CN115369084A - 一种脂肪间充质干细胞培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β‑巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺。本发明提供的脂肪间充质干细胞培养基在培养基中添加甲基莲心碱、海洋球石藻提取物，无需添加动物血清，并且有效提高脂肪间充质干细胞的增殖速度，缩短脂肪间充质干细胞的培养周期，培养得到的脂肪间充质干细胞具有良好的分化能力，短时间内可为临床提供大量可用细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞培养基及其应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，起源于中胚层，是一种多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有强大的自我更新和多向分化能力，具有在体外分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞等多种细胞的能力。
间充质干细胞来源丰富，广泛存在于骨髓、脂肪、脐带等组织，具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且具有低免疫原性。正是由于拥有这些特性，使得间充质干细胞能够用于科学研究与临床应用，如细胞治疗、再生医学、药物筛选、基因治疗载体的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞等。其中，人脂肪来源间充质干细胞被认为是具备更高可塑性和更低免疫原性的原始间充质干细胞群，方便易取，在新兴转化医学中展现出广阔的应用前景。
脂肪间充质干细胞作为种子细胞，首先要解决的是体外增殖活力，以快速扩增出大量的细胞，用于组织工程和医学领域。但是，脂肪间充质干细胞在常规培养条件下，扩增速度还不能满足需求。
培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，然而，目前外培养脂肪间充质干细胞需要在培养基中添加胎牛或小牛血清，为动物源性，其异源和未知毒性限制了临床应用。因此，如何克服动物异源性血清影响，改进脂肪间充质干细胞培养基，提高其扩增效率和同时保持其良好干性，是提升临床疗效的关键。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞培养基，不添加动物血清，提高了脂肪间充质干细胞的增殖速度。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺。
优选的，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱3.6-6.9ng/mL、海洋球石藻提取物2.4-4.5ng/mL、亚硒酸钠6.5-9.5ng/mL、β-巯基乙醇2.8-5μg/mL、胰岛素11-15μg/mL、谷氨酰胺5-10μg/mL。
优选的，各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱5.1ng/mL、海洋球石藻提取物3.7ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL。
优选的，所述海洋球石藻提取物的制备过程如下：向冻干的海洋球石藻粉中加入70-75％乙醇溶液，在室温下进行超声预处理，然后60-70℃加热2-3h，过滤，收集滤液经真空浓缩、冷冻干燥得到海洋球石藻提取物。
优选的，海洋球石藻粉和乙醇溶液的质量比为1:10-15。
优选的，超声频率为40-50kHz，时间为1-2h。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述脂肪间充质干细胞培养基的应用，包括以下步骤：将原代脂肪间充质干细胞用所述培养基重悬，进行扩增培养，收集培养得到的脂肪间充质干细胞。
优选的，脂肪间充质干细胞的培养在37℃，5％CO2的培养箱中进行。
优选的，培养基中脂肪间充质干细胞的密度为1-6×104个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞培养基，在培养基中添加甲基莲心碱、海洋球石藻提取物，无需添加动物血清，并且有效提高脂肪间充质干细胞的增殖速度，缩短脂肪间充质干细胞的培养周期，培养得到的脂肪间充质干细胞具有良好的分化能力，短时间内可为临床提供大量可用细胞。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明所用原代脂肪间充质干细胞通过以下方法分离得到：
(1)将离体的脂肪组织加入D-Hanks缓冲液清洗后离心，收集脂肪组织加入2倍体积的1％II型胶原酶震荡消化20min；
(2)结束消化后，加入1倍体积的D-Hanks缓冲液稀释后离心，收集底层的细胞沉淀，加入原代培养基中重悬(DMEM/F12，10％FBS)，细胞密度为1×104个/mL，接种至培养瓶中在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；
(3)当细胞融合度达到80％后，加入胰酶溶液消化细胞，加入D-Hanks缓冲液稀释后离心，即得原代脂肪间充质干细胞，备用。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱5.1ng/mL、海洋球石藻提取物3.7ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
上述海洋球石藻提取物的制备过程如下：向冻干的海洋球石藻粉中加入70％乙醇溶液，海洋球石藻粉和乙醇溶液的质量比为1:10，在室温下进行超声预处理，超声频率为40kHz，时间为2h，然后60℃加热3h，过滤，收集滤液经真空浓缩、冷冻干燥得到海洋球石藻提取物。
上述脂肪间充质干细胞培养基的应用，将原代脂肪间充质间充质干细胞用上述培养基重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱进行扩增培养，每两天更换一次培养基。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱3.6ng/mL、海洋球石藻提取物2.4ng/mL、亚硒酸钠6.5ng/mL、β-巯基乙醇2.8μg/mL、胰岛素11μg/mL、谷氨酰胺5μg/mL；
上述海洋球石藻提取物的制备过程如下：向冻干的海洋球石藻粉中加入70-75％乙醇溶液，海洋球石藻粉和乙醇溶液的质量比为1:12，在室温下进行超声预处理，超声频率为50kHz，时间为1h，然后65℃加热2h，过滤，收集滤液经真空浓缩、冷冻干燥得到海洋球石藻提取物。
上述脂肪间充质干细胞培养基的应用，将原代脂肪间充质间充质干细胞用上述培养基重悬，调整细胞密度为3×104个/mL，接种于T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱进行扩增培养，每两天更换一次培养基。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱6.9ng/mL、海洋球石藻提取物4.5ng/mL、亚硒酸钠9.5ng/mL、β-巯基乙醇5μg/mL、胰岛素15μg/mL、谷氨酰胺10μg/mL；
