CN115407067B - 一种脓毒血症诊断标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脓毒血症诊断标志物。脓毒血症具有高发病率、高致死率，由于脓毒血症的临床表现无特异性，其诊断和严重程度评估依然非常困难。本发明联想到血清淀粉样蛋白与临床多种炎症性疾病的发展相关，并提供了血清中SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸和/或血清淀粉样蛋白A2第89位精氨酸转变为组氨酸作为脓毒血症血清标志物的应用。

Description

一种脓毒血症诊断标志物
技术领域
本发明属于脓毒血症血清标志物技术领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A1第70位丙氨酸、血清淀粉样蛋白A1第89位组氨酸作为脓毒血症标志物的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脓毒血症(sepsis)是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征。脓毒症可以由任何部位的感染引起，临床上常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等；还常常发生在有严重疾病的患者中，如严重烧伤、多发伤、外科手术后等患者，以及慢性疾病的患者如糖尿病、慢性阻塞性支气管、白血病、再生障碍型贫血和尿路结石。脓毒血症的病原微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等，临床针对脓毒血症的诊疗需要依靠微生物血培养结果开展，但并非所有的脓毒症患者都有引起感染的病原微生物的阳性血培养结果，仅约45％的脓毒性休克患者可获得阳性血培养结果。早期诊断脓毒血症并预测预后对提高疗效、改善预后至关重要。
目前脓毒血症早期诊断标志物的研究主要集中在和肽素、降钙素等炎症因子领域。发明人认为，血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA，SAA)是近年来被深入研究的一种急性时期蛋白，在机体炎症(如外伤、感染等)反应过程中上升极快，是目前最敏感的炎症标志物之一。血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA，SAA)是一组有同一基因编码的多形性蛋白，包括SAA1-SAA4这4种蛋白亚型，SAA家族包括急性期SAA(SAA1和SAA2编码)，组成型SAA(SAA4基因编码)，SAA3编码表观假基因；SAA1始终是SAA的主要组成部分，决定着SAA蛋白的作用水平。急性期SAA主要在肝脏中由细胞因子诱导后合成产生；在炎症反应刺激后，机体产生白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，而IL-6可协调IL-1和TNF-α刺激SAA的产生；近年来研究发现，正常组织细胞、动脉粥样硬化斑块中细胞、脂肪细胞也能合成SAA。SAA具有抗病毒活性，SAA可抑制丙型肝炎病毒进入细胞，可作为丙型肝炎病毒感染先天防御机制之一；SAA在感染性疾病中比CRP更为敏感、特异度高，尤其在病毒感染中其血清值较基本正常的CRP值升高明显。SAA可诱导炎症细胞粘附浸润、免疫趋化等。此外，SAA参与组织修复和再生中胆固醇的动员，SAA可抑制胆固醇从细胞中流出，减少胆固醇输送至损伤细胞；近年来，越来越多的证据表明SAA参与了多种疾病的病理过程。
发明内容
本发明目的在于提供一种脓毒血症的诊断标志物，并针对脓毒血症与血清中血清淀粉样蛋白A的相关性进行了研究，研究结果表明，血清中SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸(SAA1@70V-A)以及血清淀粉样蛋白A2第89位氨基酸从精氨酸转变为组氨酸(SAA2@89R-H)上述两种改变在脓毒血症患者血液中显著升高，可以作为脓毒血症检查的标志物应用。
因此，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，一种脓毒血症诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物为血清淀粉样蛋白A2第89位氨基酸；或血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸。
上述第一方面，所述脓毒血症标志物为诊断标志物、治疗标志物、预后标志物中的一种或几种的组合。更为优选的方案中，上述位点的氨基酸作为脓毒血症的诊断标志物应用。
经本发明验证，健康人血清中血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸通常为缬氨酸，而脓毒血症患者上述位点氨基酸通常为丙氨酸；另外，脓毒血症患者血清样本的血清淀粉样蛋白A2蛋白第89位的氨基酸会从精氨酸转变为组氨酸，并且上述氨基酸种类的变化与脓毒血症存在极为显著的相关性。经验证，上述位点氨基酸的转变与患病情况具有相关性，可作为脓毒血症的临床诊断标志物加以应用。
