CN115386097B

CN115386097B - 一种铪基金属有机框架材料及其制备方法和造影成像应用

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Publication number: CN115386097B
Application number: CN202210995163.2A
Authority: CN
Inventors: 王加兴; 付梓; 奚岩; 倪大龙
Original assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115386097A

Abstract

本发明公开了一种铪基金属有机框架材料及其制备方法和造影成像应用。本发明制备的Hf‑nMOFs纳米颗粒具有良好的介孔结构，可以有效进行药物负载。本发明利用金属有机框架组成的可调性与高Z元素铪具有出色的X射线衰减能力的特点，将铪基分子引入到金属有机框架结构中来制备具有增强CT成像的造影剂。此外，本发明制备的纳米颗粒3‑BrPA@Hf‑nMOFs的平均直径为142nm，和现有纳米颗粒相比本发明制备的纳米颗粒大小更为合适，能最大程度的通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位。

Description

一种铪基金属有机框架材料及其制备方法和造影成像应用

技术领域

本发明涉及医用纳米材料技术领域，尤其涉及一种铪基金属有机框架材料及其制备方法和造影成像应用。

背景技术

X射线计算机断层扫描(CT)是现代医学中最强大的非侵入性诊断成像技术之一，为广泛的疾病提供了高分辨率的解剖学诊断。然而，临床上用作CT造影剂的碘化分子在体内的循环时间相对较短，这大大限制了这种技术在特定目标成像和血管成像方面的应用。此外，这些药剂的使用也会出现不良反应。因此，生物医学研究人员已经投入了巨大的努力来解决这些问题。在过去几十年中，纳米科学的进步为成像创造了新的范例。纳米材料的独特特性，如延长循环半衰期、在肿瘤部位被动积聚、易于表面修饰以及将多种不同的功能整合到一个粒子中，使它们在体内应用中具有明显的优势，如于癌症、全身性疾病和血管疾病等的精确高分辨率解剖分期和治疗监测。然而，关于利用纳米材料进行CT成像的研究在制备具有良好的生物相容性、高对比效果、较长的体内循环时间和在生理环境中的长期胶体稳定性的低成本纳米颗粒CT对比剂方面存在挑战。

金属有机框架(MOFs)是一类由金属离子和有机配体或团簇通过配位键形成的结晶性混合材料。特别是纳米级金属有机框架(nMOFs)由于其具有高孔隙率、多功能性和良好的生物相容性，被广泛应用于纳米医学领域，包括药物递送、生物分子检测、声动力疗法、放射增敏以及生物医学成像。nMOFs的配体可以与具有不同生物功能的生物结合物相连，通过增强的渗透和滞留(EPR)效应或主动靶向癌细胞在肿瘤部位聚集。另外，nMOFs上的金属离子或金属簇也使它们成为磁共振成像、计算机断层扫描或其他成像方式的可行候选对比剂。因此，nMOFs在生物医学应用方面具有巨大的潜力，特别是药物输送、生物医学成像以及作为治疗平台和协同组合疗法的潜在作用。

如今，恶性肿瘤已成为人类生命和健康的最大威胁之一。由于放射治疗具有非侵入性、空间选择性和治疗时间短等特点，在临床上已被广泛用于治疗癌症，尤其是老年患者。理论上，在放射治疗(RT)过程中，电离辐射(主要是X射线)和癌组织(主要是H2O分子)之间的相互作用会产生羟基自由基(·OH)，它可以对癌细胞造成严重损伤，随后诱发细胞凋亡和增殖死亡。然而，相当一部分患者在接受RT治疗后仍会出现肿瘤复发、转移和治疗抵抗。因此，有必要开发更有效的方法来提高RT的效果。

虽然RT抗性的具体机制复杂而不明确，但许多研究指出，细胞成分的旺盛生物合成在支持癌症RT抗性方面起着重要作用。癌细胞经X射线处理后，会合成大量的脂质、核酸和蛋白质来修复受损的细胞器、细胞膜、染色体等。显然，生物合成的过程将消耗大量的三磷酸腺苷(ATP)。一般来说，对于癌细胞，ATP主要来自糖酵解过程(沃伯格效应)。此外，糖酵解的产物包括丙酮酸和乳酸将分别进一步参与脂质生物合成和肿瘤转移的过程。因此，降低糖酵解的速度有很大的潜力来干扰生物合成，从而提高RT的治疗效果。在糖酵解过程中，己糖酶是糖酵解的第一限速酶，也与肿瘤的特征代谢、细胞增殖和凋亡调节密切相关。一些研究表明，己糖激酶II(HKII)在多种肿瘤组织中高表达，而在正常组织中表达较低。因此，HKII是一个降低葡萄糖代谢率的潜在靶点。在过去的十年中，一些小分子的HKII抑制剂，如2-脱氧葡萄糖(2-DG)、洛尼达明和3-溴丙酮酸(3-BrPA)都显示出良好的抗癌效果。遗憾的是，它们的临床应用受到了肿瘤组织积累的限制。

