CN115418388A - 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法 - Google Patents

一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115418388A
CN115418388A CN202211239925.2A CN202211239925A CN115418388A CN 115418388 A CN115418388 A CN 115418388A CN 202211239925 A CN202211239925 A CN 202211239925A CN 115418388 A CN115418388 A CN 115418388A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
fungi
minimum inhibitory
perillaldehyde
spores
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211239925.2A
Other languages
English (en)
Inventor
都立辉
仝文君
张玉申
陈晓璐
刘兵
方勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Finance and Economics
Original Assignee
Nanjing University of Finance and Economics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Finance and Economics filed Critical Nanjing University of Finance and Economics
Priority to CN202211239925.2A priority Critical patent/CN115418388A/zh
Publication of CN115418388A publication Critical patent/CN115418388A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/67—Aspergillus flavus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium
    • C12R2001/82—Penicillium chrysogenum

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本技术公开了一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度（MIC）的测定方法。所述改进方法为使用倒置显微镜在微观水平上观察孢子的萌发状态，从而判定真菌的最小抑菌浓度。所述方法可以避免肉眼观察是否生成沉淀的主观判断，还可以防止某些真菌因生长缓慢在24h后未形成可见沉淀，无法判断最小抑菌浓度的缺陷；所述方法可以解决以OD值判断真菌生长情况和确定最小抑菌浓度不准确的难题，更好的避免抑菌剂本身颜色所带来的OD值影响，拓宽二倍稀释法的应用背景，更好的适应真菌MIC的测定。

Description

一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法。
背景技术：
二倍稀释法是药敏试验的“金标准”。然而，该标准更多的是针对细菌建立的，对真菌最小抑菌浓度的测定有些不适用。细菌生长繁殖快，达到稳定期的时间普遍在1～10h内。在液体培养基中，5×105CFU/mL的初始接种量，在培养24h后可达到约107-109CFU/mL，达到足够沉淀可见的密度，易于观察到生长，方便通过吸光度值检测确定生长与否。而真菌则不同，尤其是丝状真菌，其生长缓慢，稳定期普遍在24h后，24h内很难形成肉眼可见的沉淀，这给真菌最小抑菌浓度的判定带来困难。因此，寻找并改进丝状真菌最小抑菌浓度的判定方法，对于真菌最小抑菌浓度的判定具有重要意义。
发明内容：
本发明所要解决的问题是针对现有终点判定方法的不足，提供一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法。
本发明的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，所述的测定方法是将菌悬液与不同浓度梯度的抑菌剂混合，在培养基中于适宜温度下培养后，通过观察孢子形态确定抑菌物质对真菌的最小抑菌浓度。
作为本发明的进一步改进，所述的测定方法步骤如下：
(1)在96孔板的每个孔中加入100μL PDB培养基，然后在三排板孔的第一孔中加入配好的抑菌剂100μL，接着用移液枪充分吹打使其混匀，再吸取其中的100μL加入到第二孔中，按照以上步骤重复至最后一孔，吸取100μL后弃去；
(2)在步骤(1)所述的每一孔中加入稀释好的真菌悬液100μL，形成了测定最小抑菌浓度值，即MIC值的三次重复实验；
(3)将步骤(2)中加入真菌悬液的孔板置于28℃恒温培养箱中，培养24h；
(4)将步骤(3)培养后的96孔板置于倒置显微镜下观察孢子形态，从而确定真菌最小抑菌浓度。
