轴–增殖细胞的量，％。
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图5
说明了在免疫前(第0天)和在研究的第14和28天用SARS-CoV-2的S抗原再刺激后，在用根据变体1的液体形式的所开发的药剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中IFNγ浓度的倍数增加。
Y轴–干扰素γ浓度的倍数增加
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图6
说明了在免疫前(第0天)和在研究的第14和28天用SARS-CoV-2的S抗原再刺激后，在用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中IFNγ浓度的倍数增加。
Y轴–干扰素γ浓度的倍数增加
X轴–天数。
●-表示在第0天每个志愿者的个体值。
■-表示在第14天每个志愿者的个体值。
▲-表示在第28天每个志愿者的个体值。
圆点显示了参与研究的每个志愿者的个体值。对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001示出。
图7
说明了在志愿者中针对SARS-CoV2的抗原的抗体介导的免疫应答的评估结果，所述志愿者用根据变体1的液体形式的所开发的药剂进行免疫。
Y轴–针对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG滴度。
X轴–天数。
图8
说明了在志愿者中针对SARS-CoV2的抗原的抗体介导的免疫应答的评估结果，所述志愿者用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂进行免疫。
Y轴–针对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG滴度。
X轴–天数。
开发用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂的第一阶段是选择疫苗抗原。作为这项工作的一部分，进行了文献检索，结果表明冠状病毒S蛋白是最有希望用于产生候选疫苗的抗原。这种I型跨膜糖蛋白负责病毒颗粒的结合、融合和进入细胞。如所示出的，它诱导中和抗体的产生(Liang M等人，“SARS患者衍生的针对S和M蛋白的人重组抗体有效地中和SARS冠状病毒的传染性(SARS patients-derived humanrecombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity)”.《生物医学和环境科学(Biomed Environ Sci.)》2005年12月；18(6):363-74)。
作者开发了表达盒的各种变体，以实现针对SARS-CoV-2的S蛋白的免疫应答的最有效诱导。
具体实施方式
表达盒SEQ ID NO:1包含CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。CMV启动子是早期巨细胞病毒基因的启动子，其在多种细胞类型中提供组成型表达。然而，由CMV启动子控制的靶基因的表达的强度根据细胞类型变化。此外，已经示出，由于抑制了与DNA甲基化相关的基因表达，受CMV启动子控制的转基因表达的水平随着细胞培养时间的延长而降低[Wang W.,Jia YL.,Li YC.,Jing CQ.,Guo X.,Shang XF.,Zhao CP.,Wang TY.《不同启动子、启动子突变和增强子对CHO细胞中重组蛋白表达的影响(Impact ofdifferent promoters,promoter mutation,and an enhancer on recombinant proteinexpression in CHO cells)》//科学报告-2017.－第8卷.－第10416页]。
表达盒SEQ ID NO:2包含CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。CAG启动子是一种合成启动子，其打开CMV启动子的早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子(鸡β-肌动蛋白和兔β-珠蛋白)。实验表明，与CMV启动子相比，CAG启动子的转录活性更高。[Yang C.Q.,Li X.Y.,Li Q.,Fu S.L.,Li H.,Guo Z.K.,Lin J.T.,ZhaoS.T.“通过使用体内电穿孔来评价三种不同启动子驱动鸡胚发育过程中的基因表达(Evaluation of three different promoters driving gene expression indeveloping chicken embryo by using in vivo electroporation)”.《遗传学和分子研究(Genet.Mol.Res.)》-2014.－第13卷.－第1270-1277页]。
表达盒SEQ ID NO:3包含EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。EF1启动子是人真核翻译延伸因子1α(EF-1α)的启动子。该启动子在广泛的细胞类型中具有组成型活性[PMID:28557288。EF-1α启动子在转染的CHO-K1细胞中维持来自附加型载体的高水平转基因表达(The EF-1αpromoter maintains high-level transgeneexpression episomal vectors in transfected CHO-K1 cells)]。EF-1α基因编码延伸因子1α，其是真核细胞中最常见的蛋白之一并且几乎在哺乳动物的所有细胞类型中均有表达。这种EF-1α通常在其中病毒启动子不能表达受控基因的细胞中和在其中病毒启动子逐渐消失的细胞中具有活性。
表达盒SEQ ID NO:4包含CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
选择基于腺病毒的载体系统来有效地将编码SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白的基因递送到人体中。腺病毒载体提供许多优点：它们不能在人细胞中繁殖，进入分裂和非分裂细胞，能够诱导细胞介导和抗体介导的免疫应答，并提供高水平的靶抗原表达。
作者开发了含有两种组分的药剂的变体，它们基于不同的腺病毒血清型。在这种情况下，针对腺病毒的载体部分的免疫应答(其可以在施用所述药剂的第一组分后产生)在将来不被增强并且不影响针对疫苗抗原的抗原特异性免疫应答的产生。
此外，所开发的药剂扩展了用于诱导针对SARS-CoV-2冠状病毒的免疫应答的药剂的医疗设备(armamentarium)，并且这将克服针对一些腺病毒血清型的预先存在的免疫应答在群体的某些部分中存在而产生的困难。
因此，这些努力导致了以下药剂变体的开发。
1.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；和/或含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
2.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒；或者仅含有组分2。
3.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
实例1
含有人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体的获得。
在第1阶段，作者开发了质粒构建体pAd26-Ends的设计，其携带与人类腺病毒血清型26的基因组同源的两个位点(两个同源臂)和氨苄青霉素抗性基因。一个同源臂是人类腺病毒血清型26的起点(从左侧反向末端重复序列到E1位点)和包括pIX蛋白的病毒基因组序列。第二个同源臂含有从Е4位点的ORF3到基因组的末端的核苷酸序列。pAd26-Ends构建体由ZAO“Eurogene”(莫斯科)合成。
将分离自病毒粒子的人类腺病毒血清型26的DNA与pAd26-Ends构建体混合。pAd26-Ends与病毒DNA之间的同源重组产生质粒pAd26-dlE1，其携带缺失E1位点的人类腺病毒血清型26的基因组。
然后在获得的质粒pAd26-dlE1中，使用常规的克隆方法将含有开放阅读框6(ORF6-Ad26)的序列用来自人类腺病毒血清型5的类似序列替换，以使人类腺病毒血清型26能够在细胞培养物HEK293中有效复制。这产生了质粒pAd26-dlE1-ORF6-Ad5。
然后使用常规的基因工程改造方法使构建的质粒pAd26-dlE1-ORF6-Ad5中缺失腺病毒基因组的E3位点(pIII基因与U-外显子之间约3321b.p.)，以增加载体包装能力。这导致基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的重组载体pAd26-only-null含有人类腺病毒血清型5的开放阅读框ORF6且缺失基因组的E1和E3位点。SEQ ID NO:5用作人类腺病毒血清型26的母体序列。
此外，作者开发了表达盒的几种设计：
-表达盒SEQ ID NO:1包含CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2包含CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3包含EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
在质粒构建体pAd26-Ends的基础上，使用基因工程改造方法获得了构建体pArms-26-CMV-S-CoV2、pArms-26-CAG-S-CoV2、pArms-26-EF1-S-CoV2，它们分别含有表达盒SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，并且还带有人类腺病毒血清型26的基因组的同源性臂。接着，在同源臂之间的独特水解位点处将构建体pArms-26-CMV-S-CoV2、pArms-26-CAG-S-CoV2、pArms-26-EF1-S-CoV2线性化；将每种质粒与重组载体pAd26-only-null进行混合。同源重组产生质粒pAd26-only-CMV-S-CoV2、pAd26-only-CAG-S-CoV2、pAd26-only-EF1-S-CoV2，其携带含有人类腺病毒血清型5的开放阅读框ORF6的人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组，且缺失基因组的E1和E3位点，表达盒分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3。
在第4阶段，用特异性限制性核酸内切酶对质粒pAd26-only-CMV-S-CoV2、pAd26-only-CAG-S-CoV2、pAd26-only-EF1-S-CoV2进行水解以除去载体部分。获得的DNA产物用于转染细胞培养物НЕК293。
因此，获得了表达载体，其含有人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
实例2
基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组获得表达载体形式的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例1中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中或在用于冻干形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒。
因此，获得了以下基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代：
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:1(Ad26-CMV-S-CoV2)。
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:1(Ad26-CMV-S-CoV2)。
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:2(Ad26-CAG-S-CoV2)。
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:2(Ad26-CAG-S-CoV2)。
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:3(Ad26-EF1-S-CoV2)。
6.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQID NO:3(Ad26-EF1-S-CoV2)。
每种提供的免疫生物制剂均是所开发的药剂的变体1和变体2中的组分1。
实例3
包含猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体的获得。
在第1阶段，开发了质粒构建体pSim25-Ends的设计，其携带与猿猴腺病毒血清型25的基因组同源的两个位点(两个同源臂)。一个同源臂是猿猴腺病毒血清型25的起点(从左侧反向末端重复序列到E1位点)和从E1位点的末端到pIVa2蛋白的序列。第二个同源臂含有腺病毒基因组的末端核苷酸序列，包括右侧反向末端重复序列。pSim25-Ends构建体由ZAO“Eurogene”(莫斯科)合成。
将从病毒粒子中分离的猿猴腺病毒血清型25的DNA与pSim25-Ends混合。pSim25-Ends与病毒DNA之间的同源重组产生质粒pSim25-dlE1，其携带缺失E1位点的猿腺病毒血清型25的基因组。
然后，使用常规的基因工程改造方法使构建的质粒pSim25-dlE1中缺失腺病毒基因组的E3位点(从基因12.5K开始到基因14.7K的3921b.p.)，以增加载体的包装能力。这导致质粒构建体pSim25-null编码猿腺病毒血清型25的全长基因组，其中缺失基因组的E1和E3位点。SEQ ID NO:6用作猿猴腺病毒血清型25的母体序列。
此外，作者开发了表达盒的几种设计：
-表达盒SEQ ID NO:4包含CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2包含CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3包含EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
在质粒构建体pSim25-Ends的基础上，使用基因工程改造方法获得了构建体pArms-Sim25-CMV-S-CoV2、pArms-Sim25-CAG-S-CoV2、pArms-Sim25-EF1-S-CoV2，它们分别含有表达盒SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，并且还带有猿猴腺病毒血清型25的基因组的同源性臂。接着，在同源臂之间的独特水解位点处将构建体pArms-Sim25-CMV-S-CoV2、pArms-Sim25-CAG-S-CoV2、pArms-Sim25-EF1-S-CoV2线性化；将每种质粒与重组载体pSim25-null进行混合。同源重组产生重组质粒载体pSim25-CMV-S-CoV2、pSim25-CAG-S-CoV2、pSim25-EF1-S-CoV2，其分别含有缺失E1和E3位点的猿腺病毒血清型25的全长基因组和表达盒SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在第3阶段，用特异性限制性核酸内切酶对质粒pSim25-CMV-S-CoV2、pSim25-CAG-S-CoV2、pSim25-EF1-S-CoV2进行水解以除去载体部分。获得的DNA产物用于转染细胞培养物НЕК293。所得的材料用于制备量的重组腺病毒的积累。
这项工作导致获得了人类腺病毒血清型25，其含有编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因：simAd25-CMV-S-CoV2(含有表达盒SEQ ID NO:4)、simAd25-CAG-S-CoV2(含有表达盒SEQID NO:2)、simAd25-EF1-S-CoV2(含有表达盒SEQ ID NO:3)。
因此，获得了表达载体，其含有猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且其中整合了选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
实例4
基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的获得，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例3中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒，并且在用于冻干形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒。
因此，获得了以下基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点：
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:1(simAd25-CMV-S-CoV2)。
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:1(simAd25-CMV-S-CoV2)。
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:2(simAd25-CAG-S-CoV2)。
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:2(simAd25-CAG-S-CoV2)。
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:3(simAd25-EF1-S-CoV2)。
6.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:3(simAd25-EF1-S-CoV2)。
每种提供的免疫生物制剂都是所开发的药剂的变体1中的组分2和变体3中的组分1。
实例5
含有人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体的获得。
在第1阶段，开发了质粒构建体pAd5-Ends的设计，其携带与人类腺病毒血清型5的基因组同源的两个位点(两个同源臂)。一个同源臂是人类腺病毒血清型5的起点(从左侧反向末端重复序列到E1位点)和包括病毒基因组的pIX蛋白的序列。第二个同源臂含有位于E4位点的ORF3之后直至基因组的末端的核苷酸序列。pAd5-Ends构建体由ZAO“Eurogene”(莫斯科)合成。
将从病毒粒子中分离的人类腺病毒血清型5的DNA与pAd5-Ends构建体混合。pAd5-Ends与病毒DNA之间的同源重组产生质粒pAd5-dlE1，其携带缺失E1位点的人类腺病毒血清型5的基因组。
使用常规的基因工程改造方法使构建的质粒pAd5-dlE1中缺失腺病毒基因组的E3位点(从基因12.5K的末端到U外显子序列的起始的约2685b.p.)，以增加载体的包装能力。这导致基于人类腺病毒血清型5的基因组的重组质粒载体pAd5-too-null，其中基因组中缺失E1和Е3。SEQ ID NO:7用作人类腺病毒血清型5的母体序列。
此外，作者开发了表达盒的几种设计：
-表达盒SEQ ID NO:1包含CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2包含CAG启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3包含EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
然后，在质粒构建体pAd5-Ends的基础上，使用基因工程改造方法获得了构建体pArms-Ad5-CMV-S-CoV2、pArms-Ad5-CAG-S-CoV2、pArms-Ad5-EF1-S-CoV2，它们分别含有表达盒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，并且还带有人类腺病毒血清型5的基因组的同源性臂。
接着，在同源臂之间的独特水解位点处将构建体pArms-Ad5-CMV-S-CoV2、pArms-Ad5-CAG-S-CoV2、pArms-Ad5-EF1-S-CoV2线性化，将每种质粒与重组载体pAd5-too-null进行混合。同源重组产生质粒pAd5-too-CMV-S-CoV2、pAd5-too-GAC-S-CoV2、pAd5-too-EF1-S-CoV2，其分别携带基因组中缺失Е1和Е3位点的人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组和表达盒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在第4阶段，用特异性限制性核酸内切酶对质粒pAd5-too-CMV-S-CoV2、pAd5-too-GAC-S-CoV2、pAd5-too-EF1-S-CoV2进行水解以除去载体部分。获得的DNA产物用于转染细胞培养物НЕК293。所得的材料用于制备量的重组腺病毒的积累。
这项工作导致获得了人类腺病毒血清型5，其含有编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因：Ad5-CMV-S-CoV2(含有表达盒SEQ ID NO:1)、Ad5-CAG-S-CoV2(含有表达盒SEQ ID NO:2)、Ad5-EF1-S-CoV2(含有表达盒SEQ ID NO:3)。
因此，获得了表达载体，其含有人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的表达盒。
实例6
基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的获得，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3的表达盒。
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例5中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中或在用于冻干形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒。
因此，获得了以下基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点：
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:1(Ad5-CMV-S-CoV2)。
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:1(Ad5-CMV-S-CoV2)。
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:2(Ad5-CAG-S-CoV2)。
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:2(Ad5-CAG-S-CoV2)。
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:3(Ad5-EF1-S-CoV2)。
6.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，具有含有EF1启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒SEQ ID NO:3(Ad5-EF1-S-CoV2)。
每种提供的免疫生物制剂均是所开发的药剂的变体1和变体2中的组分1。
每种提供的免疫生物制剂均是所开发的药剂的变体1和变体3中的组分2。
实例7
缓冲溶液的制备
根据要求保护的本发明的开发的药剂包含置于分开的小瓶中的两种组分。每种组分在缓冲溶液中包含基于具有表达盒的重组腺病毒的免疫生物制剂。
本发明的作者精心设计了缓冲溶液的组成以确保重组腺病毒颗粒的稳定性。所述溶液包括：
1.维持溶液的pH所需的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。
2.添加以达到适当的离子强度和渗透压(osmolarity)的氯化钠。
3.用作冷冻保护剂的蔗糖。
4.需要作为二价阳离子的来源的氯化镁六水合物。
5.用作自由基氧化的抑制剂的EDTA。
6.用作表面活性剂的来源的聚山梨醇酯-80。
7.用作自由基氧化的抑制剂的乙醇95％。
8.用作溶剂的水……
本发明的作者开发了用于液体形式的药剂和用于冻干形式的药剂的缓冲溶液的两种变体。
获得了实验组的几个变体，用于确定用于液体形式的药剂的缓冲溶液的组成中的化合物的浓度(表1)。将药剂的组分之一添加到每一种所制备的缓冲溶液中：
1.基于重组人类腺病毒血清型26的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
2.基于重组人类腺病毒血清型5的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
因此，测试了药剂组合物中的每种腺病毒血清型的稳定性。制备的药物产品在-18℃和-70℃的温度下储存3个月，然后解冻，并评估重组腺病毒滴度的变化。
表1—用于液体形式的药剂的实验缓冲溶液的组成
表1
实验的结果表明，在-18℃和-70℃的温度下，在用于液体形式的药剂的缓冲液中储存3个月后，重组腺病毒的滴度没有变化。
因此，所开发的用于液体形式的药剂的缓冲溶液提供了所开发的药剂的所有组分在以下活性成分的范围(重量％)内的稳定性：
Tris：0.1831重量％至0.3432重量％；
氯化钠：0.3313重量％至0.6212重量％；
蔗糖：3,7821重量％至7,0915重量％；
氯化镁六水合物：0.0154重量％至0.0289重量％；
EDTA：0.0029重量％至0.0054重量％；
聚山梨醇酯-80：0.0378重量％至0.0709重量％；
乙醇95％：0.0004重量％至0.0007重量％；
溶剂：余量。
获得了实验组的几个变体，用于确定用于冻干形式的药剂的缓冲溶液的组成中的化合物的浓度(表2)。将药剂的组分之一添加到每一种所制备的缓冲溶液中：
1.基于重组人类腺病毒血清型26的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
2.基于重组人类腺病毒血清型5的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的免疫生物制剂，具有含有CMV启动子、编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*1011个病毒颗粒。
因此，测试了药剂组合物中的每种腺病毒血清型的稳定性。制备的药物产品在+2℃和+8℃的温度下储存3个月，然后解冻，并评估重组腺病毒滴度的变化。
表2-实验缓冲溶液的组成
表2.