综上所述，通过根据X射线成像的基本原理优化纳米粒子中的对比元素，研究一种具有良好成像性能的纳米粒子CT造影剂对于生物医学应用和发展具有重要意义和价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种铪基金属有机框架材料及其制备方法和造影成像应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明第一方面是提供一种铪基金属有机框架材料，所述铪基金属有机框架材料为铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒。

进一步地，所述铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒的流体动力学直径为120～140nm。

进一步地，所述铪基金属有机框架材料可负载生化试剂3-溴丙酮酸，所述3-溴丙酮酸的负载量为79.1～91.9mg/g。

本发明第二方面是提供上述铪基金属有机框架材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将四氯化铪、中-四(4-羧基苯基)卟吩分别加入N,N-二乙基甲酰胺中，超声处理15～20min，得到溶液一和溶液二，然后将所述溶液一、所述溶液二与苯甲酸置于反应釜中，超声处理30～40min，然后搅拌0.5-1h，混合均匀；

步骤二，加热，进行溶剂热反应，反应结束后冷却至室温；然后将产物进行离心、洗涤，得到铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒。

进一步地，所述步骤一中四氯化铪与中-四(4-羧基苯基)卟吩的摩尔比为(2～3):1。

进一步地，所述步骤一中反应条件为避光环境，溶剂热反应体系的物料体积与反应器容积之比为(0.5～0.7):1。

进一步地，所述步骤二中溶剂热反应的温度为110～130℃，反应时间为40～55h。

进一步地，所述铪基金属有机框架材料可负载生化试剂3-溴丙酮酸，具体步骤为：将3-溴丙酮酸溶液滴加入快速搅拌的Hf-nMOFs/DMF溶液中，并继续搅拌反应12～24h，透析纯化后得到3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒。

进一步地，所述步骤二中反应产物采用N,N-二甲基甲酰胺进行洗涤。

进一步地，所述Hf-nMOFs与3-溴丙酮酸的质量比为(1～5):1。

进一步地，所述3-溴丙酮酸溶液采用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

进一步地，所述透析纯化所用透析袋的截留分子量为3500Da。

本发明第三方面是提供上述铪基金属有机框架材料在造影成像中的应用，具体是在制备基于CT造影成像进行术前诊断以及术中定位与治疗的药物中的应用。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明制备的Hf-nMOFs纳米颗粒具有良好的介孔结构，可以有效进行药物负载。本发明利用金属有机框架组成的可调性与高Z元素铪具有出色的X射线衰减能力的特点，将铪基分子引入到金属有机框架结构中来制备具有增强CT成像的造影剂。

此外，本发明制备的纳米颗粒3-BrPA@Hf-nMOFs的平均直径为142nm，和现有纳米颗粒相比本发明制备的纳米颗粒大小更为合适，能最大程度的通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位。

本发明方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片；

图2为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒的明场STEM图像及相应的元素映射图谱；

图3为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒的N₂等温吸附-脱附曲线图；

图4为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs和3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的流体动力学直径分布图；

图5为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs和3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的Zeta电势；

图6为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒的体外CT成像及HU值-浓度线性曲线；

图7为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒经瘤内注射入骨肉瘤裸鼠前、后的CT成像效果图；

图8为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒经尾静脉注射入骨肉瘤裸鼠前、后的CT成像效果图；

图9为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒在不同浓度下与MG63或HUVEC细胞共孵育24h的细胞毒性柱状图；

图10为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs、3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒与3-BrPA在接受或未接受X射线照射后同MG63细胞共孵育4h，细胞经Calcein-AM/PI染色会后的激光共聚焦显微镜图像，(-)表示未接受X射线照射，(+)表示细胞接受了X射线照射；

图11为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs纳米颗粒经尾静脉注射入昆明小鼠前、后的心肝脾肺肾各器官经H&E染色的组织切片图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