上述海洋球石藻提取物的制备过程如下：向冻干的海洋球石藻粉中加入70-75％乙醇溶液，海洋球石藻粉和乙醇溶液的质量比为1:15，在室温下进行超声预处理，超声频率为50kHz，时间为1h，然后70℃加热2h，过滤，收集滤液经真空浓缩、冷冻干燥得到海洋球石藻提取物。
上述脂肪间充质干细胞培养基的应用，将原代脂肪间充质间充质干细胞用上述培养基重悬，调整细胞密度为6×104个/mL，接种于T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱进行扩增培养，每两天更换一次培养基。
对比例1
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：海洋球石藻提取物3.7ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
对比例1其他均和实施例1相同。
对比例2
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：甲基莲心碱、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱5.1ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
对比例2其他均和实施例1相同。
对比例3
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
对比例3其他均和实施例1相同。
对比例4
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：海洋球石藻提取物8.8ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
对比例4其他均和实施例1相同。
对比例5
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分：甲基莲心碱、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺；各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱8.8ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL；
对比例5其他均和实施例1相同。
对比例6
一种脂肪间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基和添加在培养基中10％FBS；
对比例6其他均和实施例1相同。
试验例1
实施例1，对比例1至6中的细胞连续培养7d后采用Countstar细胞计数仪统计培养得到的脂肪间充质干细胞数量，各组T75培养瓶中细胞的初始接种量为1.0×105个，结果如表1所示
表1
| 组别 | 脂肪间充质干细胞数量(×10<sup>5</sup>个) |
| 实施例1 | 46.7 |
| 对比例1 | 31.2 |
| 对比例2 | 34.6 |
| 对比例3 | 15.2 |
| 对比例4 | 28.4 |
| 对比例5 | 35.1 |
| 对比例6 | 31.8 |
由表1可以看出，实施例1中收获的脂肪间充质干细胞数量最多，说明实施例1中的培养基在促进脂肪间充质干细胞增殖上效果最好。对比例1至5中分别省去了甲基莲心碱和海洋球石藻提取物中的一种或者两种后细胞数量明显减少，说明上述成分的添加可明显促进脂肪间充质干细胞的增殖，在短时间内可收获大量的细胞以满足临床需要。
分别取实施例1，对比例1至6中连续培养7d后的细胞去除培养基后加入人脂肪间充质干细胞成脂诱导培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司货号：PD-006)，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于12孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中进行成脂诱导，采用油红0染色法统计每组开始出现脂肪滴的诱导培养时间，结果如表2所示。
表2
| 组别 | 出现脂肪滴时间(d) |
| 实施例1 | 3 |
| 对比例1 | 5 |
| 对比例2 | 6 |
| 对比例3 | 9 |
| 对比例4 | 8 |
| 对比例5 | 4 |
| 对比例6 | 4 |
由表2可以看出实施例1的脂肪间充质干细胞在成脂诱导中最先出现脂肪滴，对比例1至6中所需时间较久，说明本发明培养得到的脂肪间充质干细胞分化能力更好。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：甲基莲心碱、海洋球石藻提取物、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、胰岛素、谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱3.6-6.9ng/mL、海洋球石藻提取物2.4-4.5ng/mL、亚硒酸钠6.5-9.5ng/mL、β-巯基乙醇2.8-5μg/mL、胰岛素11-15μg/mL、谷氨酰胺5-10μg/mL。
3.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，各成分在基础培养基中的用量分别为：甲基莲心碱5.1ng/mL、海洋球石藻提取物3.7ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL、β-巯基乙醇4.3μg/mL、胰岛素13μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL。
4.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，所述海洋球石藻提取物的制备过程如下：向冻干的海洋球石藻粉中加入70-75％乙醇溶液，在室温下进行超声预处理，然后60-70℃加热2-3h，过滤，收集滤液经真空浓缩、冷冻干燥得到海洋球石藻提取物。
5.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，海洋球石藻粉和乙醇溶液的质量比为1:10-15。
6.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞培养基，其特征在于，超声频率为40-50kHz，时间为1-2h。
7.根据权利要求1至6任一项所述脂肪间充质干细胞培养基的应用，其特征在于，包括以下步骤：将原代脂肪间充质干细胞用权利要求1至6任一项所述培养基重悬，进行扩增培养，收集培养得到的脂肪间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述脂肪间充质干细胞培养基的应用，其特征在于，脂肪间充质干细胞的培养在37℃，5％CO2的培养箱中进行。
9.根据权利要求7所述脂肪间充质干细胞培养基的应用，其特征在于，培养基中脂肪间充质干细胞的密度为1-6×104个/mL。
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