实验的结果表明，在+2℃和+8℃的温度下，在用于冻干形式的药剂的缓冲液中储存3个月后，重组腺病毒的滴度没有变化。
因此，所开发的用于冻干形式的药剂的缓冲溶液提供了所开发的药剂的所有组分在以下活性成分的范围(重量％)内的稳定性：
Tris：0.0180重量％至0.0338重量％；
氯化钠：0.1044重量％至0.1957重量％；
蔗糖：5,4688重量％至10.2539重量％；
氯化镁六水合物：0.0015重量％至0.0028重量％；
EDTA：0.0003重量％至0.0005重量％；
聚山梨醇酯-80：0.0037重量％至0.0070重量％；
溶剂：余量。
实例8
通过评估在接种后不同时间间隔志愿者的血液中针对SARS-CoV-2病毒的抗原的细胞介导的免疫应答，研究所开发的药剂的免疫原性。
所开发的药剂变体1的临床研究包括对细胞介导的免疫强度的研究。
对参与研究的40名志愿者用以下免疫接种:
1)液体形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：Ad26-CMV-S-CoV2，组分2：Ad5-CMV-S-CoV2)，剂量1х1011个病毒颗粒(20名志愿者)。
2)冻干形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：Ad26-CMV-S-CoV2，组分2：Ad5-CMV-S-CoV2)，剂量1х1011个病毒颗粒(20名志愿者)。
第0天(在药剂施用前)、第14天和第28天，从志愿者中采集血液样品，并以ficcol密度梯度离心，以便分离单核细胞。将分离的细胞用CFSE荧光染料(Invivogen，США)染色并加入到板孔中。然后在体外通过向培养基中加入冠状病毒S蛋白(直至最终蛋白浓度为1μg/mL)对淋巴细胞进行再刺激。没有添加抗原的完整细胞被用作阴性对照。加入抗原后72小时，测量增殖细胞的百分比，并且收集培养基用于测量干扰素γ水平。
使用针对T细胞标记物分子CD3、CD4、CD8(抗CD3 Pe-Cy7(BD生物科学(BDBiosciences)，克隆SK7)、抗CD4 APC(BD生物科学，克隆SK3)、抗CD8 PerCP-Cy5.5(BD生物科学，克隆SK1))的抗体对细胞进行染色，以评估增殖细胞的百分比。使用流式细胞荧光计BD FACS AriaIII(BD生物科学，美国)来鉴定细胞混合物中增殖的(携带少量CFSE染料)CD4+和CD8+ T细胞。从用冠状病毒抗原S再刺激的细胞的分析获得的结果中减去从完整细胞的分析获得的结果，以便测定每个样品中增殖细胞的所得的百分比。最终结果在图1、2(用于液体形式的疫苗)和图3、4(用于冻干形式的疫苗)中示出。
按照制造商的说明，使用干扰素γEIA-BEST药剂盒(VECTOR BEST，俄罗斯)在用冠状病毒S蛋白再刺激后72小时内测量人血单核细胞的培养基中干扰素γ(IFNγ))的浓度。结果在图5(用于液体形式的疫苗)和图6(用于冻干形式的疫苗)中示出。
研究结果显示，通过使用两种形式的药剂变体1对志愿者进行连续免疫诱导的细胞介导的免疫强度随着免疫后经过的时间而增加，如通过增殖的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的中位百分比所证明。在两组中，在免疫后第28天观察到增殖的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的最大值。在第0天与第28天之间观察到增殖的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的百分比的最大统计显著差异(p<0.001)。
从图5、6所示的结果可以得出结论，基于IFNγ浓度的中位增量，通过用两种形式的药剂变体1对志愿者进行连续免疫引起的细胞介导的免疫强度的增长在免疫后的天数越多越明显。免疫前水平(第0天)和接种后第14天之间的IFNγ浓度增量的统计学显著差异为p<0.001。在免疫后第28天观察到IFNγ浓度的最大增量。在研究的第0天与第28天之间观察到IFNγ浓度增量的最大统计学显著差异(p<0.001)。
因此，基于上述数据，可以得出结论，用所开发的药剂进行免疫诱导抗感染免疫的强抗原特异性细胞介导的组分，这得到了在免疫之前和之后测量的参数的高统计学意义的支持。
实例9
通过评估接种后不同时间间隔志愿者的血液中针对SARS-CoV-2抗原的抗体的滴度，研究所开发的药剂的免疫原性。
对参与研究的40名志愿者用以下免疫接种:
1)液体形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：Ad26-CMV-S-CoV2，组分2：Ad5-CMV-S-CoV2)，剂量1х1011个病毒颗粒(20名志愿者)。
2)冻干形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：Ad26-CMV-S-CoV2，组分2：Ad5-CMV-S-CoV2)，剂量1х1011个病毒颗粒(20名志愿者)。
在第14天、第21天和第28天，收集血液样品，然后进行血清分离。
按照制造商的说明，使用药剂盒SARS-CoV-2-RBD-EIA-Gamaleya测量针对SARS-CoV-2S蛋白的RBD的抗体的滴度。
在图7中示出了在施用液体形式的药剂后，在志愿者的血清中针对SARS-CoV-2抗原的抗体滴度的测定结果。
在图8中示出了在施用冻干形式的药剂后，在志愿者的血清中针对SARS-CoV-2抗原的抗体滴度的测定结果。
如从呈现的数据中显而易见的，使用液体形式和冻干形式的所开发的药剂对志愿者进行免疫能够产生强的(在统计学上，与在未免疫的动物的对照组中获得的值显著不同)抗体介导的免疫，其特征在于针对SARS-CoV-2的S蛋白的抗体水平增加。观察到免疫后抗体介导的免疫应答的强度随着时间的增加而增加。
实例10
所开发的药剂用于在使用模型亚单位疫苗免疫后延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
本研究的目的是评估所开发的药剂在用模型亚单位疫苗免疫的动物的再接种中的潜在用途。
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠Balb/c。在第1阶段，用含有SARS-CoV-2的S蛋白(10μg/小鼠)的模型疫苗在含氢氧化铝的磷酸盐缓冲液(100μg/小鼠)中对动物进行免疫。以21天的给药间隔施用两次剂量的疫苗。在第180天，用所开发的药剂的多种变体对动物进行再免疫。在双组分药剂的情况下：第一组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
1)模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
2)模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2/Ad5-CAG-S-CoV2
3)模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2/Ad5-EF1-S-CoV2
4)模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
5)模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2/simAd25-CAG-S-CoV2
6)模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2/simAd25-EF1-S-CoV2
7)模型疫苗/simAd25-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
8)模型疫苗/simAd25-CAG-S-CoV2/Ad5-CAG-S-CoV2
9)模型疫苗/simAd25-EF1-S-CoV2/Ad5-EF1-S-CoV2
10)模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2
11)模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2
12)模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2
13)模型疫苗/Ad5-CMV-S-CoV2
14)模型疫苗/Ad5-CAG-S-CoV2
15)模型疫苗/Ad5-EF1-S-CoV2
16)模型疫苗/simAd25-CMV-S-CoV2
17)模型疫苗/simAd25-CAG-S-CoV2
18)模型疫苗/simAd25-EF1-S-CoV2
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(EIA)来确定抗SARS-CoV-2抗体的滴度:
1)将抗原在+4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μL/孔的量加入到每个孔中。将板在+37℃的摇床上孵育1小时。
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
4)将50μL的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
5)然后将板在+37℃下孵育1小时。
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠IgG抗体。
8)然后将板在+37℃下孵育1小时。
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
10)然后加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(OD)。
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表3中示出。
表3–鼠血清中抗S蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
表3
所呈现的数据证明了在使用模型灭活疫苗免疫后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
实例11
所开发的药剂用于在使用模型灭活疫苗免疫后延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
本研究的目的是评估所开发的药剂在用模型灭活疫苗免疫的动物的再接种中的潜在用途。
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠Balb/c。在第1阶段，用含有福尔马林灭活的SARS-CoV-2病毒的模型疫苗免疫动物。以21天的给药间隔施用两次剂量的疫苗。在第180天，用所开发的药剂的多种变体对动物进行再免疫。在双组分药剂的情况下：第一组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
1.模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
2.模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2/Ad5-CAG-S-CoV2
3.模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2/Ad5-EF1-S-CoV2
4.模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
5.模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2/simAd25-CAG-S-CoV2
6.模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2/simAd25-EF1-S-CoV2
7.模型疫苗/simAd25-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
8.模型疫苗/simAd25-CAG-S-CoV2/Ad5-CAG-S-CoV2
9.模型疫苗/simAd25-EF1-S-CoV2/Ad5-EF1-S-CoV2
10.模型疫苗/Ad26-CMV-S-CoV2
11.模型疫苗/Ad26-CAG-S-CoV2
12.模型疫苗/Ad26-EF1-S-CoV2
13.模型疫苗/Ad5-CMV-S-CoV2
14.模型疫苗/Ad5-CAG-S-CoV2
15.模型疫苗/Ad5-EF1-S-CoV2
16.模型疫苗/simAd25-CMV-S-CoV2
17.模型疫苗/simAd25-CAG-S-CoV2
18.模型疫苗/simAd25-EF1-S-CoV2
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(EIA)来确定抗SARS-CoV-2抗体的滴度:
1)将抗原在+4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μL/孔的量加入到每个孔中。将板在+37℃的摇床上孵育1小时。
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
4)将50μL的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
5)然后将板在+37℃下孵育1小时。
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠IgG抗体。
8)然后将板在+37℃下孵育1小时。
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
10)然后加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(OD)。
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表4中示出。
表4–鼠血清中抗S蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
表4
所呈现的数据证明了在使用模型灭活疫苗免疫后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
实例12
所开发的药剂用于在使用所开发的药剂的多种变体免疫后延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
本研究的目的是评估所开发的药剂在用所开发的药剂的多种变体免疫的动物的再接种中的潜在用途。
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠Balb/c。在第1阶段，用所开发的药剂的多种单组分变体(1010个病毒颗粒/小鼠)免疫动物。在第180天，用所开发的药剂的多种双组分变体对动物进行再免疫。(1010个病毒颗粒/小鼠)。第一组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(1010个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
1)Ad26-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
2)Ad26-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2
3)Ad26-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
4)Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
5)Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2
6)Ad5-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
7)simAd25-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
8)simAd25-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2
9)simAd25-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
10)Ad26-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
11)Ad26-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
12)Ad26-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
13)Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
14)Ad5-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
15)Ad5-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
16)simAd25-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
17)simAd25-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
18)simAd25-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(EIA)来确定抗SARS-CoV-2抗体的滴度:
1)将抗原在+4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μL/孔的量加入到每个孔中。将板在+37℃的摇床上孵育1小时。
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
4)将50μL的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
5)然后将板在+37℃下孵育1小时。
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠IgG抗体。
8)然后将板在+37℃下孵育1小时。
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
10)然后加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(OD)。
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表5中示出。
表5–鼠血清中抗S蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
表5
所呈现的数据证明在使用所开发的药剂的单组分变体免疫小鼠后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
实例13
所开发的药剂用于在使用所开发的药剂的多种变体免疫后延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
本研究的目的是评估所开发的药剂在用所开发的药剂的多种变体免疫的动物的再接种中的潜在用途。
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠Balb/c。在第1阶段，用所开发的双组分药剂的变体(1010个病毒颗粒/小鼠)以21天间隔免疫动物。在第180天，用所开发的药剂的多种单组分变体对动物进行再免疫。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
1)Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
2)Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
3)Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
4)Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
5)Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
6)Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
7)simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2
8)simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad5-CMV-S-CoV2
9)simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2
10)Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
11)Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2
12)simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/simAd25-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2
13)Ad26-CMV-S-CoV2,Ad5-CMV-S-CoV2/Ad26-CMV-S-CoV2,simAd25-CMV-S-CoV2
在实验的第42天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(EIA)来确定抗SARS-CoV-2抗体的滴度:
1)将抗原在+4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μL/孔的量加入到每个孔中。将板在+37℃的摇床上孵育1小时。
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
4)将50μL的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
5)然后将板在+37℃下孵育1小时。
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠IgG抗体。
8)然后将板在+37℃下孵育1小时。
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
10)然后加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(OD)。
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表6中示出。
表6–鼠血清中抗S蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
表6
所呈现的数据证明在使用所开发的药剂的双组分变体免疫小鼠后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对SARS-CoV-2的疫苗接种后免疫的用途。
因此，如所呈现的实例所支持的那样，解决了所指定的技术问题，具体地，提供针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种后免疫的延长的药剂的产生。
工业用途
所有呈现的实例均支持这些药剂的功效，这些药剂提供了免疫应答的有效诱导，并延长针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种后免疫和工业用途。
序列表
<110> 俄罗斯联邦卫生部的联邦国家预算机构“以名誉院士 N. F. 加马列亚命名的国家流行病学和微生物学研究中心”(FEDERAL STATE BUDGETARY INSTITUTION "NATIONALRESEARCH CENTRE FOR EPIDEMIOLOGY AND MICROBIOLOGY NAMED AFTER THE HONORARYACADEMICIAN N.F. GAMALEYA" OF THE MINISTRY OF HEALTH OF THE RUSSIANFEDERATION)
<120> 用于诱导针对SARS-COV-2的免疫的药剂的用途
<130> LHB2267542P
<150> 2021104437
<151> 2021-02-21
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 所开发的含有CMV启动子、SARS-CoV-2的S蛋白的优化序列和聚腺苷酸化信号的表达盒
<400> 1
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttggta ccatgtttgt gttccttgtg ttattgccac 660
tagtctctag tcagtgtgtg aacctgacca caagaaccca gctgcctcca gcctacacca 720
acagctttac cagaggcgtg tactaccccg acaaggtgtt cagatccagc gtgctgcact 780
ctacccagga cctgttcctg cctttcttca gcaacgtgac ctggttccac gccatccacg 840
tgtccggcac caatggcacc aagagattcg acaaccccgt gctgcccttc aacgacgggg 900
tgtactttgc cagcaccgag aagtccaaca tcatcagagg ctggatcttc ggcaccacac 960
tggacagcaa gacccagagc ctgctgatcg tgaacaacgc caccaacgtg gtcatcaaag 1020
tgtgcgagtt ccagttctgc aacgacccct tcctgggcgt ctactatcac aagaacaaca 1080
agagctggat ggaaagcgag ttccgggtgt acagcagcgc caacaactgc accttcgagt 1140
acgtgtccca gcctttcctg atggacctgg aaggcaagca gggcaacttc aagaacctgc 1200
gcgagttcgt gttcaagaac atcgacggct acttcaagat ctacagcaag cacaccccta 1260