另外，上述位点氨基酸作为脓毒血症诊断标志物的应用方式为包括但不限于以下的任意一种：
(1)通过检测上述位点氨基酸的种类，如果血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸为缬氨酸和/或血清淀粉样蛋白A2第89位为精氨酸，则受试者判定为不是脓毒血症患者，如果血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸为丙氨酸和/或血清淀粉样蛋白A2第89位为组氨酸，则受试者判定为脓毒血症患者；
(2)通过检测上述位点氨基酸的质量，若受试者血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸质量相比对照组具有28.028～28.033Da的质量缺失和/或血清淀粉样蛋白A2第89位相比对照组具有19.040～19.044Da的质量缺失，判定为脓毒血症患者。
通过检测手段判断上述位点的氨基酸种类或质量缺失情况，可以用于脓毒血症的临床诊断，可行检测方法包括但不限于质谱、核磁共振、红外光谱、紫外光谱、圆二色谱、X射线晶体学、场解析质谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及兔疫学方法。
本发明提供的一种具体的检测方法中，提供一种通过液相-质谱检测方法，通过对含有上述位点的目标肽段质量缺失情况进行检测的方法，经验证，该检测方法具有良好的准确性。
因此，本发明第二方面，提供一种脓毒血症诊断方法，所述诊断方法包括：对检测样本进行酶解获得肽段，将肽段通过液相进行分级，根据PRM离子列表对样本进行质谱检测，再通过内标或外标方式对目标物进行定量，从而判断患者病况。
本发明第三方面，提供一种脓毒血症诊断试剂组合，所述诊断试剂组合用于检测受试者样本中血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸和/或血清淀粉样蛋白A2第89位氨基酸产生情况。
上述诊断试剂组合的一种实施方式中，提供一种基于第二方面所述质谱方法进行诊断的试剂组合，所述试剂组合中至少包括蛋白沉淀试剂、酶解试剂、洗脱液及流动相。
优选的，所述蛋白沉淀试剂的一种实例中，为碳酸氢铵与丙酮的组合。
优选的，可行的酶解试剂包括Trypsin[KR|P]；Trypsin/p[KR|-]；TrypsinK[K|P]；TrypsinR[R|P]；ChymoTrypsin[FWYL|P]；ArgC[R|P]；AspN[-|D]n-term；Clostripain[R|-]；CNBr[M|P]；Elastase[GVLIA|P]；Formic Acid[D|P]；GluC[DE|P]；GluC bicarb[E|P]；Iodosobenzoate[W|-]；LysC[K|P]；LysC/P[K|-]；LysN[-|K]n-term；LysN promisc[-|KASR]n-term；PepsinA[FL|P]；Protein endopeptidase[P|-]；Staph protease[E|-]；Trypsin-CNBr[KRM|P]；Trypsin-GluC[DEKR|P]等。
优选的，所述洗脱液用于酶解后肽段的脱盐洗脱，包括平衡液A和洗脱液B，其中平衡液A为水相，洗脱液B为有机相。
优选的，所述流动相包括甲酸水溶液及乙腈水溶液。
本发明第四方面，提供一种脓毒血症的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括第二方面所述诊断试剂组合。
本发明第五方面，提供一种脓毒血症的治疗药物，所述药物能够消除或降低血清淀粉样蛋白A1中第70位转变成丙氨酸的和/或血清淀粉样蛋白A1第89位氨基酸从精氨酸转变为组氨酸。
上述药物一种可行的实施方式中，为药物干预。
本发明第六方面，提供一种脓毒血症的治疗方式，所述治疗方式包括能够清除或降低第70位变成丙氨酸的血清淀粉样蛋白A1的量和/或第89位氨基酸从精氨酸转变为组氨酸的血清淀粉样蛋白A2的量。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
脓毒血症临床表现具有非特异性，结合血培养等方式进行诊断需要较长时间，并且只有近半的患者能够表现血培养阳性，这为脓毒血症的临床诊断带来了较大困难，延误治疗时机。本发明一个实施方式中，提供了一种可用于脓毒血症临床诊断的血清标志物，该标志物与脓毒血症具有极显著的统计学相关性，基于该标志物，有望实现脓毒血症的临床快速诊断。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1所述第70位缬氨酸转变为丙氨酸的肽段GPGGV(-28.03Da)WAAEAISDAR的二级谱图；
