CN115404274A - 一种甲基化位点在子宫内膜异位症诊断和分型中的应用 - Google Patents
一种甲基化位点在子宫内膜异位症诊断和分型中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种甲基化位点在子宫内膜异位症诊断和分型中的应用。本发明首次通过研究证实,与在位子宫内膜组织相比,甲基化位点chr21:21632839在腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平显著降低,且在腺肌症组织中的甲基化水平显著显著高于卵巢子宫内膜异位组织。进一步地,ROC曲线分析结果显示,甲基化位点chr21:21632839在用于诊断腺肌症,卵巢子宫内膜异位症,鉴别腺肌症和卵巢子宫内膜异位症时,AUC均高达0.9以上。说明甲基化位点chr21:21632839可作为子宫内膜异位症诊断和分型的特异性分子标记物,诊断灵敏度和特异性好,准确率高。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域,具体涉及一种甲基化位点在子宫内膜异位症诊断和分型中的应用。
背景技术
子宫内膜异位症表现为子宫内膜组织存活于宫腔外组织器官、并受激素调节呈月经周期性的生长和脱落,往往伴随局部炎症、疼痛、并导致不孕不育等并发症,患者生育率会降低至健康妇女的10%以下。子宫内膜病变可分为三种类型:浅表腹膜病变、卵巢子宫内膜异位症或深部浸润性子宫内膜异位症。然而,现有的检查手段例如超声扫描、腹腔镜检和核磁共振(MRI)等对微小病灶检出率有限,对于复杂部位的子宫内膜异位,例如回盲子宫内膜异位和卵巢植入物,诊断的金标准MRI也会出现漏诊和误诊。腹腔镜检对于深部组织异位的诊断有局限性且费用昂贵,从而限制了该方法的使用。目前已报道子宫内膜异位症相关标记物有多种,如血清学标记物CA125和IL-6、子宫内膜神经元免疫组化标志物 PGP9.5、尿液VDBP和NNE、内膜组织标记物P450以及相关的循环microRNA等。由于缺乏高特异性和/或高灵敏度,上述标记物均不能作有效诊断的分子标记物,且尚缺乏同时能够对子宫内膜异位症进行分型的分子标记物。因此,寻找高特异性、高灵敏度的子宫内膜异位症检测和分型标记物,完善针对子宫内膜异位症的诊断方法显得尤为重要。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种甲基化位点在子宫内膜异位症诊断和分型中的应用,所述甲基化位点为chr21:21632839,其在作为子宫内膜异位症诊断和分型的分子标记物时具有较好的灵敏度和特异性,准确率高。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案。
甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选检测腺肌症的试剂中的应用。
本发明还提供了甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选检测卵巢子宫内膜异位症的试剂中的应用。
本发明还提供了甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选鉴别腺肌症和卵巢子宫内膜异位症的试剂中的应用。
本发明还提供了检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备腺肌症检测产品中的应用。
本发明还提供了检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备卵巢子宫内膜异位症检测产品中的应用。
本发明还提供了检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备鉴别腺肌症和卵巢子宫内膜异位症的产品中的应用。
本发明还提供了一种子宫内膜异位症检测或分型试剂盒,所述试剂盒包含检测甲基化位点chr21:21632839在生物样本中的甲基化水平的试剂。
在一些实施例中,所述试剂是应用于以下检测方法中的至少一种的试剂:ddPCR法、甲基化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、甲基化特异PCR。
在一些实施例中,所述生物样本为组织样本。
本发明首次通过研究证实,与在位子宫内膜组织相比,甲基化位点chr21:21632839在腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平显著降低,且在腺肌症组织中的甲基化水平显著显著高于卵巢子宫内膜异位组织。进一步地,ROC曲线分析结果显示甲基化位点chr21:21632839在用于诊断腺肌症时,AUC为0.913,灵敏度为83.3%,特异性为91.7%;在用于鉴别卵巢子宫内膜异位症和腺肌症时,AUC为0.981,灵敏度为100%,特异性为89.6%;在用于诊断卵巢子宫内膜异位症时,AUC为0.991,灵敏度为95.8%,特异性为100%。说明甲基化位点chr21:21632839可作为子宫内膜异位症诊断和分型的特异性分子标记物,诊断灵敏度和特异性好,准确率高。本发明为子宫内膜异位症的诊断和分型提供了新的特异性甲基化标记物,完善了子宫内膜异位症的诊断方法,应用前景广阔。
附图说明
图1为甲基化位点chr21:21632839在在位子宫内膜组织、腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平检测结果。
图2为甲基化位点chr21:21632839在用于诊断腺肌症时的ROC曲线。
图3为甲基化位点chr21:21632839在用于鉴别卵巢子宫内膜异位症和腺肌症时的ROC曲线。
图4为甲基化位点chr21:21632839在用于诊断卵巢子宫内膜异位症时的ROC曲线。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块,而是可选地还包括没有列出的步骤,或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例检测甲基化位点chr21:21632839在在位子宫内膜组织、腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平。共采集在位子宫内膜组织样本48份、腺肌症组织样本12份和卵巢子宫内膜异位组织样本48份。按以下步骤进行检测:
1.收集组织和DNA提取:
收集腹腔镜检和/或宫腔镜检切下的手术组织,将组织切成0.5 cm3/块,56℃条件下蛋白酶K消化过夜。之后根据QIAamp DNA Mini Kit说明书(cat#5130;Qiagen,Germany)提取基因组DNA,并通过QUBIT进行定量。
重亚硫酸盐转化处理DNA:
用EZ DNA Methylation-Lightning Kit (cat# D5046; Zymo Research, USA)试剂盒将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶继而转化为胸腺嘧啶,从而区分DNA中甲基化位点和未甲基化的位点,便于后续的检测。具体步骤如下:
①先在PCR 96孔板中加入20ul合格的游离DNA和130 ul的Lightning ConversionReagent,用枪头吹匀、封膜。将孔板放入PCR仪中进行下表1所示的程序:
②将Zymo-Spin IC过滤柱置于收集管,并在过滤柱里加600 ulM-BindingBuffer,以备下步用。
③反应完成后,将PCR反应液逐一加入含有M-Binding Buffer 的过滤柱。然后放入高速离心机,室温14000 g离心1 min,弃去收集管中的废液。加100 ul M-Wash Buffer于过滤柱中,室温14000 g离心1 min,弃去收集管中的废液。
④加入200 ul L-Desulphonation Buffer,置于室温20 mins。之后放入高速离心机中,室温14000 g离心1 min,去除收集管中的废液。再加200 ul M-Wash Buffer于过滤柱中,然后放入高速离心机中,室温14000 g离心1min,弃去收集管中的废液。
⑤在柱中加200 ul M-Wash Buffer,之后放入高速离心机中,室温14000 g离心1min,去除收集管中的废液。装回过滤柱,室温14000 g离心1 min以去除过滤柱中的多余液体。
⑥将过滤柱置于干净的1.5 ml离心管中,加10 ul M-Elution Buffer,室温16000g离心1 min。收集洗脱的Bis-DNA 溶液进行下一步实验。
高通量测序
使用Novaseq6000 S4 Reagent Kit (Illumina) 建库用试剂盒构建甲基化测序文库,然后使用 Illumina NovaSeq 6000 测序仪进行甲基化测序。委托北京贝瑞和康生物技术有限公司进行测序和数据分析。
数据分析结果显示,甲基化位点chr21:21632839在在位子宫内膜组织、腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平存在显著差异。
我们利用ddPCR法对测序结果进行验证。根据以下公式计算样本的甲基化率:甲基化率(%)=甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)×100%。结果如图1所示,与在位子宫内膜组织相比,甲基化位点chr21:21632839在腺肌症组织和卵巢子宫内膜异位组织中的甲基化水平显著降低,且在腺肌症组织中的甲基化水平显著显著高于卵巢子宫内膜异位组织。提示甲基化位点chr21:21632839可作为子宫内膜异位症诊断和分型标记物。
进一步地,为了明确甲基化位点chr21:21632839的诊断价值,我们进行了ROC曲线分型,结果表明,甲基化位点chr21:21632839在用于诊断腺肌症时,AUC为0.913,灵敏度为83.3%,特异性为91.7%(图2);在用于鉴别卵巢子宫内膜异位症和腺肌症时,AUC为0.981,灵敏度为100%,特异性为89.6%(图3);在用于诊断卵巢子宫内膜异位症时,AUC为0.991,灵敏度为95.8%,特异性为100%(图4)。
综上所述,甲基化位点chr21:21632839可作为子宫内膜异位症诊断和分型的特异性分子标记物,诊断灵敏度和特异性好,准确率高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选检测腺肌症的试剂中的应用。
2.甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选检测卵巢子宫内膜异位症的试剂中的应用。
3.甲基化位点chr21:21632839作为分子标记物在制备和/或筛选鉴别腺肌症和卵巢子宫内膜异位症的试剂中的应用。
4.检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备腺肌症检测产品中的应用。
5.检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备卵巢子宫内膜异位症检测产品中的应用。
6.检测甲基化位点chr21:21632839的甲基化水平的试剂在制备鉴别腺肌症和卵巢子宫内膜异位症的产品中的应用。
7.一种子宫内膜异位症检测或分型试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含检测甲基化位点chr21:21632839在生物样本中的甲基化水平的试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂是应用于以下检测方法中的至少一种的试剂:ddPCR法、甲基化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、甲基化特异PCR。
9.如权利要求7~8任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述生物样本为组织样本。
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