tcaacctcgt gcgggatctg cctcagggct tctctgctct ggaacccctg gtggatctgc 1320
ccatcggcat caacatcacc cggtttcaga cactgctggc cctgcacaga agctacctga 1380
cacctggcga tagcagcagc ggatggacag ctggtgccgc cgcttactat gtgggctacc 1440
tgcagcctag aaccttcctg ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc gacgccgtgg 1500
attgtgctct ggatcctctg agcgagacaa agtgcaccct gaagtccttc accgtggaaa 1560
agggcatcta ccagaccagc aacttccggg tgcagcccac cgaatccatc gtgcggttcc 1620
ccaatatcac caatctgtgc cccttcggcg aggtgttcaa tgccaccaga ttcgcctctg 1680
tgtacgcctg gaaccggaag cggatcagca attgcgtggc cgactactcc gtgctgtaca 1740
actccgccag cttcagcacc ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc 1800
tgtgcttcac aaacgtgtac gccgacagct tcgtgatccg gggagatgaa gtgcggcaga 1860
ttgcccctgg acagacaggc aagatcgccg actacaacta caagctgccc gacgacttca 1920
ccggctgtgt gattgcctgg aacagcaaca acctggactc caaagtcggc ggcaactaca 1980
attacctgta ccggctgttc cggaagtcca atctgaagcc cttcgagcgg gacatctcca 2040
ccgagatcta tcaggccggc agcacccctt gtaacggcgt ggaaggcttc aactgctact 2100
tcccactgca gtcctacggc tttcagccca caaatggcgt gggctatcag ccctacagag 2160
tggtggtgct gagcttcgaa ctgctgcatg cccctgccac agtgtgcggc cctaagaaaa 2220
gcaccaatct cgtgaagaac aaatgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcaccg 2280
gcgtgctgac agagagcaac aagaagttcc tgccattcca gcagtttggc cgggatattg 2340
ccgataccac agacgccgta cgagatcccc agacactgga aatcctggac atcacccctt 2400
gcagcttcgg cggagtgtct gtgatcaccc ctggcaccaa caccagcaat caggtggcag 2460
tgctgtacca ggacgtgaac tgtaccgaag tgcccgtggc cattcacgcc gatcagctga 2520
cacctacatg gcgggtgtac tccaccggca gcaatgtgtt tcagaccaga gccggctgtc 2580
tgatcggagc cgagcacgtg aacaatagct acgagtgcga catccccatc ggcgctggca 2640
tctgtgccag ctaccagaca cagacaaaca gccccagacg ggccagatct gtggccagcc 2700
agagcatcat tgcctacaca atgtctctgg gcgccgagaa cagcgtggcc tactccaaca 2760
actctatcgc tatccccacc aacttcacca tcagcgtgac cacagagatc ctgcctgtgt 2820
ccatgaccaa gaccagcgtg gactgcacca tgtacatctg cggcgattcc accgagtgct 2880
ccaacctgct gctgcagtac ggcagcttct gcacccagct gaatagagcc ctgacaggga 2940
tcgccgtgga acaggacaag aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctaca 3000
agacccctcc tatcaaggac ttcggcggct tcaatttcag ccagattctg cccgatccta 3060
gcaagcccag caagcggagc ttcatcgagg acctgctgtt caacaaagtg acactggccg 3120
acgccggctt catcaagcag tatggcgatt gtctgggcga cattgccgcc agggatctga 3180
tttgcgccca gaagtttaac ggactgacag tgctgccacc actgctgacc gatgagatga 3240
tcgcccagta cacatctgcc ctgctggccg gcacaatcac aagcggctgg acatttggag 3300
ctggcgccgc tctgcagatc ccctttgcta tgcagatggc ctaccggttc aacggcatcg 3360
gagtgaccca gaatgtgctg tacgagaacc agaagctgat cgccaaccag ttcaacagcg 3420
ccatcggcaa gatccaggac agcctgagca gcacagcaag cgccctggga aagctgcagg 3480
acgtggtcaa ccagaatgcc caggcactga acaccctggt caagcagctg tcctccaact 3540
tcggcgccat cagctctgtg ctgaacgaca tcctgagcag actggacaag gtggaagccg 3600
aggtgcagat cgacagactg atcaccggaa ggctgcagtc cctgcagacc tacgttaccc 3660
agcagctgat cagagccgcc gagattagag cctctgccaa tctggccgcc accaagatgt 3720
ctgagtgtgt gctgggccag agcaagagag tggacttttg cggcaagggc taccacctga 3780
tgagcttccc tcagtctgcc cctcacggcg tggtgtttct gcacgtgaca tacgtgcccg 3840
ctcaagagaa gaatttcacc accgctccag ccatctgcca cgacggcaaa gcccactttc 3900
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 所开发的含有CAG启动子、SARS-CoV-2的S蛋白的优化序列和聚腺苷酸化信号的表达盒
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gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctggat cctctgagcg agacaaagtg 1500
caccctgaag tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca 1560
gcccaccgaa tccatcgtgc ggttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt 1620
gttcaatgcc accagattcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tcagcaattg 1680
cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg 1740
cgtgtcccct accaagctga acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagcttcgt 1800
gatccgggga gatgaagtgc ggcagattgc ccctggacag acaggcaaga tcgccgacta 1860
caactacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgtgtgatt gcctggaaca gcaacaacct 1920
ggactccaaa gtcggcggca actacaatta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaatct 1980
gaagcccttc gagcgggaca tctccaccga gatctatcag gccggcagca ccccttgtaa 2040
cggcgtggaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggctttc agcccacaaa 2100
tggcgtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgcccc 2160
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attccagcag tttggccggg atattgccga taccacagac gccgtacgag atccccagac 2340
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caccaacacc agcaatcagg tggcagtgct gtaccaggac gtgaactgta ccgaagtgcc 2460
cgtggccatt cacgccgatc agctgacacc tacatggcgg gtgtactcca ccggcagcaa 2520
tgtgtttcag accagagccg gctgtctgat cggagccgag cacgtgaaca atagctacga 2580
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cagacgggcc agatctgtgg ccagccagag catcattgcc tacacaatgt ctctgggcgc 2700
cgagaacagc gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc cccaccaact tcaccatcag 2760
cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta 2820
catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac 2880
ccagctgaat agagccctga cagggatcgc cgtggaacag gacaagaaca cccaagaggt 2940
gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc aaggacttcg gcggcttcaa 3000
tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag cggagcttca tcgaggacct 3060
gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc aagcagtatg gcgattgtct 3120
gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgacagtgct 3180
gccaccactg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca tctgccctgc tggccggcac 3240
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gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa 3360
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cctggtcaag cagctgtcct ccaacttcgg cgccatcagc tctgtgctga acgacatcct 3540
gagcagactg gacaaggtgg aagccgaggt gcagatcgac agactgatca ccggaaggct 3600
gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga gccgccgaga ttagagcctc 3660
tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg ggccagagca agagagtgga 3720
cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag tctgcccctc acggcgtggt 3780
gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat 3840
ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg ttcgtgtcca acggcaccca 3900
ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt 3960
cgtgtctggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aataccgtgt acgaccctct 4020
gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag tactttaaga accacacaag 4080
ccccgacgtg gacctgggcg acatcagcgg aatcaatgcc agcgtcgtga acatccagaa 4140
agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca 4200
agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggctttat 4260
cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg tgttgcatga ccagctgctg 4320
tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgattc 4380
tgagcccgtg ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa gatatcgcgg ccgctcgagt 4440
ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4500
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 4560
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 4620
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatctta 4678
<210> 5
<211> 33765
<212> DNA
<213> 重组人类腺病毒血清型26(Recombinant human adenovirus serotype 26)
<220>
<223> E1和E3位点缺失且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代的重组人类腺病毒血清型26的母体序列
<400> 5
catcatcaat aatatacccc acaaagtaaa caaaagttaa tatgcaaatg agcttttgaa 60
ttttaacggt tttggggcgg agccaacgct gattggacga gaaacggtga tgcaaatgac 120
gtcacgacgc acggctaacg gtcgccgcgg aggcgtggcc tagcccggaa gcaagtcgcg 180
gggctgatga cgtataaaaa agcggacttt agacccggaa acggccgatt ttcccgcggc 240
cacgcccgga tatgaggtaa ttctgggcgg atgcaagtga aattaggtca ttttggcgcg 300
aaaactgaat gaggaagtga aaagcgaaaa ataccggtcc ctcccagggc ggaatattta 360
ccgagggccg agagactttg accgattacg tgggggtttc gattgcggtg tttttttcgc 420
gaatttccgc gtccgtgtca aagtccggtg tttatgtcac agatcagctg gtttccttta 480
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 540
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 600
aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 660
taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatcagtt atctagatcc 720
ggtggatcgg atatcttatg tgtaatgtaa tttgactcct ttgagcacgg gctcagaatc 780
gtcctcgtcg aacttgcagc agctgccaca gctacaacag cccttcaggc agctacagca 840
gctggtcatg caacacagca tgattgtgac catcacgatg gcaatcagtc cggcgataaa 900
gcccagccag atgtaccagg gccacttgat gtactgctcg tacttcccca gttcttgcag 960
gtcgatcagg ctctcgttca gattcttggc cacctcgttc agccggtcga tctctttctg 1020
gatgttcacg acgctggcat tgattccgct gatgtcgccc aggtccacgt cggggcttgt 1080
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tggagcggtg gtgaaattct tctcttgagc gggcacgtat gtcacgtgca gaaacaccac 1380
gccgtgaggg gcagactgag ggaagctcat caggtggtag cccttgccgc aaaagtccac 1440
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gctcaggctg tcctggatct tgccgatggc gctgttgaac tggttggcga tcagcttctg 1800
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gaacttcttg ttgctctctg tcagcacgcc ggtgccggtc aggccgttga agttgaagtt 2940
cacgcatttg ttcttcacga gattggtgct tttcttaggg ccgcacactg tggcaggggc 3000
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gctgtcggcg tacacgtttg tgaagcacag gtcgttcagc ttggtagggg acacgccgta 3420
gcacttgaag gtgctgaagc tggcggagtt gtacagcacg gagtagtcgg ccacgcaatt 3480
gctgatccgc ttccggttcc aggcgtacac agaggcgaat ctggtggcat tgaacacctc 3540
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ccggaagttg ctggtctggt agatgccctt ttccacggtg aaggacttca gggtgcactt 3660
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tgtccatccg ctgctgctat cgccaggtgt caggtagctt ctgtgcaggg ccagcagtgt 3840
ctgaaaccgg gtgatgttga tgccgatggg cagatccacc aggggttcca gagcagagaa 3900
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gaagaaaggc aggaacaggt cctgggtaga gtgcagcacg ctggatctga acaccttgtc 4440
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actcgcagcg ctgcacgggc tgtacctcat ccacgagata cacagcgcgt cccttgagga 9780
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ctgttcgatc tcctcctcct ggagatcgcc gcggcccgcg cgctccacgg tggcggcgag 10500
gtcattggag atgcgaccca tgagctgcga gaaggcgccc aggccgctct cgttccagac 10560
gcggctgtag accacgtccc cgtcggcgtc gcgcgcgcgc atgaccacct gcgcgaggtt 10620
gagctccacg tgccgcgcaa agacggcgta gttgcgcagg cgctggaaga ggtagttgag 10680
ggtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc cagcggcgca ggggcatctc 10740
gctgatgtcg ccgatggctt ccagcctttc catggcctcg tagaagtcca cggcgaagtt 10800
gaaaaactgg gcgttgcggg ccgagaccgt gagctcgtct tccaggagcc ggatgagttc 10860
ggcgatggtg gcgcgcacct cgcgctcgaa atccccgggg gcctcctcct cttcctcttc 10920
ttccatgacg acctcttctt ctatttcttc ctctgggggc ggtggtggtg gcgggggccg 10980
acgacgacgg cgacgcaccg ggagacggtc gacgaagcgc tcgatcatct ccccgcggcg 11040
gcgacgcatg gtttcggtga cggcgcgacc ccgttcgcga ggacgcagcg tgaagacgcc 11100
gccggtcatc tcccggtaat ggggcgggtc cccattgggc agcgataggg cgctgacgat 11160
gcatcttatc aattgcggtg taggggacgt gagcgcgtcg agatcgaccg gatcggagaa 11220
tctttcgagg aaagcgtcta gccaatcgca gtcgcaaggt aagctcaaac acgtagcagc 11280
cctgcggacg ctgttagaat tgcggttgct gatgatgtaa ttgaagtagg cgtttttgag 11340
gcggcggatg gtggcgagga ggaccaggtc cttgggtcca gcttgctgga tgcggagccg 11400
ctcggccatg ccccaggcct ggccctgaca ccggctcagg ttcttgtagt agtcatgcat 11460
gagcctctca atgtcatcac tggctgaggc ggagtcttcc atgcgggtga ccccgacgcc 11520
cctgagcggc tgcacgagcg ccaggtcggc gacgacgcgc tcggcgagga tggcctgttg 11580
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gtagaggtag cgggacatcc aggtgatgcc ggcggcggtg gtggaggcgc gcgggaactc 11940
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gccggtgaga cgcgcgcagt cattgacgct ctagaggcaa aaacgaaagc ggttgagcgg 12060
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gagtcccctc gaatcaggct ggagccgcga ctaacgtggt attggcactc ccgtctcgac 12180
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ctagacttga aagcgaccga aaaccctgcc gggtagtggc tcgcgcccgt agtctggaga 12300
agcatcgcca gggttgagtc gcggcagaac ccggttcgag gacggccgcg gcgagcggga 12360
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gagatggact tggaagaggg cgaagggctg gcaagactgg gggcgccgtc cccggagcga 12600
catccccgcg tgcagctgca gaaggacgtg cgcccggcgt acgtgcctac gcagaacctg 12660
ttcagggacc gcagcgggga ggagcccgag gagatgcgcg actgccggtt tcgggcgggc 12720
agggagctgc gcgagggcct ggaccgccag cgcgtgctgc gcgacgagga tttcgagccg 12780
aacgagcaga cggggatcag ccccgcacgc gcgcacgtgg cggcagccaa cctggtgacg 12840
gcctacgagc agacggtgaa gcaggagcgc aacttccaaa agagtttcaa caaccacgtg 12900
cgcaccctga tcgcgcgcga ggaggtggcc ctgggcctga tgcacctgtg ggacctggcg 12960
gaggccatcg tgcagaaccc ggacagcaag cctctgacgg cgcagctgtt cctggtggtg 13020
cagcacagca gggacaacga ggcgttcagg gaggcgctgc tgaacatcgc cgagcccgag 13080
ggtcgctggc tgctggagct gattaacatc ttgcagagca tcgtagtgca ggagcgcagc 13140
ctgagcctgg ccgagaaggt ggcggcgatc aactactcgg tgctgagcct gggcaagttt 13200
tacgcgcgca agatttacaa gacgccgtac gtgcccatag acaaggaggt gaagatagac 13260
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tacggttcag aggacttgga tgaggaagag gaagaggagg aggatgcacc cgctgcgggg 13560
tactgacgcc tccgtgatgt gtttttagat gtcccagcaa gccccggacc ccgccataag 13620
ggcggcgctg caaagccagc cgtccggtct agcatcggac gactgggagg ccgcgatgca 13680
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cagactctcg gccattctgg aggcggtggt cccctctcgg accaacccca cgcacgagaa 13800
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cgtgccgcgc gggcaggacg attacaccaa ctttatcagc gcgctgcggc tgatggtgac 14100
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gcagggcttg cagacggtga acctgagcca ggctttcaag aatctgcgcg ggctgtgggg 14220
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cctgggccat ctgctgacgc tgtaccgcga ggccataggc caggcgcagg tggacgagca 14400
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cgactcgctg ctgcagccgc cgcgggccaa gaacgccatg gccaataacg ggatagagag 15060
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ggctcctacg gagggcagaa acagcattcg ttactcggag ctggctccgc agtacgacac 15480
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cgaccacagc aacttcctga ccacggtggt gcagaacaac gatttcaccc ccgccgaggc 15600
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ggtgctgctg ccgggctgcg gggtggactt caccgagagc cgcctgagca acctcctggg 16080
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tgcaactcca gcgcaagaga cagcagctga taagaaggta gaagtcttgc ccattgaaaa 16320
ggatgagagt ggtagaagtt acaacctgat ccaggggacc cacgacacgc tgtaccgcag 16380
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caccaccccg gacgttacct gcggcgcgga gcaagtctac tggtcactgc cggacctcat 16500
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catccgcagc tacacctccc tcacccacgt cttcaaccgc ttccccgaca accagatcct 16680
ctgccgcccg cccgcgccca ccatcaccac cgtcagtgaa aacgtgcctg ctctcacaga 16740
tcacgggacg ctaccgctgc gcagcagtat ccgcggagtc cagcgagtga ccgtcactga 16800
cgcccgtcgc cgcacctgtc cctacgtcta caaggccctg ggcatagtcg cgccgcgcgt 16860
gctttccagt cgcaccttct aaaaaaatgt ctattctcat ctcgcccagc aataacaccg 16920
gctggggtct tactagaccc agcaccatgt acggaggagc caagaagcgc tcccagcagc 16980
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ccatgatgcg agccgcgcgc cgcgctgcca ctgcacccac ccccgcaggc aggactcgca 17340
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acgtgtactg ggtgcgcgac tccgtcacgg gcgtgcgcgt gcccgtgcgc acccgtcctc 17460
ctcgtccctg atctaatgct tgtgtcctcc cccgcaagcg acgatgtcaa agcgcaaaat 17520
caaggaggag atgctccagg tcgtcgcccc ggagatttac ggaccacccc aggcggacca 17580
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cgtgttgcgg cccggcacgg cggtggtgtt cacgcccggc gagcggtcct cggtcaggag 17760
caagcgtagc tatgacgagg tgtacggcga cgacgacatc ctggaccagg cggcggagcg 17820
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cgccacggct accgagcctc ccaggaggcg aagatggggc gccgccagcc ggctgatgcc 18300
caactacgtg ttgcatcctt ccatcatccc gacgccgggc taccgcggca cccggtacta 18360
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cgtgcgctac caccccagca tcctttaatt cgtgtgctgt gatactgttg cagagagatg 18540
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agaggcatgg caggcagcgg cctgaaccgc cgccggcggc gggccatgcg caggcgcctg 18660
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ggcatagctt ccgttgcgct gcaggcgtcg cagcgccgtt gatgtgcgaa taaagcctct 18780
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cctggctccg cggcacggca cgcggccgtt catgggcacc tggaacgaga tcggcaccag 18900
ccagctgaac gggggcgcct tcaattggag cagtgtctgg agcgggctta aaaatttcgg 18960
ctcgacgctc cggacctatg ggaacaaggc ctggaatagt agcacggggc agttgttaag 19020
ggaaaagctc aaagaccaaa acttccagca gaaggtggtg gacgggctgg cctcgggcat 19080
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ccaggcccag aactggcaga gcacgctgca cagtatcgtg ggcctgggag tgaaaagtct 19500
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gggcgtacat gcacatcgcc gggcaggacg cctcggagta cctgagcccg ggtctggtgc 19680
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gtcacatcca tctccaccac gtggtccttg tggatcatca tcgtcccgtg cagacacttg 23880
agctggcctt ccacctcggt gcagccgtga tcccacaggg cgcaaccggt gcactcccag 23940
ttcttgtgcg caatcccgct gtggctgaag atgtaacctt gcaacatgcg gcccatgatg 24000
gtgctaaatg ctttctgggt ggtgaaggtc agttgcatcc cgcgggcctc ctcgttcatc 24060
caggtctggc acatcttctg gaagatctcg gtctgctcgg gcatgagctt gtaagcatcg 24120
cgcaggccgc tgtcgacgcg gtagcgttcc atcagcacgt tcatggtatc catgcccttc 24180
tcccaggacg agaccagagg cagactcaga gggttgcgta cgttcaggac accgggggtc 24240
gcgggctcga cgatgcgttt tccgtccttg ccttccttca atagaaccgg cggctggctg 24300
aatcccactc ccacgatcac ggcatcttcc tggggcatct cttcgtcggg gtctaccttg 24360
gtcacatgct tggtctttct ggcttgcttc ttttttggag ggctgtccac ggggagcacg 24420
tcctcctcgg aagacccgga gcccacccgc tgatactttc ggcgcttggt gggcagagga 24480
ggtggcggcg aggggctcct ctcctgctcc ggcggatagc gcgccgaccc gtggccccgg 24540
ggcggagtgg cctctcggcc catgaaccgg cgcacgtcct gactgccgcc ggccattgtt 24600
tcctagggga agatggagga gcagccgcgt aagcaggagc aggaggagga cttaaccacc 24660
cacgagcaac ccaaaatcga gcaggacctg ggcttcgaag agccggctcg tctagaaccc 24720
ccacaggatg aacaggagca cgagcaagac gcaggccagg aggagaccga cgctgggctc 24780
gagcatggct acctgggagg agaggaggat gtgctgctga aacacctgca gcgccagtcc 24840
ctcatcctcc gggacgccct ggccgaccgg agcgaaaccc ccctcagcgt cgaggagctg 24900
tgtcgggcct acgagctcaa cctcttctcg ccgcgcgtac cccccaaacg ccagcccaac 24960
ggcacctgcg agcccaaccc gcgtctcaac ttctatcccg tctttgcggt ccccgaagcc 25020
ctcgccacct atcacatctt tttcaagaac caaaagatcc ccgtctcctg ccgcgccaac 25080
cgcaccagcg ccgacgcgct cctcgctctg gggcccggcg cgcgcatacc tgatatcgct 25140
tccctggaag aggtgcccaa gatcttcgaa gggctcggtc gggacgagac gcgcgcggcg 25200
aacgctctga aagaaacagc agaggaagag ggtcacacta gcgccctggt agagttggaa 25260
ggcgacaacg ccaggctggc cgtgctcaag cgcagcgtcg agctcaccca cttcgcctac 25320
cccgccgtca acctcccgcc caaggtcatg cgtcgcatca tggatcagct catcatgccc 25380
cacatcgagg ccctcgatga aagtcaggag cagcgccccg aggacgcccg gcccgtggtc 25440
agcgacgaga tgctcgcgcg ctggctcggg acccacgacc cccaggcttt ggaacagcgg 25500
cgcaagctca tgctggccgt ggtcctggtt accctcgagc tggaatgcat gcgccgcttc 25560
ttcagcgacc ccgagaccct gcgcaaggtc gaggagaccc tgcactacac tttcagacac 25620
ggtttcgtca ggcaggcctg caagatctcc aacgtggagc tgaccaacct ggtctcctgc 25680
ctggggatcc tgcacgagaa ccgcctgggg cagaccgtgc tccactctac cctgaagggc 25740
gaggcgcggc gggactatgt ccgcgactgc gtctttctat ttctttgcca cacatggcaa 25800
gcagccatgg gcgtgtggca acagtgtctc gaggacgata acctgaagga gctggacaag 25860
cttcttgcta gaaatcttaa aaagctgtgg acgggcttcg acgagcgcac cgtcgcctcg 25920
gacctggccg agatcgtgtt ccccgagcgc ctgaggcaga cgctgaaagg cgggctgccc 25980
gacttcatga gccagagcat gttgcaaaac taccgcactt tcattctcga gcgatctggg 26040
atgctgcccg ccacctgcaa cgctttcccc tccgactttg tcccgctgag ctaccgcgag 26100
tgtcccccgc cgctgtggag ccactgctac ctcttgcagc tggccaacta catcgcctac 26160
cactcggacg tgatcgagga cgtgagcggc gaggggctgc tcgagtgcca ctgccgctgc 26220
aacctgtgct ccccgcaccg ctccctggtc tgcaaccccc agctactaag cgagacccag 26280
gtcatcggta cctttgagct gcaaggtccg caggagtcca ccgctccgct gaaactcacg 26340
ccggggttgt ggacttccgc gtacctgcgc aaatttgtac ccgaggacta ccacgcccac 26400
gagataaagt tcttcgagga ccaatcgcgt ccgcagcacg cggatctcac ggcctgcgtc 26460
atcacccagg gcgcaatcct cgcccaattg cacgccatcc aaaaatcccg ccaagagttt 26520
cttctgaaaa agggtagagg ggtctacctg gacccccaga cgggcgaagt gctcaacccg 26580
ggtctccccc agcatgccga ggaagaagca ggagccgcta gtggaggaga tggaagaaga 26640
atgggacagc caggcagagg aggacgaatg ggaggaggag acagaggagg aagaattgga 26700
agaggtggaa gaggagcagg caacagagca gcccgtcgcc gcaccatccg cgccggcagc 26760
cccgccggtc acggatacaa cctccgcagc tccggccaag cctcctcgta gatgggatcg 26820
agtgaagggt gacggtaagc acgagcggca gggctaccga tcatggaggg cccacaaagc 26880
cgcgatcatc gcctgcttgc aagactgcgg ggggaacatc gctttcgccc gccgctacct 26940
gctcttccac cgcggggtaa acatcccccg caacgtgttg cattactacc gtcaccttca 27000
cagctaagaa aaagcaagta aaaggagtcg ccggaggagg aggaggcctg aggatcgcgg 27060
cgaacgagcc cttgaccacc agggagctga ggaaccggat cttccccact ctttatgcca 27120
tttttcagca gagtcgaggt cagcagcaag agctcaaagt aaaaaaccgg tctctgcgct 27180
cgctcacccg cagttgcttg taccacaaaa acgaagatca gctgcagcgc actctcgaag 27240
acgccgaggc tctgttccac aagtactgcg cgctcactct taaagactaa ggcgcgccca 27300
cccggaaaaa aggcgggaat tacctcatcg ccaccatgag caaggagatt cccacccctt 27360
acatgtggag ctatcagccc caaatgggcc tggccgcggg cgcctcccag gactactcca 27420
cccgcatgaa ctggctcagt gccggcccct cgatgatctc acgggtcaac ggggtccgca 27480
gtcatcgaaa ccagatattg ttggagcagg cggcggtcac ctccacgccc agggcaaagc 27540
tcaacccgcg taattggccc tccaccctgg tgtatcagga aatccccggg ccgactaccg 27600
tactacttcc gcgtgacgca ctggccgaag tccgcatgac taactcaggt gtccagctgg 27660
ccggcggcgc ttcccggtgc ccgctccgcc cacaatcggg tataaaaacc ctggtgatcc 27720
gaggcagagg cacacagctc aacgacgagt tggtgagctc ttcgatcggt ctgcgaccgg 27780
acggagtgtt ccaactagcc ggagccggga gatcctcctt cactcccaac caggcctacc 27840
tgaccttgca gagcagctct tcggagcctc gctccggagg catcggaacc ctccagtttg 27900
tggaggagtt tgtgccctcg gtctacttca accccttctc gggatcgcca ggcctctacc 27960
cggacgagtt cataccgaac ttcgacgcag tgagagaagc ggtggacggc tacgactgaa 28020
tgtcccatgg tgactcggct gagctcgctc ggttgaggca tctggaccac tgccgccgcc 28080
tgcgctgctt cgcccgggag agctgcggac tcatctactt tgagtttccc gaggagcacc 28140
ccaacggccc tgcacacgga gtgcggatca ccgtagaggg caccaccgag tctcacctgg 28200
tcaggttctt cacccagcaa cccttcctgg tcgagcggga ccggggcgcc accacctaca 28260
ccgtctactg catctgtcca accccgaagt tgcatgagaa tttttgttgt actctttgtg 28320
gtgagtttaa taaaagctaa actcttgcaa tactctggac cttgtcgtcg tcaactcaac 28380
gagaccgtct acctcaccaa ccagactgag gtaaaactca cctgcagacc acacaagacc 28440
tatatcatct ggttcttcga gaacacctca tttgcagtct ccaacactca ctgcaacgac 28500
ggtgttgaac ttcccaacaa cctttccagt ggactgagtt acgatacaca tagagctaag 28560
ctcgtcctct acaatccttt tgtagaggga acctaccagt gccagagcgg accttgtact 28620
cacaccttcc atttggtgaa cgtcaccagc agcagcaaca gctcagaaac taaccttcct 28680
tctgatacta acaaacctcg tttcggaggt gagctaaggc ttcccccttc tgaggagggg 28740
gttagcccat acgaagtggt cgggtatttg attttagggg tggtcctggg tgggtgcata 28800
gcggtgctag tcgagatgga cggccaggcc tccgagcagc gcatcctgca actgcgcgtc 28860
cgtcagcagc aggagcgtgc cgccaaggag ctcctcgatg ccatcaacat ccaccagtgc 28920
aagaagggca tcttctgcct ggtcaaacag gcaaagatca cctacgagct cgtgtccggc 28980
ggcaagcagc atcgcctcgc ctatgagctg ccccagcaga agcagaagtt cacctgcatg 29040
gtgggcgtca accccatagt catcacccag cagtcgggcg agaccagcgg ctgcatccac 29100
tgctcctgcg aaagccccga gtgcatctac tccctgctca agaccctttg cggactccgc 29160
gacctcctcc ccatgaactg atgttgatta aaagcccaaa aaccaatcag ccccttcccc 29220
ctaatcattc aataaagatc acttacttga aatctgaaag tatgtctctg gtgtagttgt 29280
tcagcagcac ctcggtaccc tcctcccagc tctggtactc cagtccccgg cgggcggcga 29340
acttcctcca caccttgaaa gggatgtcaa attcctggtc cacaattttc attgtcttcc 29400
ctctcagatg gcaaagaggc tccgggtgga agatgacttc aaccccgtct acccctatgg 29460
ctacgcgcgg aatcagaata tccccttcct cactcccccc tttgtctcct ccgatggatt 29520
caaaaacttc ccccctgggg tcctgtcact taaactggct gatccaatca ccatcaacaa 29580
tggggatgtc tcacttaagg tgggaggggg acttgctgta gagcaacaga ctggtaacct 29640
aagcgtaaac cctgatgcac ccttgcaagt tgcaagtgat aagctacagc ttgctctggc 29700
tcctccattc gaggtcagag atggaaagct tgctttaaag gcaggtaatg gattaaaagt 29760
actagataat tccattactg gattgactgg attattgaat acacttgtgg tattaactgg 29820
aaggggaata ggaacggagg aattaaaaaa tgacgatggt gtaacaaaca aaggagtcgg 29880
cttgcgtgta agacttggag atgacggcgg gctgacattt gataaaaagg gtgatttagt 29940
agcctggaat aaaaaagatg acaggcgcac cctgtggaca acccctgaca catctccaaa 30000
ttgcaaaatg agtacagaaa aggattctaa acttacgttg acacttacaa agtgtggaag 30060
tcaggttctg ggaaatgtat ctttacttgc agttacaggt gaatatcatc aaatgactgc 30120
tactacaaag aaggatgtaa aaatatcttt actatttgat gagaatggaa ttctattacc 30180
atcttcgtcc cttagcaaag attattggaa ttacagaagt gatgattcta ttgtatctca 30240
aaaatataat aatgcagttc cattcatgcc aaacctgaca gcttatccaa aaccaagcgc 30300
tcaaaatgca aaaaactatt caagaactaa aatcataagt aatgtctact taggtgctct 30360
tacctaccaa cctgtaatta tcactattgc atttaatcag gaaactgaaa atggatgtgc 30420
ttattctata acatttacct tcacttggca aaaagactat tctgcccaac agtttgatgt 30480
tacatctttt accttctcat atcttaccca agagaacaaa gacaaagact aataaaatgt 30540
tttgaactga atttatgaat ctttatttat ttttacacca gcacgggtag tcagtttccc 30600
accaccagcc catttcacag tgtaaacaat tctctcagca cgggtggcct taaacaggtc 30660
acagaaccct agtattcaac ctgccacctc cctcccaaca cacagagtac acagtccttt 30720
ctccccggct ggccttaaaa agcatcatat catgggtaac agacatattc ttaggtgtta 30780
tattccacac ggtttcctgt cgagccaaac gctcatcagt gatattaata aactccccgg 30840
gcagctcact taagttcatg tcgctgtcca gctgctgagc cacaggctgc tgtccaactt 30900
gcggttgctt aacgggcggc gaaggagaag tccacgccta catgggggta gagtcataat 30960
cgtgcatcag gatagggcgg tggtgctgca gcagcgcgcg aataaactgc tgccgccgcc 31020
gctccgtcct gcaggaatac aacatggcag tggtctcctc agcgatgatt cgcaccgccc 31080
gcagcataag gcgccttgtc ctccgggcac agcagcgcac cctgatctca cttaaatcag 31140
cacagtaact gcagcacagc accacaatat tgttcaaaat cccacagtgc aaggcgctgt 31200
atccaaagct catggcgggg accacagaac ccacgtggcc atcataccac aagcgcaggt 31260
agattaagtg gcgacccctc ataaacacgc tggacataaa cattacctct tttggcatgt 31320
tgtaattcac cacctcccgg taccatataa acctctgatt aaacatggcg ccatccacca 31380
ccatcctaaa ccagctggcc aaaacctgcc cgccggctat acactgcagg gaaccgggac 31440
tggaacaatg acagtggaga gcccaggact cgtaaccatg gatcatcatg ctcgtcatga 31500
tatcaatgtt ggcacaacac aggcacacgt gcatacactt cctcaggatt acaagctcct 31560
cccgcgttag aaccatatcc cagggaacaa cccattcctg aatcagcgta aatcccacac 31620
tgcagggaag acctcgcacg taactcacgt tgtgcattgt caaggtgtta cattcgggca 31680
gcagcggatg atcctccagt atggtagcgc gggtttctgt ctcaaaagga ggtagacgat 31740
ccctactgta cggagtgcgc cgagacaacc gagatcgtgt tggtcgtagt gtcatgccaa 31800
atggaacgcc ggacgtagtc atatttcctg aaggagctcg actgttcctc ggtggacatt 31860
gaaatggatt ctcttgcgta ccttgtcgta cttctgccag cagaaagtgg ctcgggaaca 31920
gcagatacct ttcctcctgc tgtccttccg ctgctgacgc tcagtcatcc aactgaagta 31980
cagccattcc cgcaggttct ccagcagctc ctgtgcatct gatgaaacaa aagtcccgtc 32040
gatgcggatt ccccttaaaa catcagccag gacattgtag gccatcccaa tccagttaat 32100
gcatcctgat ctatcatgaa gaggaggtgg gggaagaact ggaagaacca tttttattcc 32160
aagcggtctc gaaggacgat aaagtgcaag tcacgcaggt gacagcgttc cccgccgctg 32220
tgctggtgga aacagacagc caggtcaaaa cccactctat tttcaaggtg ctcgactgtg 32280
gcttcgagca gtggctctac gcgtacatcc agcataagaa tcacattaaa ggctggacct 32340
ccatcgattt catcaatcat caggttacac tcattcacca tccccaggta attctcattt 32400
ttccagcctt ggattatttc tacaaattgt tggtgtaagt ccactccgca catgtggaaa 32460
agttcccaca gcgccccctc cactttcata atcaggcaga ccttcatatt agaaacagat 32520
cctgctgctc caccacctgc agcgtgttca aaacaacaag attcaatgag gttctgccct 32580
ctgccctcag ctcacgtctc agcgtcagct gcaaaaagtc actcaagtcc tcagccacta 32640
cagctgacaa ttcagagcca gggctaagcg tgggactggc aagcgtgagt gagtaccacc 32700
caaaaactgc atgctggaat aagctctctt tgtgtcaccg gtgatgcctt ccaataggtg 32760
agtgataaag cgaggtagtt tttctttaat catttgagta atagaaaagt cctctaaata 32820
agtcactagg accccaggaa ccacaatgtg gtagctgaca gcgtgtcgct caagcatggt 32880
tagtagagat gagagtctga aaaacagaaa gcatgcacta aaccagagtt gccagtctca 32940
ctgaaggaaa aatcactctc tccagcagca aagtgcccac tgggtggccc tctcggacat 33000
acaaaaatcg atccgtgtgg ttaaagagca gcacagttag ctcctgtctt ctcccagcaa 33060
agatcacatc ggactgggtt agtatgcccc tggaatggta gtcattcaag gccataaatc 33120
tgccttggta gccattagga atcagcacgc tcactctcaa gtgaaccaaa accaccccat 33180
gcggaggaat gtggaaagat tctgggcaaa aaaaggtata tctattgcta gtcccttcct 33240
ggacgggagc aatccctcca gggctatcta tgaaagcata cagagattca gccatagctc 33300
agcccgctta ccagtagaca gagagcacag cagtacaagc gccaacagca gcgactgact 33360
acccactgac ccagctccct atttaaaggc accttacact gacgtaatga ccaaaggtct 33420
aaaaaccccg ccaaaaaaac acacacgccc tgggtgtttt tcgcgaaaac acttccgcgt 33480
tctcacttcc tcgtatcgat ttcgtgactc aacttccggg ttcccacgtt acgtcacttc 33540
tgcccttaca tgtaactcag ccgtagggcg ccatcttgcc cacgtccaaa atggcttcca 33600
tgtccggcca cgcctccgcg gcgaccgtta gccgtgcgtc gtgacgtcat ttgcatcacc 33660
gtttctcgtc caatcagcgt tggctccgcc ccaaaaccgt taaaattcaa aagctcattt 33720
gcatattaac ttttgtttac tttgtggggt atattattga tgatg 33765
<210> 6
<211> 34808
<212> DNA
<213> 重组猿猴腺病毒血清型25(Recombinant simian adenovirus serotype 25)
<220>
<223> E1和E3位点缺失的重组猿猴腺病毒血清型25的母体序列
<400> 6
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tacatggccc gaaaggagcg 360
atgtaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 420
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 480
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 540
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 600
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 660
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 720
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 780
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 840
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 900
tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta gagatctggt 960
accgtcgacg cggccgctcg agcctaagct tggtaccatg tttgtgttcc ttgtgttatt 1020
gccactagtc tctagtcagt gtgtgaacct gaccacaaga acccagctgc ctccagccta 1080
caccaacagc tttaccagag gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcagat ccagcgtgct 1140
gcactctacc caggacctgt tcctgccttt cttcagcaac gtgacctggt tccacgccat 1200
ccacgtgtcc ggcaccaatg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga 1260
cggggtgtac tttgccagca ccgagaagtc caacatcatc agaggctgga tcttcggcac 1320
cacactggac agcaagaccc agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat 1380
caaagtgtgc gagttccagt tctgcaacga ccccttcctg ggcgtctact atcacaagaa 1440
caacaagagc tggatggaaa gcgagttccg ggtgtacagc agcgccaaca actgcacctt 1500
cgagtacgtg tcccagcctt tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa 1560
cctgcgcgag ttcgtgttca agaacatcga cggctacttc aagatctaca gcaagcacac 1620
ccctatcaac ctcgtgcggg atctgcctca gggcttctct gctctggaac ccctggtgga 1680
tctgcccatc ggcatcaaca tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta 1740
cctgacacct ggcgatagca gcagcggatg gacagctggt gccgccgctt actatgtggg 1800
ctacctgcag cctagaacct tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc 1860
cgtggattgt gctctggatc ctctgagcga gacaaagtgc accctgaagt ccttcaccgt 1920
ggaaaagggc atctaccaga ccagcaactt ccgggtgcag cccaccgaat ccatcgtgcg 1980
gttccccaat atcaccaatc tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc 2040
ctctgtgtac gcctggaacc ggaagcggat cagcaattgc gtggccgact actccgtgct 2100
gtacaactcc gccagcttca gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta ccaagctgaa 2160
cgacctgtgc ttcacaaacg tgtacgccga cagcttcgtg atccggggag atgaagtgcg 2220
gcagattgcc cctggacaga caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga 2280
cttcaccggc tgtgtgattg cctggaacag caacaacctg gactccaaag tcggcggcaa 2340
ctacaattac ctgtaccggc tgttccggaa gtccaatctg aagcccttcg agcgggacat 2400
ctccaccgag atctatcagg ccggcagcac cccttgtaac ggcgtggaag gcttcaactg 2460
ctacttccca ctgcagtcct acggctttca gcccacaaat ggcgtgggct atcagcccta 2520
cagagtggtg gtgctgagct tcgaactgct gcatgcccct gccacagtgt gcggccctaa 2580
gaaaagcacc aatctcgtga agaacaaatg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg 2640
caccggcgtg ctgacagaga gcaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt ttggccggga 2700
tattgccgat accacagacg ccgtacgaga tccccagaca ctggaaatcc tggacatcac 2760
cccttgcagc ttcggcggag tgtctgtgat cacccctggc accaacacca gcaatcaggt 2820
ggcagtgctg taccaggacg tgaactgtac cgaagtgccc gtggccattc acgccgatca 2880
gctgacacct acatggcggg tgtactccac cggcagcaat gtgtttcaga ccagagccgg 2940
ctgtctgatc ggagccgagc acgtgaacaa tagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc 3000
tggcatctgt gccagctacc agacacagac aaacagcccc agacgggcca gatctgtggc 3060
cagccagagc atcattgcct acacaatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctactc 3120
caacaactct atcgctatcc ccaccaactt caccatcagc gtgaccacag agatcctgcc 3180
tgtgtccatg accaagacca gcgtggactg caccatgtac atctgcggcg attccaccga 3240
gtgctccaac ctgctgctgc agtacggcag cttctgcacc cagctgaata gagccctgac 3300
agggatcgcc gtggaacagg acaagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat 3360
ctacaagacc cctcctatca aggacttcgg cggcttcaat ttcagccaga ttctgcccga 3420
tcctagcaag cccagcaagc ggagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aagtgacact 3480
ggccgacgcc ggcttcatca agcagtatgg cgattgtctg ggcgacattg ccgccaggga 3540
tctgatttgc gcccagaagt ttaacggact gacagtgctg ccaccactgc tgaccgatga 3600
gatgatcgcc cagtacacat ctgccctgct ggccggcaca atcacaagcg gctggacatt 3660
tggagctggc gccgctctgc agatcccctt tgctatgcag atggcctacc ggttcaacgg 3720
catcggagtg acccagaatg tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa 3780
cagcgccatc ggcaagatcc aggacagcct gagcagcaca gcaagcgccc tgggaaagct 3840
gcaggacgtg gtcaaccaga atgcccaggc actgaacacc ctggtcaagc agctgtcctc 3900
caacttcggc gccatcagct ctgtgctgaa cgacatcctg agcagactgg acaaggtgga 3960
agccgaggtg cagatcgaca gactgatcac cggaaggctg cagtccctgc agacctacgt 4020
tacccagcag ctgatcagag ccgccgagat tagagcctct gccaatctgg ccgccaccaa 4080
gatgtctgag tgtgtgctgg gccagagcaa gagagtggac ttttgcggca agggctacca 4140
cctgatgagc ttccctcagt ctgcccctca cggcgtggtg tttctgcacg tgacatacgt 4200
gcccgctcaa gagaagaatt tcaccaccgc tccagccatc tgccacgacg gcaaagccca 4260
ctttcctaga gaaggcgtgt tcgtgtccaa cggcacccat tggttcgtga cccagcggaa 4320
cttctacgag ccccagatca tcaccaccga caacaccttc gtgtctggca actgcgacgt 4380
cgtgatcggc attgtgaaca ataccgtgta cgaccctctg cagcccgagc tggacagctt 4440
caaagaggaa ctggataagt actttaagaa ccacacaagc cccgacgtgg acctgggcga 4500
catcagcgga atcaatgcca gcgtcgtgaa catccagaaa gagatcgacc ggctgaacga 4560
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gtacatcaag tggccctggt acatctggct gggctttatc gccggactga ttgccatcgt 4680
gatggtcaca atcatgctgt gttgcatgac cagctgctgt agctgcctga agggctgttg 4740
tagctgtggc agctgctgca agttcgacga ggacgattct gagcccgtgc tcaaaggagt 4800
caaattacat tacacataag atatccgatc caccggatct agataactga tcataatcag 4860
ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa 4920
cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg 4980
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 5040
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc ggatctgggc gtggttaagg 5100
gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc 5160
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cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc 5280
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gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat 5460
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tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg 5700
tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga 5760
tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc 5820
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ttggctatgt tcccagccat atccctccgg ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca 6060
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ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt 6240
tccaggatga gatcgtcata ggccattttt acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc 6300
ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg tagttaccct cacagatttg catttcccac 6360
gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc 6420
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ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag 6540
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tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa 6660
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tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg 7080
cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg 7140
attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc 7200
aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt 7260
tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt 7320
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gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt 7440
gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca 7500
tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg 7560
gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg 7620
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga 7680
cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg 7740
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caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg cgttggacag caacttggcg atggagcgca 7860
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tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt 9240
tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa 9300
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ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta 9420
gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg 9480
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gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt 9780
ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga 9840
ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga 9900
caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg 9960
ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat 10020
acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc 10080
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gggagggggg acacggcggc gacgacggcg caccgggagg cggtcgacaa agcgctcgat 11040
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ggacctgagc gagtccgcat cgaccggatc ggaaaacctc tcgagaaagg cgtctaacca 11280
gtcacagtcg caaggtaggc tgagcaccgt ggcgggcggc agcgggcggc ggtcggggtt 11340
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gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc 11520
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cctcatcggc tgaagcaggg ctaggtcggc gacaacgcgc tcggctaata tggcctgctg 11700
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gttgatggtg taagtgcagt tggccataac ggaccagtta acggtctggt gacccggctg 11820
cgagagctcg gtgtacctga gacgcgagta agccctcgag tcaaatacgt agtcgttgca 11880
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ccagcgtagg gtggccgggg ctccgggggc gagatcttcc aacataaggc gatgatatcc 12000
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ttcgagcccc gtatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac 12300
ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag tgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc 12360
ggctgctgcg ctagcttttt tggccactgg ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa 12420
agcgaaagca ttaagtggct cgctccctgt agccggaggg ttattttcca agggttgagt 12480
cgcgggaccc ccggttcgag tctcggaccg gccggactgc ggcgaacggg ggtttgcctc 12540
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gttttacgcc cgcaagatat accatacccc ttacgttccc atagacaagg aggtaaagat 13500
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agcaataaca caggctgggg cctgcgcttc ccaagcaaga tgtttggcgg ggccaagaag 17520
cgctccgacc aacacccagt gcgcgtgcgc gggcactacc gcgcgccctg gggcgcgcac 17580
aaacgcggcc gcactgggcg caccaccgtc gatgacgcca tcgacgcggt ggtggaggag 17640
gcgcgcaact acacgcccac gccgccacca gtgtccacag tggacgcggc cattcagacc 17700
gtggtgcgcg gagcccggcg ctatgctaaa atgaagagac ggcggaggcg cgtagcacgt 17760
cgccaccgcc gccgacccgg cactgccgcc caacgcgcgg cggcggccct gcttaaccgc 17820
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tggaaaggtc gacgcgtaaa acgtgttttg cgacccggca ccaccgtagt ctttacgccc 18360
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tggaaaaatc aaaataaaaa gtctggactc tcacgctcgc ttggtcctgt aactattttg 19560
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cgccgttgtt gtaacccgtc ctagccgcgc gtccctgcgc cgcgccgcca gcggtccgcg 20220
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ctgctcttga aataaaccta gaagaagagg acgatgacaa cgaagacgaa gtagacgagc 20880
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caaaggaggg tattcaaata ggtgtcgaag gtcaaacacc taaatatgcc gataaaacat 21000
ttcaacctga acctcaaata ggagaatctc agtggtacga aacagaaatt aatcatgcag 21060
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ccacaaatga aaatggaggg caaggcattc ttgtaaagca acaaaatgga aagctagaaa 21180
gtcaagtgga aatgcaattt ttctcaacta ctgaggcagc cgcaggcaat ggtgataact 21240
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ttattgaaaa tcatggaact gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg 21660
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caaggctatg gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac 31080
agtaggaaac aaaaataatg ataagctaac tttgtggacc acaccagctc catctcctaa 31140
ctgtagacta aatgcagaga aagatgctaa actcactttg gtcttaacaa aatgtggcag 31200
tcaaatactt gctacagttt cagttttggc tgttaaaggc agtttggctc caatatctgg 31260
aacagttcaa agtgctcatc ttattataag atttgacgaa aatggagtgc tactaaacaa 31320
ttccttcctg gacccagaat attggaactt tagaaatgga gatcttactg aaggcacagc 31380
ctatacaaac gctgttggat ttatgcctaa cctatcagct tatccaaaat ctcacggtaa 31440
aactgccaaa agtaacattg tcagtcaagt ttacttaaac ggagacaaaa ctaaacctgt 31500
aacactaacc attacactaa acggtacaca ggaaacagga gacacaactc caagtgcata 31560
ctctatgtca ttttcatggg actggtctgg ccacaactac attaatgaaa tatttgccac 31620
atcctcttac actttttcat acattgccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca 31680
acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc 31740
caccaccaca tagcttatac agatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat 31800
tcaacctgcc acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct 31860
taaaaagcat catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt 31920
cctgtcgagc caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc tcacttaagt 31980
tcatgtcgct gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt tgcttaacgg 32040
gcggcgaagg agaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc atcaggatag 32100
ggcggtggtg ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc gtcctgcagg 32160
aatacaacat ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc ataaggcgcc 32220
ttgtcctccg ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc 32280
acagcaccac aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg 32340
cggggaccac agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac 32400
ccctcataaa cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct 32460
cccggtacca tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc 32520
tggccaaaac ctgcccgccg gctatacact gcagggaacc gggactggaa caatgacagt 32580
ggagagccca ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca atgttggcac 32640
aacacaggca cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc gttagaacca 32700
tatcccaggg aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag ggaagacctc 32760
gcacgtaact cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc ggatgatcct 32820
ccagtatggt agcgcgggtt tctgtctcaa aaggaggtag acgatcccta ctgtacggag 32880
tgcgccgaga caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga acgccggacg 32940
tagtcatatt tcctgaagca aaaccaggtg cgggcgtgac aaacagatct gcgtctccgg 33000
tctcgccgct tagatcgctc tgtgtagtag ttgtagtata tccactctct caaagcatcc 33060
aggcgccccc tggcttcggg ttctatgtaa actccttcat gcgccgctgc cctgataaca 33120
tccaccaccg cagaataagc cacacccagc caacctacac attcgttctg cgagtcacac 33180
acgggaggag cgggaagagc tggaagaacc atgttttttt ttttattcca aaagattatc 33240
caaaacctca aaatgaagat ctattaagtg aacgcgctcc cctccggtgg cgtggtcaaa 33300
ctctacagcc aaagaacaga taatggcatt tgtaagatgt tgcacaatgg cttccaaaag 33360
gcaaacggcc ctcacgtcca agtggacgta aaggctaaac ccttcagggt gaatctcctc 33420
tataaacatt ccagcacctt caaccatgcc caaataattc tcatctcgcc accttctcaa 33480
tatatctcta agcaaatccc gaatattaag tccggccatt gtaaaaatct gctccagagc 33540
gccctccacc ttcagcctca agcagcgaat catgattgca aaaattcagg ttcctcacag 33600
acctgtataa gattcaaaag cggaacatta acaaaaatac cgcgatcccg taggtccctt 33660
cgcagggcca gctgaacata atcgtgcagg tctgcacgga ccagcgcggc cacttccccg 33720
ccaggaacca tgacaaaaga acccacactg attatgacac gcatactcgg agctatgcta 33780
accagcgtag ccccgatgta agcttgttgc atgggcggcg atataaaatg caaggtgctg 33840
ctcaaaaaat caggcaaagc ctcgcgcaaa aaagaaagca catcgtagtc atgctcatgc 33900
agataaaggc aggtaagctc cggaaccacc acagaaaaag acaccatttt tctctcaaac 33960
atgtctgcgg gtttctgcat aaacacaaaa taaaataaca aaaaaacatt taaacattag 34020
aagcctgtct tacaacagga aaaacaaccc ttataagcat aagacggact acggccatgc 34080
cggcgtgacc gtaaaaaaac tggtcaccgt gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg 34140
tcatgtccgg agtcataatg taagactcgg taaacacatc aggttgattc acatcggtca 34200
gtgctaaaaa gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac ccgcaggcgt agagacaaca 34260
ttacagcccc cataggaggt ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca taaacacctg 34320
aaaaaccctc ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt 34380
ccacagcggc agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac 34440
accactcgac acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc 34500
gagtatatat aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa cacccagaaa 34560
accgcacgcg aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt cctcaaatcg 34620
tcacttccgt tttcccacgt tacgtcactt cccattttaa gaaaactaca attcccaaca 34680
catacaagtt actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca 34740
cgtcacaaac tccaccccct cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat 34800
tgatgatg 34808
<210> 7
<211> 34742
<212> DNA
<213> 重组人类腺病毒血清型5(Recombinant human adenovirus serotype 5)
<220>
<223> E1和E3位点缺失的重组人类腺病毒血清型5的母体序列
<400> 7
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt tgtgcgcgtt aatatgcaaa tgaggcgttt 60
gaatttgggg aggaagggcg gtgattggtc gagggatgag cgaccgttag gggcggggcg 120
agtgacgttt tgatgacgtg gttgcgagga ggagccagtt tgcaagttct cgtgggaaaa 180
gtgacgtcaa acgaggtgtg gtttgaacac ggaaatactc aattttcccg cgctctctga 240
caggaaatga ggtgtttctg ggcggatgca agtgaaaacg ggccattttc gcgcgaaaac 300
tgaatgagga agtgaaaatc tgagtaattt cgcgtttatg gcagggagga gtatttgccg 360
agggccgagt agactttgac cgattacgtg ggggtttcga ttaccgtgtt tttcacctaa 420
atttccgcgt acggtgtcaa agtccggtgt ttttacgtag gtgtcagctg atcgccaggg 480
tatttaaacc tgcgctctcc agtcaagagg ccactcttga gtgccagcga gaagagttgc 540
gatgcatgcg cgttgtcaaa tatgagctca caatgcttcc atcaaacgag ttggtgctca 600
tggcggcggc ggctgctgca aaacagatac aaaactacat aagaccccca ccttatatat 660
tctttcccac ccttaaccac gcccagatcc gcgttaagat acattgatga gtttggacaa 720
accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 780
ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt 840
atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa 900
tgtggtatgg ctgattatga tcagttatct agactcgagc ggccgcgata tcttatgtgt 960
aatgtaattt gactcctttg agcacgggct cagaatcgtc ctcgtcgaac ttgcagcagc 1020
tgccacagct acaacagccc ttcaggcagc tacagcagct ggtcatgcaa cacagcatga 1080
ttgtgaccat cacgatggca atcagtccgg cgataaagcc cagccagatg taccagggcc 1140
acttgatgta ctgctcgtac ttccccagtt cttgcaggtc gatcaggctc tcgttcagat 1200
tcttggccac ctcgttcagc cggtcgatct ctttctggat gttcacgacg ctggcattga 1260
ttccgctgat gtcgcccagg tccacgtcgg ggcttgtgtg gttcttaaag tacttatcca 1320
gttcctcttt gaagctgtcc agctcgggct gcagagggtc gtacacggta ttgttcacaa 1380
tgccgatcac gacgtcgcag ttgccagaca cgaaggtgtt gtcggtggtg atgatctggg 1440
gctcgtagaa gttccgctgg gtcacgaacc aatgggtgcc gttggacacg aacacgcctt 1500
ctctaggaaa gtgggctttg ccgtcgtggc agatggctgg agcggtggtg aaattcttct 1560
cttgagcggg cacgtatgtc acgtgcagaa acaccacgcc gtgaggggca gactgaggga 1620
agctcatcag gtggtagccc ttgccgcaaa agtccactct cttgctctgg cccagcacac 1680
actcagacat cttggtggcg gccagattgg cagaggctct aatctcggcg gctctgatca 1740
gctgctgggt aacgtaggtc tgcagggact gcagccttcc ggtgatcagt ctgtcgatct 1800
gcacctcggc ttccaccttg tccagtctgc tcaggatgtc gttcagcaca gagctgatgg 1860
cgccgaagtt ggaggacagc tgcttgacca gggtgttcag tgcctgggca ttctggttga 1920
ccacgtcctg cagctttccc agggcgcttg ctgtgctgct caggctgtcc tggatcttgc 1980
cgatggcgct gttgaactgg ttggcgatca gcttctggtt ctcgtacagc acattctggg 2040
tcactccgat gccgttgaac cggtaggcca tctgcatagc aaaggggatc tgcagagcgg 2100
cgccagctcc aaatgtccag ccgcttgtga ttgtgccggc cagcagggca gatgtgtact 2160
gggcgatcat ctcatcggtc agcagtggtg gcagcactgt cagtccgtta aacttctggg 2220
cgcaaatcag atccctggcg gcaatgtcgc ccagacaatc gccatactgc ttgatgaagc 2280
cggcgtcggc cagtgtcact ttgttgaaca gcaggtcctc gatgaagctc cgcttgctgg 2340
gcttgctagg atcgggcaga atctggctga aattgaagcc gccgaagtcc ttgataggag 2400
gggtcttgta gatctgcttc acttgggcga acacctcttg ggtgttcttg tcctgttcca 2460
cggcgatccc tgtcagggct ctattcagct gggtgcagaa gctgccgtac tgcagcagca 2520
ggttggagca ctcggtggaa tcgccgcaga tgtacatggt gcagtccacg ctggtcttgg 2580
tcatggacac aggcaggatc tctgtggtca cgctgatggt gaagttggtg gggatagcga 2640
tagagttgtt ggagtaggcc acgctgttct cggcgcccag agacattgtg taggcaatga 2700
tgctctggct ggccacagat ctggcccgtc tggggctgtt tgtctgtgtc tggtagctgg 2760
cacagatgcc agcgccgatg gggatgtcgc actcgtagct attgttcacg tgctcggctc 2820
cgatcagaca gccggctctg gtctgaaaca cattgctgcc ggtggagtac acccgccatg 2880
taggtgtcag ctgatcggcg tgaatggcca cgggcacttc ggtacagttc acgtcctggt 2940
acagcactgc cacctgattg ctggtgttgg tgccaggggt gatcacagac actccgccga 3000
agctgcaagg ggtgatgtcc aggatttcca gtgtctgggg atctcgtacg gcgtctgtgg 3060
tatcggcaat atcccggcca aactgctgga atggcaggaa cttcttgttg ctctctgtca 3120
gcacgccggt gccggtcagg ccgttgaagt tgaagttcac gcatttgttc ttcacgagat 3180
tggtgctttt cttagggccg cacactgtgg caggggcatg cagcagttcg aagctcagca 3240
ccaccactct gtagggctga tagcccacgc catttgtggg ctgaaagccg taggactgca 3300
gtgggaagta gcagttgaag ccttccacgc cgttacaagg ggtgctgccg gcctgataga 3360
tctcggtgga gatgtcccgc tcgaagggct tcagattgga cttccggaac agccggtaca 3420
ggtaattgta gttgccgccg actttggagt ccaggttgtt gctgttccag gcaatcacac 3480
agccggtgaa gtcgtcgggc agcttgtagt tgtagtcggc gatcttgcct gtctgtccag 3540
gggcaatctg ccgcacttca tctccccgga tcacgaagct gtcggcgtac acgtttgtga 3600
agcacaggtc gttcagcttg gtaggggaca cgccgtagca cttgaaggtg ctgaagctgg 3660
cggagttgta cagcacggag tagtcggcca cgcaattgct gatccgcttc cggttccagg 3720
cgtacacaga ggcgaatctg gtggcattga acacctcgcc gaaggggcac agattggtga 3780
tattggggaa ccgcacgatg gattcggtgg gctgcacccg gaagttgctg gtctggtaga 3840
tgcccttttc cacggtgaag gacttcaggg tgcactttgt ctcgctcaga ggatccagag 3900
cacaatccac ggcgtcggtg atggtgccgt tctcgttgta cttcagcagg aaggttctag 3960
gctgcaggta gcccacatag taagcggcgg caccagctgt ccatccgctg ctgctatcgc 4020
caggtgtcag gtagcttctg tgcagggcca gcagtgtctg aaaccgggtg atgttgatgc 4080
cgatgggcag atccaccagg ggttccagag cagagaagcc ctgaggcaga tcccgcacga 4140
ggttgatagg ggtgtgcttg ctgtagatct tgaagtagcc gtcgatgttc ttgaacacga 4200
actcgcgcag gttcttgaag ttgccctgct tgccttccag gtccatcagg aaaggctggg 4260
acacgtactc gaaggtgcag ttgttggcgc tgctgtacac ccggaactcg ctttccatcc 4320
agctcttgtt gttcttgtga tagtagacgc ccaggaaggg gtcgttgcag aactggaact 4380
cgcacacttt gatgaccacg ttggtggcgt tgttcacgat cagcaggctc tgggtcttgc 4440
tgtccagtgt ggtgccgaag atccagcctc tgatgatgtt ggacttctcg gtgctggcaa 4500
agtacacccc gtcgttgaag ggcagcacgg ggttgtcgaa tctcttggtg ccattggtgc 4560
cggacacgtg gatggcgtgg aaccaggtca cgttgctgaa gaaaggcagg aacaggtcct 4620
gggtagagtg cagcacgctg gatctgaaca ccttgtcggg gtagtacacg cctctggtaa 4680
agctgttggt gtaggctgga ggcagctggg ttcttgtggt caggttcaca cactgactag 4740
agactagtgg caataacaca aggaacacaa acatggtacc agatctctag cggatctgac 4800
ggttcactaa accagctctg cttatataga cctcccaccg tacacgccta ccgcccattt 4860
gcgtcaatgg ggcggagttg ttacgacatt ttggaaagtc ccgttgattt tggtgccaaa 4920
acaaactccc attgacgtca atggggtgga gacttggaaa tccccgtgag tcaaaccgct 4980
atccacgccc attgatgtac tgccaaaacc gcatcaccat ggtaatagcg atgactaata 5040
cgtagatgta ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca taatgccagg 5100
cgggccattt accgtcattg acgtcaatag ggggcgtact tggcatatga tacacttgat 5160
gtactgccaa gtgggcagtt taccgtaaat actccaccca ttgacgtcaa tggaaagtcc 5220
ctattggcgt tactatggga acatacgtca ttattgacgt caatgggcgg gggtcgttgg 5280
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tatgaactaa tgaccccgta attgattact attacagtat tacgcgctat gagtaacaca 5400
aaattattca gatttcactt cctcttattc agttttcccg cgaaaatggc caaatcttac 5460
tcggttacgc ccaaatttac tacaacatcc gcctaaaacc gcgcgaaaat tgtcacttcc 5520
tgtgtacacc ggcgcgctga gtagtgttct ggggcggggg aggacctgca tgagggccag 5580
aataactgaa atctgtgctt ttctgtgtgt tgcagcagca tgagcggaag cggctccttt 5640
gagggagggg tattcagccc ttatctgacg gggcgtctcc cctcctgggc gggagtgcgt 5700
cagaatgtga tgggatccac ggtggacggc cggcccgtgc agcccgcgaa ctcttcaacc 5760
ctgacctatg caaccctgag ctcttcgtcg ttggacgcag ctgccgccgc agctgctgca 5820
tctgccgcca gcgccgtgcg cggaatggcc atgggcgccg gctactacgg cactctggtg 5880
gccaactcga gttccaccaa taatcccgcc agcctgaacg aggagaagct gttgctgctg 5940
atggcccagc tcgaggcctt gacccagcgc ctgggcgagc tgacccagca ggtggctcag 6000
ctgcaggagc agacgcgggc cgcggttgcc acggtgaaat ccaaataaaa aatgaatcaa 6060
taaataaacg gagacggttg ttgattttaa cacagagtct gaatctttat ttgatttttc 6120
gcgcgcggta ggccctggac caccggtctc gatcattgag cacccggtgg atcttttcca 6180
ggacccggta gaggtgggct tggatgttga ggtacatggg catgagcccg tcccgggggt 6240
ggaggtagct ccattgcagg gcctcgtgct cgggggtggt gttgtaaatc acccagtcat 6300
agcaggggcg cagggcatgg tgttgcacaa tatctttgag gaggagactg atggccacgg 6360
gcagcccttt ggtgtaggtg tttacaaatc tgttgagctg ggagggatgc atgcgggggg 6420
agatgaggtg catcttggcc tggatcttga gattggcgat gttaccgccc agatcccgcc 6480
tggggttcat gttgtgcagg accaccagca cggtgtatcc ggtgcacttg gggaatttat 6540
catgcaactt ggaagggaag gcgtgaaaga atttggcgac gcctttgtgc ccgcccaggt 6600
tttccatgca ctcatccatg atgatggcga tgggcccgtg ggcggcggcc tgggcaaaga 6660
cgtttcgggg gtcggacaca tcatagttgt ggtcctgggt gaggtcatca taggccattt 6720
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cgtagttccc ctcacagatc tgcatctccc aggctttgag ctcggagggg gggatcatgt 6840
ccacctgcgg ggcgataaag aacacggttt ccggggcggg ggagatgagc tgggccgaaa 6900
gcaagttccg gagcagctgg gacttgccgc agccggtggg gccgtagatg accccgatga 6960
ccggctgcag gtggtagttg agggagagac agctgccgtc ctcccggagg aggggggcca 7020
cctcgttcat catctcgcgc acgtgcatgt tctcgcgcac cagttccgcc aggaggcgct 7080
ctccccccag ggataggagc tcctggagcg aggcgaagtt tttcagcggc ttgagtccgt 7140
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tcgcagcgtc cgcgtcaggg tggtctccgt cacggtgaag gggtgcgcgc cgggctgggc 7380
gcttgcgagg gtgcgcttca ggctcatccg gctggtcgaa aaccgctccc gatcggcgcc 7440
ctgcgcgtcg gccaggtagc aattgaccat gagttcgtag ttgagcgcct cggccgcgtg 7500
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ctcgagcggt gtgccgcggt cctcctcgta gaggaacccc gcccactccg agacgaaagc 7860
ccgggtccag gccagcacga aggaggccac gtgggacggg tagcggtcgt tgtccaccag 7920
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gattggcttg taagtgtagg ccacgtgacc gggggtcccg gccggggggg tataaaaggg 8040
tgcgggtccc tgctcgtcct cactgtcttc cggatcgctg tccaggagcg ccagctgttg 8100
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catctggtca gaaaagacga tctttttgtt gtcgagcttg gtggcgaagg agccgtagag 8280
ggcgttggag aggagcttgg cgatggagcg catggtctgg tttttttcct tgtcggcgcg 8340
ctccttggcg gcgatgttga gctgcacgta ctcgcgcgcc acgcacttcc attcggggaa 8400
gacggtggtc agctcgtcgg gcacgattct gacctgccag ccccgattat gcagggtgat 8460
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atcgatggtg aagatgccgg gcaggaggtc ggggtcaaag tagctgatgg aagtggccag 8640
atcgtccagg gcagcttgcc attcgcgcac ggccagcgcg cgctcgtagg gactgagggg 8700
cgtgccccag ggcatgggat gggtaagcgc ggaggcgtac atgccgcaga tgtcgtagac 8760
gtagaggggc tcctcgagga tgccgatgta ggtggggtag cagcgccccc cgcggatgct 8820
ggcgcgcacg tagtcataca gctcgtgcga gggggcgagg agccccgggc ccaggttggt 8880
gcgactgggc ttttcggcgc ggtagacgat ctggcggaaa atggcatgcg agttggagga 8940
gatggtgggc ctttggaaga tgttgaagtg ggcgtggggc agtccgaccg agtcgcggat 9000
gaagtgggcg taggagtctt gcagcttggc gacgagctcg gcggtgacta ggacgtccag 9060
agcgcagtag tcgagggtct cctggatgat gtcatacttg agctgtccct tttgtttcca 9120
cagctcgcgg ttgagaagga actcttcgcg gtccttccag tactcttcga gggggaaccc 9180
gtcctgatct gcacggtaag agcctagcat gtagaactgg ttgacggcct tgtaggcgca 9240
gcagcccttc tccacgggga gggcgtaggc ctgggcggcc ttgcgcaggg aggtgtgcgt 9300
gagggcgaaa gtgtccctga ccatgacctt gaggaactgg tgcttgaagt cgatatcgtc 9360
gcagcccccc tgctcccaga gctggaagtc cgtgcgcttc ttgtaggcgg ggttgggcaa 9420
agcgaaagta acatcgttga agaggatctt gcccgcgcgg ggcataaagt tgcgagtgat 9480
gcggaaaggt tggggcacct cggcccggtt gttgatgacc tgggcggcga gcacgatctc 9540
gtcgaagccg ttgatgttgt ggcccacgat gtagagttcc acgaatcgcg gacggccctt 9600
gacgtggggc agtttcttga gctcctcgta ggtgagctcg tcggggtcgc tgagcccgtg 9660
ctgctcgagc gcccagtcgg cgagatgggg gttggcgcgg aggaaggaag tccagagatc 9720
cacggccagg gcggtttgca gacggtcccg gtactgacgg aactgctgcc cgacggccat 9780
tttttcgggg gtgacgcagt agaaggtgcg ggggtccccg tgccagcgat cccatttgag 9840
ctggagggcg agatcgaggg cgagctcgac gagccggtcg tccccggaga gtttcatgac 9900
cagcatgaag gggacgagct gcttgccgaa ggaccccatc caggtgtagg tttccacatc 9960
gtaggtgagg aagagccttt cggtgcgagg atgcgagccg atggggaaga actggatctc 10020
ctgccaccaa ttggaggaat ggctgttgat gtgatggaag tagaaatgcc gacggcgcgc 10080
cgaacactcg tgcttgtgtt tatacaagcg gccacagtgc tcgcaacgct gcacgggatg 10140
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atctaccagt tcgagtacga gggcctgctg cgccgcagcg ccctggccac cgaggaccgc 23580
tgcgtcaccc tggaaaagtc cacccagacc gtgcagggtc cgcgctcggc cgcctgcggg 23640
ctcttctgct gcatgttcct gcacgccttc gtgcactggc ccgaccgccc catggacaag 23700
aaccccacca tgaacttgct gacgggggtg cccaacggca tgctccagtc gccccaggtg 23760
gaacccaccc tgcgccgcaa ccaggaggcg ctctaccgct tcctcaactc ccactccgcc 23820
tactttcgct cccaccgcgc gcgcatcgag aaggccaccg ccttcgaccg catgaatcaa 23880
gacatgtaaa ccgtgtgtgt atgttaaatg tctttaataa acagcacttt catgttacac 23940
atgcatctga gatgatttat ttagaaatcg aaagggttct gccgggtctc ggcatggccc 24000
gcgggcaggg acacgttgcg gaactggtac ttggccagcc acttgaactc ggggatcagc 24060
agtttgggca gcggggtgtc ggggaaggag tcggtccaca gcttccgcgt cagttgcagg 24120
gcgcccagca ggtcgggcgc ggagatcttg aaatcgcagt tgggacccgc gttctgcgcg 24180
cgggagttgc ggtacacggg gttgcagcac tggaacacca tcagggccgg gtgcttcacg 24240
ctcgccagca ccgtcgcgtc ggtgatgctc tccacgtcga ggtcctcggc gttggccatc 24300
ccgaaggggg tcatcttgca ggtctgcctt cccatggtgg gcacgcaccc gggcttgtgg 24360
ttgcaatcgc agtgcagggg gatcagcatc atctgggcct ggtcggcgtt catccccggg 24420
tacatggcct tcatgaaagc ctccaattgc ctgaacgcct gctgggcctt ggctccctcg 24480
gtgaagaaga ccccgcagga cttgctagag aactggttgg tggcgcaccc ggcgtcgtgc 24540
acgcagcagc gcgcgtcgtt gttggccagc tgcaccacgc tgcgccccca gcggttctgg 24600
gtgatcttgg cccggtcggg gttctccttc agcgcgcgct gcccgttctc gctcgccaca 24660
tccatctcga tcatgtgctc cttctggatc atggtggtcc cgtgcaggca ccgcagcttg 24720
ccctcggcct cggtgcaccc gtgcagccac agcgcgcacc cggtgcactc ccagttcttg 24780
tgggcgatct gggaatgcgc gtgcacgaag ccctgcagga agcggcccat catggtggtc 24840
agggtcttgt tgctagtgaa ggtcagcgga atgccgcggt gctcctcgtt gatgtacagg 24900
tggcagatgc ggcggtacac ctcgccctgc tcgggcatca gctggaagtt ggctttcagg 24960
tcggtctcca cgcggtagcg gtccatcagc atagtcatga tttccatacc cttctcccag 25020
gccgagacga tgggcaggct catagggttc ttcaccatca tcttagcgct agcagccgcg 25080
gccagggggt cgctctcgtc cagggtctca aagctccgct tgccgtcctt ctcggtgatc 25140
cgcaccgggg ggtagctgaa gcccacggcc gccagctcct cctcggcctg tctttcgtcc 25200
tcgctgtcct ggctgacgtc ctgcaggacc acatgcttgg tcttgcgggg tttcttcttg 25260
ggcggcagcg gcggcggaga tgttggagat ggcgaggggg agcgcgagtt ctcgctcacc 25320
actactatct cttcctcttc ttggtccgag gccacgcggc ggtaggtatg tctcttcggg 25380
ggcagaggcg gaggcgacgg gctctcgccg ccgcgacttg gcggatggct ggcagagccc 25440
cttccgcgtt cgggggtgcg ctcccggcgg cgctctgact gacttcctcc gcggccggcc 25500
attgtgttct cctagggagg aacaacaagc atggagactc agccatcgcc aacctcgcca 25560
tctgccccca ccgccgacga gaagcagcag cagcagaatg aaagcttaac cgccccgccg 25620
cccagccccg ccacctccga cgcggccgtc ccagacatgc aagagatgga ggaatccatc 25680
gagattgacc tgggctatgt gacgcccgcg gagcacgagg aggagctggc agtgcgcttt 25740
tcacaagaag agatacacca agaacagcca gagcaggaag cagagaatga gcagagtcag 25800
gctgggctcg agcatgacgg cgactacctc cacctgagcg ggggggagga cgcgctcatc 25860
aagcatctgg cccggcaggc caccatcgtc aaggatgcgc tgctcgaccg caccgaggtg 25920
cccctcagcg tggaggagct cagccgcgcc tacgagttga acctcttctc gccgcgcgtg 25980
ccccccaagc gccagcccaa tggcacctgc gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccg 26040
gtcttcgcgg tgcccgaggc cctggccacc taccacatct ttttcaagaa ccaaaagatc 26100
cccgtctcct gccgcgccaa ccgcacccgc gccgacgccc ttttcaacct gggtcccggc 26160
gcccgcctac ctgatatcgc ctccttggaa gaggttccca agatcttcga gggtctgggc 26220
agcgacgaga ctcgggccgc gaacgctctg caaggagaag gaggagagca tgagcaccac 26280
agcgccctgg tcgagttgga aggcgacaac gcgcggctgg cggtgctcaa acgcacggtc 26340
gagctgaccc atttcgccta cccggctctg aacctgcccc ccaaagtcat gagcgcggtc 26400
atggaccagg tgctcatcaa gcgcgcgtcg cccatctccg aggacgaggg catgcaagac 26460
tccgaggagg gcaagcccgt ggtcagcgac gagcagctgg cccggtggct gggtcctaat 26520
gctagtcccc agagtttgga agagcggcgc aaactcatga tggccgtggt cctggtgacc 26580
gtggagctgg agtgcctgcg ccgcttcttc gccgacgcgg agaccctgcg caaggtcgag 26640
gagaacctgc actacctctt caggcacggg ttcgtgcgcc aggcctgcaa gatctccaac 26700
gtggagctga ccaacctggt ctcctacatg ggcatcttgc acgagaaccg cctggggcag 26760
aacgtgctgc acaccaccct gcgcggggag gcccggcgcg actacatccg cgactgcgtc 26820
tacctctacc tctgccacac ctggcagacg ggcatgggcg tgtggcagca gtgtctggag 26880
gagcagaacc tgaaagagct ctgcaagctc ctgcagaaga acctcaaggg tctgtggacc 26940
gggttcgacg agcgcaccac cgcctcggac ctggccgacc tcattttccc cgagcgcctc 27000
aggctgacgc tgcgcaacgg cctgcccgac tttatgagcc aaagcatgtt gcaaaacttt 27060
cgctctttca tcctcgaacg ctccggaatc ctgcccgcca cctgctccgc gctgccctcg 27120
gacttcgtgc cgctgacctt ccgcgagtgc cccccgccgc tgtggagcca ctgctacctg 27180
ctgcgcctgg ccaactacct ggcctaccac tcggacgtga tcgaggacgt cagcggcgag 27240
ggcctgctcg agtgccactg ccgctgcaac ctctgcacgc cgcaccgctc cctggcctgc 27300
aacccccagc tgctgagcga gacccagatc atcggcacct tcgagttgca agggcccagc 27360
gaaggcgagg gttcagccgc caaggggggt ctgaaactca ccccggggct gtggacctcg 27420
gcctacttgc gcaagttcgt gcccgaggac taccatccct tcgagatcag gttctacgag 27480
gaccaatccc atccgcccaa ggccgagctg tcggcctgcg tcatcaccca gggggcgatc 27540
ctggcccaat tgcaagccat ccagaaatcc cgccaagaat tcttgctgaa aaagggccgc 27600
ggggtctacc tcgaccccca gaccggtgag gagctcaacc ccggcttccc ccaggatgcc 27660
ccgaggaaac aagaagctga aagtggagct gccgcccgtg gaggatttgg aggaagactg 27720
ggagaacagc agtcaggcag aggaggagga gatggaggaa gactgggaca gcactcaggc 27780
agaggaggac agcctgcaag acagtctgga ggaagacgag gaggaggcag aggaggaggt 27840
ggaagaagca gccgccgcca gaccgtcgtc ctcggcgggg gagaaagcaa gcagcacgga 27900
taccatctcc gctccgggtc ggggtcccgc tcgaccacac agtagatggg acgagaccgg 27960
acgattcccg aaccccacca cccagaccgg taagaaggag cggcagggat acaagtcctg 28020
gcgggggcac aaaaacgcca tcgtctcctg cttgcaggcc tgcgggggca acatctcctt 28080
cacccggcgc tacctgctct tccaccgcgg ggtgaacttt ccccgcaaca tcttgcatta 28140
ctaccgtcac ctccacagcc cctactactt ccaagaagag gcagcagcag cagaaaaaga 28200
ccagcagaaa accagcagct agaaaatcca cagcggcggc agcaggtgga ctgaggatcg 28260
cggcgaacga gccggcgcaa acccgggagc tgaggaaccg gatctttccc accctctatg 28320
ccatcttcca gcagagtcgg gggcaggagc aggaactgaa agtcaagaac cgttctctgc 28380
gctcgctcac ccgcagttgt ctgtatcaca agagcgaaga ccaacttcag cgcactctcg 28440
aggacgccga ggctctcttc aacaagtact gcgcgctcac tcttaaagag tagcccgcgc 28500
ccgcccagtc gcagaaaaag gcgggaatta cgtcacctgt gcccttcgcc ctagccgcct 28560
ccacccatca tcatgagcaa agagattccc acgccttaca tgtggagcta ccagccccag 28620
atgggcctgg ccgccggtgc cgcccaggac tactccaccc gcatgaattg gctcagcgcc 28680
gggcccgcga tgatctcacg ggtgaatgac atccgcgccc accgaaacca gatactccta 28740
gaacagtcag cgctcaccgc cacgccccgc aatcacctca atccgcgtaa ttggcccgcc 28800
gccctggtgt accaggaaat tccccagccc acgaccgtac tacttccgcg agacgcccag 28860
gccgaagtcc agctgactaa ctcaggtgtc cagctggcgg gcggcgccac cctgtgtcgt 28920
caccgccccg ctcagggtat aaagcggctg gtgatccggg gcagaggcac acagctcaac 28980
gacgaggtgg tgagctcttc gctgggtctg cgacctgacg gagtcttcca actcgccgga 29040
tcggggagat cttccttcac gcctcgtcag gccgtcctga ctttggagag ttcgtcctcg 29100
cagccccgct cgggtggcat cggcactctc cagttcgtgg aggagttcac tccctcggtc 29160
tacttcaacc ccttctccgg ctcccccggc cactacccgg acgagttcat cccgaacttc 29220
gacgccatca gcgagtcggt ggacggctac gattgaatgt cccatgtcga cccccggtcc 29280
cccacccagt cccccgagga ggtccgcaaa tgcaaattcc aagaaccctg gaaattcctc 29340
aaatgctacc gccaaaaatc agacatgcat cccagctgga tcatgatcat tgggatcgtg 29400
aacattctgg cctgcaccct catctccttt gtgatttacc cctgctttga ctttggttgg 29460
aactcgccag aggcgctcta tctcccgcct gaacctgaca caccaccaca gcaacctcag 29520
gcacacgcac taccaccact acagcctagg ccacaataca tgcccatatt agactatgag 29580
gccgagccac agcgacccat gctccccgct attagttact tcaatctaac cggcggagat 29640
gactgaccca ctggccaaca acaacgtcaa cgaccttctc ctggacatgg acggccgcgc 29700
ctcggagcag cgactcgccc aacttcgcat tcgccagcag caggagagag ccgtcaagga 29760
gctgcaggat gcggtggcca tccaccagtg caagagaggc atcttctgcc tggtgaaaca 29820
ggccaagatc tcctacgagg tcactccaaa cgaccatcgc ctctcctacg agctcctgca 29880
gcagcgccag aagttcacct gcctggtcgg agtcaacccc atcgtcatca cccagcagtc 29940
tggcgatacc aaggggtgca tccactgctc ctgcgactcc cccgactgcg tccacactct 30000
gatcaagacc ctctgcggcc tccgcgacct cctccccatg aactaatcac ccccttatcc 30060
agtgaaataa agatcatatt gatgatgatt ttacagaaat aaaaaataat catttgattt 30120
gaaataaaga tacaatcata ttgatgattt gagtttaaca aaaaaataaa gaatcactta 30180
cttgaaatct gataccaggt ctctgtccat gttttctgcc aacaccactt cactcccctc 30240
ttcccagctc tggtactgca ggccccggcg ggctgcaaac ttcctccaca cgctgaaggg 30300
gatgtcaaat tcctcctgtc cctcaatctt cattttatct tctatcagat gtccaaaaag 30360
cgcgtccggg tggatgatga cttcgacccc gtctacccct acgatgcaga caacgcaccg 30420
accgtgccct tcatcaaccc ccccttcgtc tcttcagatg gattccaaga gaagcccctg 30480
ggggtgttgt ccctgcgact ggccgacccc gtcaccacca agaacgggga aatcaccctc 30540
aagctgggag agggggtgga cctcgattcc tcgggaaaac tcatctccaa cacggccacc 30600
aaggccgccg cccctctcag tttttccaac aacaccattt cccttaacat ggatcacccc 30660
ttttacacta aagatggaaa attatcctta caagtttctc caccattaaa tatactgaga 30720
acaagcattc taaacacact agctttaggt tttggatcag gtttaggact ccgtggctct 30780
gccttggcag tacagttagt ctctccactt acatttgata ctgatggaaa cataaagctt 30840
accttagaca gaggtttgca tgttacaaca ggagatgcaa ttgaaagcaa cataagctgg 30900
gctaaaggtt taaaatttga agatggagcc atagcaacca acattggaaa tgggttagag 30960
tttggaagca gtagtacaga aacaggtgtt gatgatgctt acccaatcca agttaaactt 31020
ggatctggcc ttagctttga cagtacagga gccataatgg ctggtaacaa agaagacgat 31080
aaactcactt tgtggacaac acctgatcca tcaccaaact gtcaaatact cgcagaaaat 31140
gatgcaaaac taacactttg cttgactaaa tgtggtagtc aaatactggc cactgtgtca 31200
gtcttagttg taggaagtgg aaacctaaac cccattactg gcaccgtaag cagtgctcag 31260
gtgtttctac gttttgatgc aaacggtgtt cttttaacag aacattctac actaaaaaaa 31320
tactgggggt ataggcaggg agatagcata gatggcactc catataccaa tgctgtagga 31380
ttcatgccca atttaaaagc ttatccaaag tcacaaagtt ctactactaa aaataatata 31440
gtagggcaag tatacatgaa tggagatgtt tcaaaaccta tgcttctcac tataaccctc 31500
aatggtactg atgacagcaa cagtacatat tcaatgtcat tttcatacac ctggactaat 31560
ggaagctatg ttggagcaac atttggggct aactcttata ccttctcata catcgcccaa 31620
gaatgaacac tgtatcccac cctgcatgcc aacccttccc accccactct gtggaacaaa 31680
ctctgaaaca caaaataaaa taaagttcaa gtgttttatt gattcaacag ttttacagga 31740
ttcgagcagt tatttttcct ccaccctccc aggacatgga atacaccacc ctctcccccc 31800
gcacagcctt gaacatctga atgccattgg tgatggacat gcttttggtc tccacgttcc 31860
acacagtttc agagcgagcc agtctcgggt cggtcaggga gatgaaaccc tccgggcact 31920
cccgcatctg cacctcacag ctcaacagct gaggattgtc ctcggtggtc gggatcacgg 31980
ttatctggaa gaagcagaag agcggcggtg ggaatcatag tccgcgaacg ggatcggccg 32040
gtggtgtcgc atcaggcccc gcagcagtcg ctgccgccgc cgctccgtca agctgctgct 32100
cagggggtcc gggtccaggg actccctcag catgatgccc acggccctca gcatcagtcg 32160
tctggtgcgg cgggcgcagc agcgcatgcg gatctcgctc aggtcgctgc agtacgtgca 32220
acacagaacc accaggttgt tcaacagtcc atagttcaac acgctccagc cgaaactcat 32280
cgcgggaagg atgctaccca cgtggccgtc gtaccagatc ctcaggtaaa tcaagtggtg 32340
ccccctccag aacacgctgc ccacgtacat gatctccttg ggcatgtggc ggttcaccac 32400
ctcccggtac cacatcaccc tctggttgaa catgcagccc cggatgatcc tgcggaacca 32460
cagggccagc accgccccgc ccgccatgca gcgaagagac cccgggtccc ggcaatggca 32520
atggaggacc caccgctcgt acccgtggat catctgggag ctgaacaagt ctatgttggc 32580
acagcacagg catatgctca tgcatctctt cagcactctc aactcctcgg gggtcaaaac 32640
catatcccag ggcacgggga actcttgcag gacagcgaac cccgcagaac agggcaatcc 32700
tcgcacagaa cttacattgt gcatggacag ggtatcgcaa tcaggcagca ccgggtgatc 32760
ctccaccaga gaagcgcggg tctcggtctc ctcacagcgt ggtaaggggg ccggccgata 32820
cgggtgatgg cgggacgcgg ctgatcgtgt tcgcgaccgt gtcatgatgc agttgctttc 32880
ggacattttc gtacttgctg tagcagaacc tggtccgggc gctgcacacc gatcgccggc 32940
ggcggtctcg gcgcttggaa cgctcggtgt tgaaattgta aaacagccac tctctcagac 33000
cgtgcagcag atctagggcc tcaggagtga tgaagatccc atcatgcctg atggctctga 33060
tcacatcgac caccgtggaa tgggccagac ccagccagat gatgcaattt tgttgggttt 33120
cggtgacggc gggggaggga agaacaggaa gaaccatgat taacttttaa tccaaacggt 33180
ctcggagtac ttcaaaatga agatcgcgga gatggcacct ctcgcccccg ctgtgttggt 33240
ggaaaataac agccaggtca aaggtgatac ggttctcgag atgttccacg gtggcttcca 33300
gcaaagcctc cacgcgcaca tccagaaaca agacaatagc gaaagcggga gggttctcta 33360
attcctcaat catcatgtta cactcctgca ccatccccag ataattttca tttttccagc 33420
cttgaatgat tcgaactagt tcgtgaggta aatccaagcc agccatgata aagagctcgc 33480
gcagagcgcc ctccaccggc attcttaagc acaccctcat aattccaaga tattctgctc 33540
ctggttcacc tgcagcagat tgacaagcgg aatatcaaaa tctctgccgc gatccctgag 33600
ctcctccctc agcaataact gtaagtactc tttcatatcc tctccgaaat ttttagccat 33660
aggaccacca ggaataagat tagggcaagc cacagtacag ataaaccgaa gtcctcccca 33720
gtgagcattg ccaaatgcaa gactgctata agcatgctgg ctagacccgg tgatatcttc 33780
cagataactg gacagaaaat cgcccaggca atttttaaga aaatcaacaa aagaaaaatc 33840
ctccaggtgg acgtttagag cctcgggaac aacgatgaag taaatgcaag cggtgcgttc 33900
cagcatggtt agttagctga tctgtagaaa aaacaaaaat gaacattaaa ccatgctagc 33960
ctggcgaaca ggtgggtaaa tcgttctctc cagcaccagg caggccacgg ggtctccggc 34020
gcgaccctcg taaaaattgt cgctatgatt gaaaaccatc acagagagac gttcccggtg 34080
gccggcgtga atgattcgac aagatgaata cacccccgga acattggcgt ccgcgagtga 34140
aaaaaagcgc ccgaggaagc aataaggcac tacaatgctc agtaaataaa tctcaagtcc 34200
agcaaagcga tgccatgcgg atgaagcaca aaattctcag gtgcgtacaa aatgtaatta 34260
ctcccctcct gcacaggcag caaagccccc gatccctcca ggtacacata caaagcctca 34320
gcgtccatag cttaccgagc agcagcacac aacaggcgca agagtcagag aaaggctgag 34380
ctctaacctg tccacccgct ctctgctcaa tatatagccc agatctacac tgacgtaaag 34440
gccaaagtct aaaaataccc gccaaataat cacacacgcc cagcacacgc ccagaaaccg 34500
gtgacacact caaaaaaata cgcgcacttc ctcaaacgcc caaaactgcc gtcatttccg 34560
ggttcccacg ctacgtcatc aaaacacgac tttcaaattc cgtcgaccgt taaaaacgtc 34620
acccgccccg cccctaacgg tcgcccgtct ctcagccaat cagcgccccg catccccaaa 34680
ttcaaacacc tcatttgcat attaacgcgc acaaaaagtt tgaggtatat tattgatgat 34740
gg 34742
Claims (7)
1.一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的表达盒；和/或含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的表达盒。
2.一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，并且位点ORF6-Ad26被ORF6-Ad5取代，其中整合了选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的表达盒；或者仅包含组分2。
3.一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失E1和E3位点，其中整合了选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3的表达盒。
4.根据权利要求1、2、3所述的用途，其中所述药剂为液体形式或冻干形式。
5.根据权利要求4所述的用途，其中用于所述液体形式的缓冲液以重量％计含有：
6.根据权利要求4所述的用途，其中重构的冻干药剂含有缓冲液，所述缓冲液以重量％计由以下构成：
7.根据权利要求1、2、3所述的用途，其中所述药剂的组分1和组分2在单独的容器中。
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2022
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