作为本发明的进一步改进，通过观察孢子形态判断真菌最小抑菌浓度的方法是：当抑菌剂浓度为0μL/mL或mg/mL时，受试菌的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状；加入抑菌剂后，当抑菌剂浓度恰好能够在24h内抑制受试真菌的孢子生长时，孢子会膨大，仅个别孢子会有芽管萌出，但芽管较短；当抑菌剂浓度可以完全抑制受试菌生长时，孢子形态不发生膨胀，仍保持孢子原始形状，无芽管出现。
作为本发明的进一步改进，在真菌悬液培养的同时进行对照实验，分别为空白对照即仅添加培养基而没有接种孢子悬液的实验组和阴性对照即仅添加不含抑菌剂的孢子悬液，进行培养和对比。
作为本发明的进一步改进，步骤(1)中抑菌剂包括紫苏醛和多杀菌素。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)的真菌悬液的浓度为106CFU/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中的真菌包括黄曲霉、产黄青霉和亮白曲霉。
通过观察孢子形态判断真菌最小抑菌浓度的判断依据在于：孢子萌发和抑菌效果之间存在对应联系，随着抑菌剂浓度的增大，孢子萌发的抑制率会逐渐升高：即孢子萌发的抑制率和抑菌剂呈浓度依赖效应。孢子的萌发可分为膨大、萌发芽管和芽管伸长这三个阶段。当抑菌剂浓度为0μL/mL或mg/mL时，受试菌的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状；加入抑菌剂后，当抑菌剂浓度恰好能够在24h内抑制受试真菌的孢子生长时，孢子会膨大，仅个别孢子会有芽管萌出，但芽管较短；当抑菌剂浓度可以完全抑制受试菌生长时，孢子形态不发生膨胀，仍保持孢子原始形状，无芽管出现。因此，可以根据孢子的形态来判定受试真菌的最小抑菌浓度。鉴于本技术原理，本技术对于通过孢子繁殖的原核生物如放线菌等也可以适用。
与现有终点判定方法相比，本发明具有如下优势：
1、本技术可以有效避免因真菌生长缓慢导致的24h时无法形成可见沉淀的难题；
2、本技术可以有效防止因抑菌剂本身对吸光度(OD)值影响，进而对真菌生长情况的误判；
3、本技术采用的倒置显微镜相较于肉眼观测更清晰、全面，也更准确；
4、本技术终点判定简单，容易实现。
附图说明：
图1是三种真菌在PDA平板上生长五天后的形态特征(a为黄曲霉，b为产黄青霉，c为亮白曲霉)；
图2不同浓度紫苏醛处理下黄曲霉孢子的形态观察；
图3不同浓度多杀菌素处理下黄曲霉孢子的形态观察；
图4不同浓度紫苏醛处理下产黄青霉孢子的形态观察；
图5不同浓度多杀菌素处理下产黄青霉孢子的形态观察；
图6不同浓度紫苏醛处理下亮白曲霉孢子的形态观察；
图7不同浓度多杀菌素处理下亮白曲霉孢子的形态观察；
图8不同浓度紫苏醛处理下玉米来源的黄曲霉孢子的形态观察；
图9不同浓度紫苏醛处理下大米来源的亮白曲霉孢子的形态观察；
图10不同浓度紫苏醛处理下大米来源的产黄青霉孢子的形态观察；
图11不同浓度紫苏醛处理下大米来源的蓝状菌A3菌株孢子的形态观察；
图12不同浓度紫苏醛处理下大米来源的马尼菲塔拉菌B3菌株孢子的形态观察；
图13不同浓度紫苏醛处理下大米来源的尖孢枝孢菌B4菌株孢子的形态观察；
图14不同浓度紫苏醛处理下大米来源的青霉菌C2菌株孢子的形态观察；
图15不同浓度紫苏醛处理下大米来源的青霉菌4菌株孢子的形态观察；
图16不同浓度紫苏醛处理下大米来源的青霉菌6菌株孢子的形态观察。
具体实施方式：
实施例1
一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，所述的测定方法步骤如下：
(1)在96孔板的每个孔中加入100μL PDB培养基，然后在三排板孔的第一孔中加入配好的紫苏醛抑菌剂100μL，接着用移液枪充分吹打使其混匀，再吸取其中的100μL加入到第二孔中，按照以上步骤重复至最后一孔，吸取100μL后弃去；
(2)在步骤(1)所述的每一孔中加入稀释好的黄曲霉孢子悬液100μL，形成了测定最小抑菌浓度值，即MIC值的三次重复实验；真菌悬液的浓度为106CFU/mL；
(3)将步骤(2)中加入黄曲霉孢子悬液的96孔板置于28℃恒温培养箱中，培养24h；
(4)将步骤(3)培养后的96孔板置于倒置显微镜下观察孢子形态，从而确定真菌最小抑菌浓度。
通过观察孢子形态判断真菌最小抑菌浓度的方法是：当紫苏醛浓度为0μL/mL或mg/mL时，黄曲霉菌孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状；加入紫苏醛后，当紫苏醛浓度恰好能够在24h内抑制黄曲霉菌的孢子生长时，孢子会膨大，呈圆球状，仅个别孢子会有芽管萌出，但芽管较短；当紫苏醛浓度可以完全抑制黄曲霉菌生长时，孢子形态不发生膨胀等变化，呈小球状，无芽管出现。
在黄曲霉菌悬液培养的同时进行对照实验，分别为空白对照即仅添加培养基而没有接种孢子悬液的处理组和阴性对照即仅添加不含紫苏醛的孢子悬液，进行培养和对比。
同时选择空白对照即仅添加培养基而没有接种孢子悬液的处理组和阴性对照实验即仅添加不含抑菌剂的孢子悬液，进行培养和对比。
如图2所示，图2(a)为不添加抑菌剂紫苏醛的对照组，可以看出受试真菌黄曲霉的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状。图2(b)紫苏醛浓度为0.03125μL/mL的处理组，可以看出孢子萌发不受抑制，芽管延长，交联致密；图2(c)紫苏醛浓度为0.0625μL/mL的处理组，孢子萌发正常，但芽管长度变短；图2(d)紫苏醛浓度为0.125μL/mL的处理组，孢子体积膨大，呈圆球状，少部分孢子萌发出较短的芽管；图2(e)和(f)紫苏醛浓度分别为0.25μL/mL和0.5μL/mL的处理组，孢子不再正常萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们不难看出紫苏醛浓度为0.03125和0.0625μL/mL时，紫苏醛未能抑制受试真菌的生长；而0.125μL/mL时，紫苏醛可以抑制受试菌的生长，且紫苏醛浓度大于0.125μL/mL时，紫苏醛可以完全抑制受试真菌的生长。
