CN116491511B - 一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用，涉及农业杀菌剂领域，多杀霉素在杀菌剂中的重量百分比为0.01%‑100%，杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为100‑200mg/L时可以杀灭或抑制多种微生物，杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150‑200mg/L时对多种真菌具有明显的杀灭或抑制能力，多杀霉素的使用浓度为150 mg/L可以防治灰霉病、枯萎病、白粉病等植物病害。

Description

一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及农业杀菌剂技术领域，特别是涉及一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂。
背景技术
多杀霉素（多杀菌素）是一种具有高效触杀及摄食毒性的天然新型杀虫剂，也是迄今为止最为有效且安全的天然杀虫剂。因为多杀霉素同时具有生物农药的安全性和化药的速效性，所以具有宽广的市场规模和巨大的应用价值。目前，多杀霉素已经在73个国家250多种作物上进行了登记应用。
1999年，多杀霉素在我国农业部进行了登记，用于防治棉铃虫和小菜夜蛾，其有效成分是多杀霉素A和D的混合物。多杀霉素对鳞翅目害虫特别有效，其毒力可与拟除虫菊酯杀虫剂相媲美。多杀霉素通过结合烟碱乙酰胆碱受体结合和抑制γ氨基丁酸活化，使害虫出现神经中毒的症状，主要表现为身体震颤、麻痹、瘫痪，最终衰竭死亡。
多杀霉素的杀虫机制不同于吡虫啉、苯基吡唑、拟除虫菊酯、阿维霉素和环二烯，且对哺乳动物的乙酰胆碱受体却具有选择性，所以其对哺乳动物非常安全。多杀霉素对鸟类具有低毒性，对水生生物具有中等毒性，在土壤中主要被阳光和微生物降解。目前，国内外均没有关于多杀霉素在杀菌功能方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂及其应用，发现并开发了多杀霉素作为杀菌剂的用途，并测试了多杀霉素在杀灭几种病原菌与防治几种常见植物病害的药效。
一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂，所述多杀霉素在杀菌剂中的重量百分比为0.01%-100%。
所述杀菌剂在杀灭或抑制微生物药剂中的应用。
进一步地，所述微生物包括但不限于以下微生物：大肠杆菌、藤黄微球菌、化脓性链球菌、炭疽芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、食丁酸芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、芽孢八叠球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、提蒙芽胞杆菌、水稻节杆菌、藤黄短小杆菌、土壤农杆菌、叶片微杆菌、污物假节杆菌、北里孢菌、海洋游动球菌、双向伯克霍尔德氏菌、马红球菌、氧化烃微杆菌、卵形孢球托霉菌、淡紫拟青霉菌、多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌。
进一步地，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为100-200mg/L。
本发明通过对病原菌进行基因提取、16sRNA扩增测序与分子鉴定，明确了多杀霉素的杀菌谱范围：多杀霉素在100-200mg/L的使用浓度下，对多种病原微生物有抑制作用。
进一步地，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150-200mg/L。
进一步地，所述杀菌剂在杀灭或抑制真菌中的应用。
进一步地，所述真菌包括但不限于多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌、淡紫拟青霉菌。
杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150-200mg/L，对多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌和淡紫拟青霉菌具有明显的杀灭或抑制能力。同样地，在此使用浓度下，对于本发明中提及的其它真菌也具有杀灭或抑制能能力。
所述杀菌剂在防治植物病害药物中的应用。
进一步地，所述植物病害包括但不限于以下植物病害：灰霉病、枯萎病、白粉病。