图2为实施例1所述样品中SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸的检出信息；
图3为实施例1中所述脓毒血症患者血清与正常人血清SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸的ROC曲线。
图4为实施例1中所述目标肽段的二级谱图；
图5为实施例1中所述样品中SAA2第89位精氨酸转变为组氨酸检出信息；
图6为实施例1中所述脓毒血症患者血清与正常血清SAA2第89位精氨酸转变为组氨酸的ROC曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1脓毒血症患者血清标本中SAA1@70V-A的测定方法
本实施例中，采用215例样本，其中47例正常人血清样本，168例为确诊脓毒血症患者血清样本。
一、血清样本前处理
1、10μL血清样品中加入190μL25mM碳酸氢铵，加入5倍体积预冷的丙酮，vortex20s后放置-40℃，沉淀蛋白1h。获取蛋白沉淀加入25mM碳酸氢铵调整蛋白浓度为0.5ug/μL，且调整体积为200μL。
2、向上述200uL蛋白溶液中加入终浓度5mM的DTT及胰酶在37℃700rpm条件震荡孵育获得多肽条带。
3、多肽脱盐和洗脱干燥：将裂解后的多肽加入500μLACN平衡C18脱盐柱，停留10分钟，BufferA：0.1％FA(H2O)；BufferB：70％CAN(H2O)。加入1mLBufferA洗去残余的CAN后将样品过脱盐柱，然后用500uL BufferA平衡脱盐柱2次。采用50μL70％ACN洗脱多肽。真空离心干燥洗脱液后，加入100uL BufferA溶解多肽。以20,000g4℃条件离心10min后，取15uL于进样瓶中，用LC-MS检测。
4、用EASY-nLC1200液相系统进行分离，使用在线ThermoQE-HFX质谱仪进行DDA模式检测。
液相分离系统参数：
预柱：150μm*3cmC181.9μmReprosil-Pur120；
色谱柱：150μm*25cmC181.9μmReprosil-Pur120；
流速：600nL/min；
流动相A：0.1％甲酸(水)；流动相B：0.1％甲酸80％乙腈(水)；
洗脱梯度：4％-7％B持续1min,7％-25％B持续94min，25％-40％B持续16min，40％-100％B持续5min，100％持续4min；上样量：5μL。
质谱检测参数：
扫描范围：150-2000m/z；
数据采集模式：DDA采集方式，top20碎片图谱；
MS1分辨率(200m/z)：60,000；MS1AGCtarget：3e6,maxIT:50ms；
MS2分辨率(200m/z)：15,000；MS2AGCtarget：5e4,maxIT:45ms；
标准化碰撞能量(NCE)：28％；隔离窗口：1.6m/z；
二、血清淀粉样蛋白A1(SAA1)第70位缬氨酸转变为丙氨酸的数据分析
根据“一、血清样本前处理”部分记载的方法，获得含第70位缬氨酸转变为丙氨酸的肽段GPGGV(-28.03Da)WAAEAISDAR的二级谱图(如图1)。
根据统计结果，SAA1蛋白中第70位缬氨酸转变为丙氨酸，其p＝1.6e-9<0.001。即该变化在脓毒血症患者血清与正常人的血清中具有极显著的统计学差异，见图2。
上述位点的相关修饰的信息如下：Deltamass(修饰集团)所属蛋白：P0DJI8(血清淀粉样蛋白A1，SAA1)；Deltamass在SAA1的位置：70；Deltamass所属肽段：GPGGVWAAEAISDAR；Deltamass分子量：-28.03Da；Deltamass评分：0.7449(Deltamass评分是指：在质谱检测中，Deltamass由于仪器受到环境中极其微小的作用，使得质谱测得的单个Deltamass的结果在精确度范围内呈正态分布形式。拟合度在0～1范围内，分值越高说明检测结果越可靠。达到0.2的二级图谱就会被认可)。脓毒血症患者血清与正常人血清SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸的ROC曲线(如图3)。注：ROC曲线的AUC＝0.753，临界值为1.67。
综上所述：SAA1蛋白的第70位的缬氨酸转变为丙氨酸对脓毒血症的诊断具有良好的提示作用。
三、血清淀粉样蛋白A2(SAA2)第89位精氨酸转变为组氨酸的数据分析
含第89位精氨酸转变为组氨酸的肽段LTGR(-19.04Da)GAEDSLADQAANK的二级谱图如附图4所示。Deltamass相关信息如下：Deltamass所属蛋白：P0DJI9(血清淀粉样蛋白A2，SAA)；Deltamass在SAA2的位置：89；Deltamass所属肽段：LTGRGAEDSLADQAANK；Deltamass分子量：-19.04Da；Deltamass评分：0.8099。