将20mg的四氯化铪(HfCl₄)和19mg的中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)分别分散于10mL的N,N-二乙基甲酰胺(DEF)中，超声处理15min使其完全溶解。然后，将上述准备好的两种溶液与苯甲酸(600毫克)一起加入到一个50mL的水热反应釜中，超声处理0.5h后继续磁力搅拌0.5h使其完全混合。接着将反应釜密封并放入120℃烘箱进行溶剂热反应，待48小时反应结束后缓慢冷却至室温，利用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)进行洗涤并将得到的反应产物铪基金属有机框架(Hf-nMOFs)储存在DMF中以备后续使用。将上述得到的Hf-TCPP(1mg/mL，10mL)与3-BrPA溶液(0.5mg/mL，10mL)混合，避光条件下进行磁力搅拌并反应过夜，然后通过透析法去除多余的3-BrPA以得到最终所需产物铪基金属有机框架材料(3-BrPA@Hf-nMOFs)。

图1为上述实施例1所制得的铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒分散于乙醇中的TEM图谱，由图1可见：所制得的纳米颗粒为圆形。

图2为上述实施例1所制得的铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒的明场STEM图像及相应的元素映射图谱，由图2可见：所制得的纳米颗粒基体中均匀地分布着C、O与Hf三种元素，说明Hf-nMOFs的成功制备。

图3为上述实施例1所制得的铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒的N₂等温吸附-脱附曲线图，由图3可见：所制得的纳米颗粒的吸附等温曲线为IV型等温线，表明Hf-nMOFs为介孔结构，并具有良好的有效装载后续实验所需药物的潜力。

图4为上述实施例1所制得的Hf-nMOFs和3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的流体动力学直径分布图，由图4可见：Hf-nMOFs纳米颗粒的平均流体动力学直径约为122nm，而3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的平均流体动力学直径相较于Hf-nMOFs略有增加，为142nm，同时表明了Hf-nMOFs的成功制备。

图5为上述实施例1所制得的Hf-nMOFs和3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的Zeta电势，由图5可见：Hf-nMOFs纳米颗粒的zeta电位为29.87±2.71mV，3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒的表面电荷则测量为-50±3.92mV，证实了3-BrPA的成功负载。

CT成像应用效果实验

1)实验材料及仪器：实施例1所制备的Hf-nMOFs纳米颗粒。

2)实验动物：Balb/c裸鼠，平均体重20g，6周龄。

3)骨肉瘤裸鼠模型：MG63细胞(5×106分散在100μLPBS中)经皮下注射植入裸鼠右侧上肢部位，生长10-14天。

4)实验方法：骨肉瘤裸鼠经水合氯醛进行腹腔麻醉，然后经瘤内注射或尾静脉注射Hf-nMOFs后观察CT成像效果。

5)实验结果：

图6为Hf-nMOFs纳米颗粒体外CT成像图，由图6可见：CT信号随着Hf元素浓度的增加而增强，CT图像的亮度也随之增强。此外，Hounsfield单位(HU)和Hf元素浓度之间有很好的线性关系。

图7为Hf-nMOFs纳米颗粒经瘤内注射前后的CT成像性能对比图，由图7可见：与注射前相比，在注射纳米颗粒后可以在肿瘤部位观察到强烈的CT信号，能够与周围正常组织明显区分开来，说明Hf-nMOFs纳米颗粒具有高效的体内CT成像性能。

图8为Hf-nMOFs纳米颗粒经尾静脉注射前后的CT成像性能对比图，由图8可见：肿瘤部位的成像对比度随着时间的推移逐渐增加。在注射12h后，肿瘤部位对比度增强最为明显，CT信号最亮。同时，在注射24h后仍然可以观察到微弱的CT信号。上述结果说明Hf-nMOFs纳米颗粒可以作为一种理想的CT造影剂用于癌症的术前诊断与术中定位。

毒性评价实验

1、体外细胞毒性试验

1)实验材料：实施例1所制备的Hf-nMOFs纳米颗粒。

2)实验方法：使用CCK-8法对细胞存活率进行评价，具体实验方法如下：将骨肉瘤细胞(MG63)或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以1×10⁴/孔的密度接种到96孔板中，并在细胞培养箱中培养过夜。弃去初始培养基，然后添加含有Hf-nMOFs的DMEM完全培养基(100μL/孔)继续培养24h，纳米颗粒浓度分别为0、1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL。接着向孔板中中加入CCK-8继续孵育2h，然后使用酶标仪(Varioskan LUX，Thermo，USA)测试各实验组在450nm处的吸光度，统计实验结果并计算分析细胞活力。

3)实验结果

图9为Hf-nMOFs纳米颗粒在不同浓度下与MG63或HUVEC细胞共孵育24h的细胞毒性柱状图，由图9可见：即使与Hf-nMOFs在100μg/mL的浓度下共同培养24h后，MG63细胞的存活率仍在90％以上，同时与HUVEC细胞与Hf-nMOFs共孵育后得到的细胞存活率结果一致，表明Hf-nMOFs具有低的细胞毒性。