进一步地，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150 mg/L。
多杀霉素在150 mg/L的使用浓度下可以防治多种植物病害：本发明利用黄瓜苗作为模型植物，使用特定浓度的多杀霉素对植物进行预防，再将几种常见植物病害的病原菌接种至黄瓜苗上使其发病，通过测定明确了多杀霉素在植物上的防治效果。
RNaseA指能水解RNA磷酸二酯键的酶，称核糖核酸酶，能催化核糖核酸（RNA）的降解。
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。
本发明的有益效果是：
本发明通过对病原菌进行基因提取、16s RNA扩增测序与分子鉴定，明确了多杀霉素在200 mg/L的杀菌谱范围，本发明的多杀霉素100-200mg/L的使用浓度下，对多种病原微生物有抑制作用：包括但不限于大肠杆菌、藤黄微球菌、化脓性链球菌、炭疽芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、食丁酸芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、芽孢八叠球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、提蒙芽胞杆菌、水稻节杆菌、藤黄短小杆菌、土壤农杆菌、叶片微杆菌、污物假节杆菌、北里孢菌、海洋游动球菌、双向伯克霍尔德氏菌、马红球菌、氧化烃微杆菌、卵形孢球托霉菌、淡紫拟青霉菌、多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌；在150 mg/L的使用浓度下可以防治包括但不限于根腐病、灰霉病、白粉病等植物病害。
附图说明
图1是实施例1中200 mg/L的多杀霉素对几种未知微生物的杀灭效果图；
图2是实施例1中用于多杀霉素的杀菌谱中分类鉴定的16sRNA进化树；
图3是实施例2中不同浓度的多杀霉素对常见病原微生物的杀灭效果图；
图4是实施例3中150 mg/L的多杀霉素对黄瓜灰霉病的防治效果图；
图5是实施例4中150 mg/L的多杀霉素对黄瓜枯萎病的防治效果图；
图6是实施例5中150 mg/L的多杀霉素对黄瓜白粉病的防治效果图。
具体实施方式
以下对本发明的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，此处所描述的实施例仅是本发明中的一部分，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
多杀霉素购买自sigma官网，CAS号168316-95-8。
实施例1
多杀霉素杀菌谱测试:
1）称取200 mg多杀霉素，溶于1 mL甲醇，制成浓度为200 mg/mL的多杀霉素。
2）取LB培养基的千分之一体积的多杀霉素（200 mg/mL）加入到LB培养基中，配制成含有200 µg/mL多杀霉素的LB培养基。
3）取LB培养基的千分之一体积的甲醇，加入到LB培养基中，配置成不含多杀霉素的对照组。
4）将实验室保存的菌株制成菌液，分别涂布到含有200 µg/mL多杀霉素和不含多杀霉素的LB培养基上，于37℃培养3天。
5）3天后，检查各平板上的菌落生长情况。如图1所示，对照组中微生物生长良好，而200 µg/mL多杀霉素的处理组中，食丁酸芽孢杆菌、藤黄微球菌、藤黄短小杆菌、枯草芽孢杆菌、多主棒孢霉菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌和淡紫拟青霉菌等微生物生长均受到抑制。
6）将上述对多杀霉素敏感的所有菌株，分别接入5 mL的LB培养液中，于37℃，250rpm震荡培养2天。
7）培养结束后，13400×g，离心1 min收集菌体。
8）1 mL无菌水洗涤悬浮菌体沉淀，13400×g，离心1 min收集菌体。
9）加入180 μL溶菌酶溶液 (终浓度为20 mg/mL)，37°C 静置30 min。
10）加入4 μL RNase A (100 mg/mL) 溶液，振荡15 sec，室温静置5 min。
11）向管中加入20 μL蛋白酶K溶液，混匀。
12）加入220 μL蛋白裂解溶液，混匀15 sec，70°C 放置10 min，短暂离心以除去管内水珠。
13）加220 μL无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，短暂离心除去管内水珠。
14）将上一步所得溶液与絮状沉淀都转移至一个吸附柱中 (吸附柱放入收集管中)，13000×g，离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