实施例2
与实施例1不同之处在于，选择多杀菌素作为抑菌剂，同时选择黄曲霉孢子悬液作为真菌悬液。
如图3所示，图3(a)为不添加抑菌剂多杀菌素的对照组，可以看出受试真菌黄曲霉的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状。图3(b)多杀菌素浓度为0.05mg/mL的处理组，可以看出孢子大部分正常萌发，芽管延长，小部分孢子体积膨大，尚未萌发芽管，菌丝交联疏松；图3(c)多杀菌素浓度为0.1mg/mL的处理组，大部分孢子体积膨大，呈圆球状，少部分孢子萌发出芽管；图3(d)多杀菌素浓度0.2mg/mL的处理组，孢子不再萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们可得出多杀菌素对黄曲霉的最小抑菌浓度为0.1mg/mL。
实施例3
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择产黄青霉孢子悬液作为真菌悬液。
如图4所示，图4(a)为不添加抑菌剂紫苏醛的对照组，可以看出受试真菌产黄青霉的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状。图4(b)紫苏醛浓度为0.03125μL/mL的处理组，可以看出孢子大部分正常萌发，芽管延长菌丝交联致密；图4(c)紫苏醛浓度为0.0625μL/mL的处理组，大部分孢子体积膨大，呈圆球状，少部分孢子萌发出芽管；图4(d)紫苏醛浓度0.125μL/mL的处理组，孢子不再萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们可得出紫苏醛对产黄青霉的最小抑菌浓度为0.0625μL/mL。
实施例4
与实施例1不同之处在于，选择多杀菌素作为抑菌剂，同时选择产黄青霉孢子悬液作为真菌悬液。
如图5所示，图5(a)和(b)分别为不添加抑菌剂多杀菌素的对照组和多杀菌素浓度为0.025mg/mL的处理组，受试真菌产黄青霉的孢子呈正常萌发，芽管延伸，成菌丝体状，相互缠结；图5(c)多杀菌素浓度为0.05mg/mL的处理组，一部分孢子体积膨大，呈圆球状，另一部分孢子不再萌发；图5(d)多杀菌素浓度0.1mg/mL的处理组，所有孢子不再萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们可得出多杀菌素对产黄青霉的最小抑菌浓度为0.05mg/mL。
实施例5
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择亮白曲霉孢子悬液作为真菌悬液。
如图6所示，图6(a)和(b)紫苏醛浓度分别为0和0.03125μL/mL，受试真菌亮白曲霉的孢子正常萌发，芽管延伸，生成较长的菌丝；图6(c)紫苏醛浓度0.0625μL/mL的处理组，孢子体积膨大，呈圆球状，极少部分孢子萌发较短的芽管；图6(d)紫苏醛浓度0.125μL/mL的处理组，孢子不再正常萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们可得出紫苏醛对亮白曲霉的最小抑菌浓度为0.0625μL/mL。
实施例6
与实施例1不同之处在于，选择多杀菌素作为抑菌剂，同时选择亮白曲霉孢子悬液作为真菌悬液。
如图7所示，图7(a)和(b)分别为不添加抑菌剂多杀菌素的对照组和多杀菌素浓度为0.0125mg/mL的处理组，受试真菌亮白曲霉的孢子呈正常萌发，芽管延伸，成菌丝体状，相互缠结；图7(c)多杀菌素浓度为0.025mg/mL的处理组，一部分孢子体积膨大，呈圆球状，另一部分孢子不再正常萌发；图7(d)多杀菌素浓度0.05mg/mL的处理组，所有孢子不再正常萌发，且孢子形态未发生变化。
由上图孢子形态的变化，我们可得出多杀菌素对亮白曲霉的最小抑菌浓度为0.025mg/mL。
实施例7
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择玉米中分离的黄曲霉孢子悬液作为真菌悬液。
由图8，可得出黄曲霉菌株的MIC为0.125μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL；e，紫苏醛浓度0.25μL/mL；f，紫苏醛浓度0.03125μL/mL。
实施例8
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的亮白曲霉孢子悬液作为真菌悬液。
由图9，可得出亮白曲霉菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例9
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的产黄青霉孢子悬液作为真菌悬液。
由图10，可得出产黄青霉菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例10
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的蓝状菌A3菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图11，可得出A3菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例11