2、活死细胞染色实验

1)实验材料：实施例1所制备的Hf-nMOFs、3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒，及3-BrPA。

2)实验方法：将骨肉瘤细胞(MG63)以1×10⁴/孔的密度接种到共聚焦皿中，并补足每皿1.5mL的培养液，在细胞培养箱中培养过夜。弃去初始培养基，然后分别添加1.5mL含有3-BrPA、Hf-nMOFs或3-BrPA@Hf-nMOFs的培养基并接受4Gy的X射线照射，然后继续培养4h。使用PBS清洗2次，加入1mL配制好的Calcein-AM(浓度为2μM)，37℃避光孵育20min。接着向上述染色细胞中加入PI原液5μL，室温下避光染色5min。用PBS清洗细胞2次后，使用激光共聚焦显微镜进行观察检测。

3)实验结果：

图10为本发明实施例1所制得的Hf-nMOFs、3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒及3-BrPA在接受或未接受X射线照射后同MG63细胞共孵育4h，细胞经Calcein-AM/PI染色会后的激光共聚焦显微镜图像。(-)表示未接受X射线照射，(+)表示细胞接受了X射线照射。由图10可见，未经X射线照射的实验组中未观察到明显的细胞毒性，这也说明了Hf-nMOFs纳米颗粒具有细胞毒性低、生物医学应用潜力大的优势。值得注意的是Hf-nMOFs+X-ray实验组显示出了强烈的细胞毒性，证明了其出色的辐射增敏作用。此外，与3-BrPA@Hf-nMOFs共孵育的细胞在暴露于X射线照射后展现出最强的细胞毒性。

3、体内组织毒性试验

1)实验材料：实施例1所制备的Hf-nMOFs纳米颗粒。

2)实验动物：昆明小鼠，雄性，平均体重14g，7周龄。

3)实验方法：将Hf-nMOFs纳米颗粒的生理盐水溶液通过尾静脉注射到昆明小鼠体内，注射剂量为别为5、10和20mg/kg。并对注射纳米颗粒前、后(实验周期为28天)的昆明小鼠的主要器官的组织切片进行H&E染色以观察。

4)实验结果

图11为昆明小鼠注射Hf-nMOFs纳米颗粒前、后的心肝脾肺肾各器官经H&E染色的组织切片图，由图11可见：昆明鼠在注射Hf-nMOFs前、后，心肝脾肺肾各器官没有发现明显的病理异常，表明了该纳米材料在活体水平上的低毒性，具有良好的生物相容性。

综上所述，本发明制备的铪基金属有机框架纳米颗粒具有优异的生物相容性和出色的CT成像性能，对于医学诊断技术的发展和应用具有重要价值和意义。

上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种负载有3-溴丙酮酸的铪基金属有机框架，其特征在于，所述铪基金属有机框架为铪基金属有机框架Hf-nMOFs纳米颗粒；所述3-溴丙酮酸为生化试剂3-BrPA，所述3-溴丙酮酸的负载量为79.1~91.9 mg/g，纳米颗粒3-BrPA@Hf-nMOFs的平均直径为142 nm；

所述铪基金属有机框架的制备方法包括如下步骤：

步骤一，将四氯化铪、中-四(4-羧基苯基)卟吩分别加入N,N-二乙基甲酰胺中，超声处理，得到溶液一和溶液二，然后将所述溶液一、所述溶液二与苯甲酸置于反应釜中，超声处理，然后搅拌混合均匀；

2.根据权利要求1所述的负载有3-溴丙酮酸的铪基金属有机框架，其特征在于，所述步骤一中四氯化铪与中-四(4-羧基苯基)卟吩的摩尔比为（2~3）:1。

3. 根据权利要求1所述的负载有3-溴丙酮酸的铪基金属有机框架，其特征在于，所述步骤二中溶剂热反应的温度为110~130 ℃，反应时间为40~55h。

4. 根据权利要求1所述的负载有3-溴丙酮酸的铪基金属有机框架，其特征在于，所述铪基金属有机框架负载生化试剂3-溴丙酮酸的具体步骤为：将3-溴丙酮酸溶液滴加入快速搅拌的Hf-nMOFs/DMF溶液中，并继续搅拌反应12~24 h，透析纯化后得到3-BrPA@Hf-nMOFs纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的负载有3-溴丙酮酸的铪基金属有机框架，其特征在于，所述Hf-nMOFs与3-溴丙酮酸的质量比为（1~5）:1。