15）向吸附柱中加入500 μL去蛋白液，13400×g，离心1 min，弃废液, 将吸附柱放回收集管中。
16）向吸附柱中加入600 μL漂洗液，13400×g，离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中，再重复此步骤一次。
17）将吸附柱放回收集管中，13400×g，离心2 min，弃废液，将吸附柱置于室温放置十分钟，彻底晾干吸附柱子中残余漂洗液。
18）将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附柱中央悬空滴加70 μL于60°C预热过的TE缓冲液，室温放置2 min，13400×g，离心2 min, 将溶液收集到离心管中。
19）所得基因组DNA用Nano测定质量浓度，并统一用TE缓冲液调浓度为200 ng/µL。
20）每1个PCR反应体系分别加入1种细菌的基因组DNA。
21）PCR体系：Green Taq Mix 7.5 µL，正向引物27F 0.75 µL，反向引物1492R0.75 µL，超纯水4 µL，基因组DNA 2 µL（即400 ng）。
22）混匀PCR反应体系后，6000 rpm瞬时离心15 s，然后按照如下反应条件进行PCR。
23）PCR反应条件：步骤1，95℃保持5 min；步骤2，95℃保持0.5 min；步骤3，55℃保持0.5 min；步骤4，72℃保持1.5 min，转至步骤2，循环30次；步骤6，72℃保持5 min。
24）将所得PCR产物利用Sanger法测序，测序结果通过与现有BLAST数据库进行比对。如图2所示，将比对成功的序列利用邻接法构建系统发育树，表明多杀霉素可杀灭的1号靶标菌为食丁酸芽胞杆菌。
25）经过16s RNA鉴定，表明多杀霉素的可杀灭的靶标菌包括：多粘类芽孢杆菌、食丁酸芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、芽孢八叠球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、提蒙芽胞杆菌、水稻节杆菌、藤黄短小杆菌、土壤农杆菌、叶片微杆菌、污物假节杆菌、北里孢菌、海洋游动球菌、双向伯克霍尔德氏菌、马红球菌、氧化烃微杆菌、卵形孢球托霉、淡紫拟青霉菌。
实施例2
多杀霉素对多种病原菌的最小抑菌浓度测试：
1）依次称取50 µg、100 µg、150 µg、200 µg、250 µg多杀霉素，分别溶于1 mL甲醇，分别制成浓度为50 µg/mL、100 µg/mL、150 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL的多杀霉素。
2）将常见病原菌（大肠杆菌、藤黄微球菌、炭疽芽孢杆菌、多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌）均匀接种至装有LB培养基的平板上，再将5个牛津杯均匀放置于平板的上侧、中侧、下侧、左侧、右侧。
3）将不同浓度的多杀霉素溶液，各取200 µL移至位于上、下、左、右的牛津杯中，200 µL甲醇移入中央的牛津杯中作为对照。
4）平板转移到37℃，培养3天。
5）如图3所示，3天后可以观察不同浓度的多杀霉素对病原菌的抑制效果，更多具体数据见下表1。
表1多杀霉素对多种病原菌的抑制效果
病原菌名称 50 µg/mL抑菌圈直径（mm） 100 µg/mL抑菌圈直径（mm） 150 µg/mL抑菌圈直径（mm） 200 µg/mL抑菌圈直径（mm） 250 µg/mL抑菌圈直径（mm）
大肠杆菌 10 10 14 15 15
藤黄微球菌 10 11 14 15 14
炭疽芽孢杆菌 12 13 14 14 14
多主棒孢霉菌 3 9 17 29 29
尖刀镰孢菌 5 10 14 26 26
禾谷镰孢菌 6 11 15 24 24
灰霉菌 11 15 20 25 25
立枯丝核菌 8 9 12 21 21
由表1数据可知，针对大肠杆菌、藤黄微球菌、炭疽芽孢杆菌，随着浓度升高，由150mg/L到250mg/L，抑菌圈直径没有明显增大，说明浓度150mg/L已经达到了最好的杀菌效果；针对多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌，随着浓度升高，由200mg/L到250mg/L，抑菌圈直径没有增大，说明浓度200mg/L已达到最好杀菌效果；在使用浓度150mg/L-200mg/L时，多杀霉素对于多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌和立枯丝核菌具有非常明显的杀灭或抑制能力；针对表1中所有的微生物，随着浓度升高， 多杀霉素浓度达到100mg/L时，已经具备了明显的杀菌效果。