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的马尼菲塔拉菌B3菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图12，可得出B3菌株的MIC为0.125μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL；e，紫苏醛浓度0.25μL/mL。
实施例12
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的尖孢枝孢菌B4菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图13，可得出B4菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例13
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的青霉菌C2菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图14，可得出C2菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例14
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的青霉菌4菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图15，可得出4菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
实施例15
与实施例1不同之处在于，选择紫苏醛作为抑菌剂，同时选择大米中分离的青霉菌6菌株孢子悬液作为真菌悬液。
由图16，可得出6菌株的MIC为0.0625μL/mL。图中：a，紫苏醛浓度0μL/mL；b，紫苏醛浓度0.03125μL/mL；c，紫苏醛浓度0.0625μL/mL；d，紫苏醛浓度0.125μL/mL。
综上可以看出，选择紫苏醛和多杀菌素两种抑菌剂，在倒置显微镜下观察各种真菌不同抑菌剂浓度处理下孢子形态的变化。根据孢子的形态变化，判定抑菌剂对真菌的最小抑菌浓度的终点判断技术相较于肉眼观测更清晰、全面，也更准确，操作简单，容易实现。
下面利用其它方法对本发明的方法进行结果验证：
1、利用琼脂平板法测定MIC对本发明的方法进行结果验证：
表1至表9为紫苏醛对不同霉菌六至七天菌落生长直径的影响。MIC为给定时间内能够抑制微生物生长的最小抑菌浓度。
表1不同浓度紫苏醛对黄曲霉菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000101
表2不同浓度紫苏醛对亮白曲霉菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000102
表3不同浓度紫苏醛对产黄青霉菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000103
Figure BDA0003881659730000111
表4不同浓度紫苏醛对A3菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000112
表5不同浓度紫苏醛对B3菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000113
表6不同浓度紫苏醛对B4菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000114
Figure BDA0003881659730000121
表7不同浓度紫苏醛对C2菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000122
表8不同浓度紫苏醛对4菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000123
表9不同浓度紫苏醛对6菌株菌落生长直径的影响
Figure BDA0003881659730000124
Figure BDA0003881659730000131
由表1，可得出黄曲霉菌株的MIC为0.2μL/mL；由表2，可得出亮白曲霉菌株的MIC为0.06μL/mL；由表3，可得出产黄青霉菌株的MIC为0.12μL/mL；由表4，可得出A3菌株的MIC为0.06μL/mL；由表5，可得出B3菌株的MIC为0.12μL/mL；由表6，可得出B4菌株的MIC为0.06μL/mL；由表7，可得出C2菌株的MIC为0.06μL/mL；由表8，可得出4菌株的MIC为0.12μL/mL；由表9，可得出6菌株的MIC为0.24μL/mL。
2、利用OD值测定MIC对本发明的方法进行结果验证：
以仅添加PDB培养基的孔为对照组，其24h后测定的OD600范围在0.048～0.054之间，以处理组OD值小于对照组的最小紫苏醛浓度为最小抑菌浓度。
表10不同菌种在不同紫苏醛浓度下培养24h后的OD600值
Figure BDA0003881659730000132
Figure BDA0003881659730000141