通过对上述位点氨基酸转变进行统计学分析，第89位精氨酸转变为组氨酸，其P＝2.22e-16<0.001，即SAA2蛋白第89位精氨酸转变为组氨酸在脓毒血症与正常人的血清之间具有极显著的统计学差异，其ROC曲线见图3。根据上述统计学分析结果，SAA2蛋白的第89位精氨酸转变为组氨酸对于脓毒血症患者的诊断与治疗具有重要的提示意义，有望作为一种诊断标志物。
实施例2基于SAA1@70V-A标志物的脓毒血症诊断方法
本实施例中，对SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸的快速质谱检测方法作为临床诊断方法的可行性进行验证。
采用skyline软件分析实施例1中所述方法测得的质谱数据，得到目标肽段GPGGV(-28.03Da)WAAEAISDAR色谱保留时间。将该保留时间与目标肽段2价与3价母离子和其相对应的子离子结合构建用于质谱检测时所采集的PRM的离子列表。(见表1.离子列表。备注：每个母离子都有多个子离子且每个子离子都可存在多个价态，表1仅列出常规选取且相对丰度较高的1价子离子。)
表1.目标肽段的2价和3价母离子及其对应的子离子
从实施例1所述215例样本中，随机选择5例健康样本、5例脓毒血症患者样本，抹去标签后用过以下方法检测：使用EASY-nLC1200液相系统进行分离，使用在线ThermoQE-HFX质谱仪检测。
液相分离系统参数：
预柱：75μm*2cmPepMapC183μmThermo；
色谱柱：75μm*15cmPepMapC182μmThermo；
流速：500nl/min；
流动相A：0.1％甲酸(水)；流动相B：0.1％甲酸80％乙腈(水)；
洗脱梯度：6％-25％B持续21min,25％-40％B持续4min，40％-100％B持续3min,100％B持续2min；样品加载量为：3μl。
质谱检测参数：
数据采集模式：PRM采集方式，top20碎片图谱；MS2分辨率(200m/z)：30,000；MS2AGCtarget：2e5,maxIT:70ms；标准化碰撞能量(NCE)：28％；隔离窗口：1.6m/z。
调整质谱参数，使其根据“表1.目标肽段的2价和3价母离子及其对应的子离子”快速检测样本。采用skyline等分析软件分析质谱测定结果。根据软件分析出的患者血清中SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸的量，判定患者是否为脓毒血症。
采用上述检测方法，10例待测样本中检出3例SAA1第70位氨基酸质量缺失28.03Da，均为脓毒血症患者，所以SAA1第70位缬氨酸转变为丙氨酸作为诊断标志物的的检出率为100％。
实施例3基于SAA2@89R-H标志物的脓毒血症诊断方法
表2.目标肽段的2价和3价母离子及其对应的一价子离子
基于实施例2中提供的液相-质谱检测条件，使其根据“表2.目标肽段的2价和3价母离子及其对应的子离子”快速检测样本。采用skyline等分析软件分析质谱测定结果。根据软件分析出的患者血清中SAA2第89位缬氨酸转变为丙氨酸的量，判定患者是否为脓毒血症。
为了验证上述诊断标志物的准确性，本实施例另外采集了8例样本，其中包括5例正常样本及3例脓毒血症患者样本，抹去标签后分别进行检测，检出其中3例患者SAA2蛋白的第89位质量缺失约19.04Da。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测血清淀粉样蛋白A2第89位氨基酸或血清淀粉样蛋白A1第70位氨基酸的试剂组合在制备诊断脓毒血症的试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂组合包括蛋白沉淀试剂、酶解试剂、洗脱液及流动相。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述蛋白沉淀试剂为碳酸氢铵与丙酮的组合；
所述酶解试剂包括Trypsin[KR|P]；Trypsin/p[KR|-]；TrypsinK[K|P]；TrypsinR[R|P]；ChymoTrypsin[FWYL|P]；ArgC[R|P]；AspN[-|D]n-term；Clostripain[R|-]；CNBr[M|P]；Elastase[GVLIA|P]；Formic Acid[D|P]；GluC[DE|P]；GluC bicarb[E|P]；Iodosobenzoate[W|-]；LysC[K|P]；LysC/P[K|-]；LysN[-|K]n-term；LysN promisc[-|KASR]n-term；PepsinA[FL|P]；Protein endopeptidase[P|-]；Staph protease[E|-]；Trypsin-CNBr[KRM|P]；Trypsin-GluC[DEKR|P]；
所述洗脱液用于酶解后肽段的脱盐洗脱，包括平衡液A和洗脱液B，其中平衡液A为水相，洗脱液B为有机相；
或，所述流动相包括甲酸水溶液及乙腈水溶液。
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