综上，多杀霉素在100-200mg/L的使用浓度下，对多种病原微生物有明显的抑制作用；多杀霉素在150-200mg/L的使用浓度下，对多种真菌有明显的抑制作用。
实施例3
多杀霉素防治黄瓜灰霉病：
1.黄瓜苗预防性用药：
1）将刚处于三叶期且长势一致的健康黄瓜苗进行分为3组，每组9株，每株喷施100mL药剂。其中，阳性对照组浇施药剂1，测试组浇施药剂2, 阴性对照组则浇施药剂3。
2）药剂1成份：施佳乐嘧霉胺 400 mg/L。
3）药剂2成份：多杀霉素150 mg/L。
4）药剂3成份：清水。
5）将药剂处理完毕后的黄瓜苗置于温度25℃、湿度90%、14 h光照（光强5000 Lex）+10 h黑暗的光照培养箱中培养1天。
2.黄瓜苗接种病原菌孢子：
1）取活化后产孢的灰霉病菌，倒入灭菌水洗下灰葡萄孢子，再进行镜检，确保孢子悬浮液的浓度达到107cfu/mL。
2）施药1天后，将准备好孢子悬浮液，按照每株10 mL进行均匀喷雾。
3）将接菌完毕后的黄瓜苗置于温度25℃和湿度90%的光照培养箱中，避光培养1天后，再恢复为14 h光照（光强5000 Lex）+10 h黑暗的条件继续培养。
3.黄瓜灰霉病发病情况调查：
1）用药后的第10天，调查黄瓜苗的发病情况，结果如图4所示，药剂1处理和药剂2处理的发病情况均显著低于药剂3处理的发病情况。
2）病情按照如下标准进行分级。
3）0级：无病斑；1级：病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级：病斑面积占整片叶面积的5%~15%；5级：病斑面积占整片叶面积的15%~25%；7级：病斑面积占整片叶面积的25%~50%；9级：病斑面积占整片叶面积的50%以上。
4）病情指数按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
5）上述式中：I 为病情指数；g为植株症状对应的病情级数；n为各级病情对应的植株数；N为调查总植株数。
6）经计算，药剂1处理组的病情指数为1.44，药剂2处理组的病情指数为8.74，药剂3处理组的病情指数为32.33。
4.预防性用药对黄瓜灰霉病的防效：
1）防效效按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
2）上述式中：CE为防效；Ick为空白对照组的病情指数；It为药剂处理组的病情指数。
3）经计算，相对于阴性对照药剂3，药剂1（施佳乐）的对黄瓜灰霉病的防效达到了95.55%；而药剂2（多杀霉素）对黄瓜灰霉病的防效则达到了72.97%，说明浓度为150 mg/L的多杀霉素可以用作杀菌剂来防治黄瓜灰霉病，且其使用过程中黄瓜苗长势良好，说明其安全性很高。
实施例4
多杀霉素防治黄瓜枯萎病：
1.黄瓜苗预防性用药：
1）将刚处于三叶期且长势一致的健康黄瓜苗进行分为3组，每组9株，每株浇施50mL药剂。其中，测试组浇施药剂1，阳性对照组浇施药剂2, 阴性对照组则浇施药剂3。
2）药剂1成份：98%噁霉灵可溶粉剂0.5 g/L。
3）药剂2成份：多杀霉素150 mg/L。
4）药剂3成份：清水。
5）将药剂处理完毕后的黄瓜苗置于温度25℃、湿度65%、14 h光照+10 h黑暗、光强5000 Lex的光照培养箱中培养1天。
2.黄瓜苗接种病原菌孢子：
1）将尖刀镰孢菌的菌丝接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中培养5天，随后用高速剪切机打匀菌丝后，用紫外分光光度计测定OD600值，并用无菌水调整OD600至1.0待用。
2）施药1天后，将准备好的OD600=1.0的菌液，稀释2倍并浇于黄瓜苗根部，每株苗均匀浇灌20 mL病原菌液。
3）将接菌完毕后的黄瓜苗置于温度25℃、湿度80%、14 h光照+10 h黑暗、光强5000Lex的光照培养箱。
3.黄瓜枯萎病发病情况调查：
1）用药后的第10天，调查黄瓜苗的发病情况，结果如图5所示，药剂1处理组和药剂2处理组的发病情况均显著低于药剂3处理组的发病情况。
2）病情按照如下标准进行分级。
3）0级：无发病症状；1级：植株轻度症状，或发黄；2级：植株轻度症状，或叶片出现严重发黄、坏死斑；3级：植株中度症状，叶片蒌焉或根部呈锐角状倒伏；4级：植株严重萎蔫，出现倒苗、枯死。
4）病情指数按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
5）上述式中：I 为病情指数；g为植株症状对应的病情级数；n为各级病情对应的植株数；N为调查总植株数。
6）经计算，药剂1处理组的病情指数为2.38，药剂2处理组的病情指数为9.08，药剂3处理组的病情指数为30.04。
4.预防性用药对黄瓜枯萎病的防效：
1）防效效按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
2）上述式中：CE为防效；Ick为空白对照组的病情指数；It为药剂处理组的病情指数。
3）经计算，相对于阴性对照药剂3，药剂1（噁霉灵）对黄瓜枯萎病的防效达到了92.08%；而药剂2（多杀霉素）对黄瓜枯萎病的防效则达到了69.77%，说明浓度为150 mg/L的多杀霉素可以用作杀菌剂来防治黄瓜枯萎病，且其使用过程中黄瓜苗长势良好，说明其安全性很高。
实施例5
多杀霉素防治黄瓜白粉病：
1.黄瓜苗预防性用药：
1）将刚三叶期且长势一致的健康黄瓜苗进行分为3组，每组9株，每株喷施100 mL药剂（叶片正反面均要喷施）。其中，阳性对照组浇施药剂1，测试组浇施药剂2, 阴性对照组则浇施药剂3。
2）药剂1成份：露娜森140 mg/L。
3）药剂2成份：多杀霉素150 mg/L。
4）药剂3成份：清水。
5）将药剂处理完毕后的黄瓜苗置于温度25℃、湿度70%、14 h光照（光强5000 Lex）+10 h黑暗的光照培养箱中培养1天。
2.黄瓜苗接种病原菌孢子：
1）用0.1%吐温80水溶液，从已发病的黄瓜植株上收集白粉病菌孢子，镜检后将孢子悬浮液浓度调整至105cfu/mL。
2）施药1天后，将准备好白粉菌的孢子悬浮液，按照每株100 mL进行均匀喷雾。
3）将接菌完毕后，将黄瓜苗置于温度25℃、湿度70%、14 h光照（光强5000 Lex）+10h黑暗的条件下培养。
3.黄瓜白粉病发病情况调查：
1）用药后的第10天，调查黄瓜苗的发病情况，结果如图6所示，药剂1处理和药剂2处理的发病情况均显著低于药剂3处理的发病情况。
2）病情按照如下标准进行分级。
3）0级：无病斑；1级：病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级：病斑面积占整片叶面积的5%~15%；5级：病斑面积占整片叶面积的15%~25%；7级：病斑面积占整片叶面积的25%~50%；9级：病斑面积占整片叶面积的50%~75%以上；11级：病斑面积占整片叶面积的75%以上。
4）病情指数按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
5）上述式中：I 为病情指数；g为植株症状对应的病情级数；n为各级病情对应的植株数；N为调查总植株数。
6）经计算，药剂1处理组的病情指数为2.06，药剂2处理组的病情指数为15.35，药剂3处理组的病情指数为62.64。
4.预防性用药对黄瓜白粉病的防效：
1）防效效按照如下公式计算，结果保留小数点后两位：
2）上述式中：CE为防效；Ick为空白对照组的病情指数；It为药剂处理组的病情指数。
3）经计算，相对于阴性对照药剂3，药剂1（施佳乐）的对黄瓜白粉病的防效达到了96.71%；而药剂2（多杀霉素）对黄瓜白粉病的防效则达到了75.49%，说明浓度为150 mg/L的多杀霉素可以用作杀菌剂来防治黄瓜白粉病，且其使用过程中黄瓜苗长势良好，说明其安全性很高。

Claims (6)

1.一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂在杀灭或抑制微生物中的应用，其特征在于，多杀霉素在杀菌剂中的重量百分比为0.01%-100%；
所述微生物包括但不限于以下微生物：大肠杆菌、藤黄微球菌、炭疽芽孢杆菌、食丁酸芽胞杆菌、藤黄短小杆菌、淡紫拟青霉菌、多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为100-200mg/L。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150-200mg/L。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物包括但不限于多主棒孢霉菌、尖刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰霉菌、立枯丝核菌、淡紫拟青霉菌。
5.一种以多杀霉素为有效成分的杀菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，多杀霉素在杀菌剂中的重量百分比为0.01%-100%；
所述植物病害包括但不限于以下黄瓜植物病害：灰霉病、枯萎病、白粉病。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中多杀霉素的使用浓度为150mg/L。
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