由表10，可得出黄曲霉菌株的MIC为0.5μL/mL；亮白曲霉菌株的MIC为0.5μL/mL；产黄青霉菌株的MIC为0.5μL/mL；A3菌株的MIC为0.125μL/mL；B3菌株的MIC为0.125μL/mL；B4菌株的MIC为0.5μL/mL；C2菌株的MIC为0.0625μL/mL；4菌株的MIC为0.25μL/mL；6菌株的MIC为0.125μL/mL。
3、三种方法测定MIC对比，结果如表11：
表11＝种MIC测定方法的测定结果对比
Figure BDA0003881659730000142
由表11，我们可以看出，改进的二倍稀释法测定的MIC多数情况下要小于另外两种方法测得的MIC，这正体现了本方法的灵敏性。

Claims (7)

1.一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，所述的测定方法是将菌悬液与不同浓度梯度的抑菌剂混合，在培养基中于适宜温度下培养后，通过观察孢子形态确定抑菌物质对真菌的最小抑菌浓度。
2.根据权利要求1所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，所述的测定方法步骤如下：
（1）在96孔板的每个孔中加入100 μL马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基，然后在三排板孔的第一孔中加入配好的抑菌剂100 μL，接着用移液枪充分吹打使其混匀，再吸取其中的100μL加入到第二孔中，按照以上步骤重复至最后一孔，吸取100 μL后弃去；
（2）在步骤（1）所述的每一孔中加入稀释好的真菌悬液100 μL，形成了测定最小抑菌浓度值，即MIC值的三次重复实验；
（3）将步骤（2）中加入真菌悬液的平板置于28 ℃恒温培养箱中，培养 24 h；
（4）将步骤（3）培养后的96孔板置于倒置显微镜下观察孢子形态，从而确定真菌最小抑菌浓度。
3.根据权利要求1或2所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，通过观察孢子形态判断真菌最小抑菌浓度的方法是：当抑菌剂浓度为0 μL/mL或mg/mL时，受试菌的孢子正常萌发，芽管延伸，基本生长成菌丝体状；加入抑菌剂后，当抑菌剂浓度恰好能够在24h内抑制受试真菌的孢子生长时，孢子会膨大，仅个别孢子会有芽管萌出，但芽管较短；当抑菌剂浓度可以完全抑制受试菌生长时，孢子形态不发生膨胀，仍保持孢子原始形状，无芽管出现。
4.根据权利要求2所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，在真菌悬液培养的同时进行对照实验，分别为空白对照即仅添加培养基而没有接种孢子悬液的处理组和阴性对照即仅添加不含抑菌剂的孢子悬液，进行培养和对比。
5.根据权利要求2所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，步骤（1）中的抑菌剂包括紫苏醛和多杀菌素。
6.根据权利要求2所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，步骤（2）的真菌悬液的浓度为 106 CFU/mL。
7.根据权利要求2所述的一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法，其特征在于，步骤（2）中的真菌包括黄曲霉、产黄青霉和亮白曲霉。
CN202211239925.2A 2022-10-10 2022-10-10 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法 Pending CN115418388A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211239925.2A CN115418388A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211239925.2A CN115418388A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115418388A true CN115418388A (zh) 2022-12-02

Family

ID=84206957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211239925.2A Pending CN115418388A (zh) 2022-10-10 2022-10-10 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115418388A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116491511A (zh) * 2023-06-26 2023-07-28 成都新朝阳作物科学股份有限公司 一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116491511A (zh) * 2023-06-26 2023-07-28 成都新朝阳作物科学股份有限公司 一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用
CN116491511B (zh) * 2023-06-26 2023-09-26 成都新朝阳作物科学股份有限公司 一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Olivain et al. Colonization of tomato root by a non-pathogenic strain of Fusarium oxysporum
Olivain et al. Process of tomato root colonization by a pathogenic strain of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in comparison with a non-pathogenic strain
Bao et al. Differential colonization of tomato roots by nonpathogenic and pathogenic Fusarium oxysporum strains may influence Fusarium wilt control
Bhagobaty et al. Enzymatic activity of fungi endophytic on five medicinal plant species of the pristine sacred forests of Meghalaya, India
Seneviratne et al. Mycelial colonization by bradyrhizobia and azorhizobia
CN101597573B (zh) 一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌
CN115418388A (zh) 一种改进二倍稀释法测定真菌最小抑菌浓度的方法
Lü et al. Colonization of fusarium wilt‐resistant and susceptible watermelon roots by a green‐fluorescent‐protein‐tagged isolate of Fusarium oxysporum f. sp. niveum
Broadbent et al. Association of bacteria with sporangium formation and breakdown of sporangia in Phytophthora spp
Al-Hatmi et al. Fusarium volatile, a new potential pathogen from a human respiratory sample
CN110684695A (zh) 一株多黏类芽孢杆菌qzy-1及其应用
CN112592856A (zh) 一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用
CN108911452B (zh) 一种利用草酸青霉改善柠檬酸废水污泥脱水性能的方法
Han et al. Host effect on genetic variation of Marssonina brunnea pathogenic to poplars
Jia A user-friendly method to isolate and single spore the fungi Magnaporthe oryzae and Magnaporthe grisea obtained from diseased field samples
Alabouvette et al. Using strains of Fusarium oxysporum to control Fusarium wilts: dream or reality?
Medina et al. Comparison of different culture media on the mycelial growth, sporangia and oospore production of Phytophthora infestans
CN113462580B (zh) 一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用
MEAH et al. Effect of media composition on vegetative and reproductive growth of Alternaria brassicicola and Bipolaris sorokiniana.
Leuchtmann et al. The taxonomic position of the genus Heydenia (Pyronemataceae, Pezizales) based on molecular and morphological data
US20210062237A1 (en) Device for detecting tomato pathogenic fungus and detection method using the same
Kumar et al. Isolation and symbiotic characterization of transposon Tn5-induced arginine auxotrophs of Sinorhizobium meliloti
CN113462740A (zh) 一种荞麦灰斑病抗性鉴定方法
CN113502282A (zh) 一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法
CN111411048A (zh) 一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination