CN115364046B - 一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的温敏溶胶包括维拉帕米和用于负载维拉帕米的三嵌段聚合物；其中，三嵌段聚合物为聚(D,L‑乳酸‑乙醇酸)‑聚(乙二醇)‑聚(D,L‑乳酸‑乙醇酸)，三嵌段聚合物中各嵌段的分子量比例为1750：1500：1750；该温敏溶胶具有当温度从34℃升至37℃时从溶胶转变为凝胶，并缓释维拉帕米的特性；且当温度从37℃降至34℃时从凝胶转变为溶胶，并大量释放维拉帕米的特性。当出现血管痉挛引起温度降低时，可实现药物的爆裂释放和快速扩散。该温敏溶胶在治疗血管痉挛的同时，可以起到缓解组织损伤，动态调控血管外微环境以促进体内组织存活的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶及其制备方法与应用。
背景技术
自20世纪70年代以来，我国显微外科技术得到迅猛发展，血管组织移植成为血管重建的常规方法。然而显微外科手术容易出现血管痉挛，是移植手术中极为常见的症状。如果长时间的血管痉挛得不到缓解，就会出现血流中断，并引发血栓形成，造成手术失败，严重威胁人类的生命。因此血管痉挛一直是显微外科医生面临的一大重要挑战。
国内外学者对血管痉挛的诱发因素进行了大量研究，包括直接血管操作、血管代谢失衡和内环境改变等，然而血管痉挛的内部机制极其复杂，目前尚未完全清楚。血管痉挛虽然在显微外科手术中十分常见，但其发生具有不可预测性。这对于血管痉挛的预防和抑制造成了极大的困难，目前仍处于不断研究阶段。
一般而言，经验丰富的显微外科医生会在手术后选择局部使用解痉药来预防和抑制血管痉挛，然而这种做法仅被认为是经验性用药，并没有足够多的证据显示局部解痉药使用的科学性；同时，不同的药物在使用过程中疗效差异较大，且容易产生各种副作用。因此，临床上对解痉药物的选择并未形成统一的标准，开发新的具有更高疗效和更小副作用的解痉药成为显微外科医学亟待攻破的一道难关。
冷冰等进行的几项动物实验显示，将己酮可可碱局部应用于痉挛后的血管时，能明显提高血管血流速度，改善随意皮瓣血液流变性，降低随意皮瓣坏死率。但由于后续的研究资料较少，药物的有效性缺乏实质性的证据支持；同时该药的不良反应发生率较高，临床上仍然是选择谨慎使用此药作为解痉药。
氨力农是选择性磷酸二酯酶Ⅲ抑制剂中的代表药物之一，可产生血管舒张效应。Ichioka对氨力农进行的动物实验验证了此药的有效性，进一步的临床应用也表明，在痉挛后的血管周边局部应用氨力农，可减轻术中血管痉挛，同时在增加移植皮瓣血流方面，其药效持久而强劲。然而一项最新的病例报告指出，皮瓣移植术后使用氨力农，致使用药期间出现心律失常。因此显微外科中应用此药时，仍然要考虑该药存在的严重副作用。
利多卡因作为一种局部麻醉药，能够产生血管扩张效应，然而相应的研究表明，利多卡因具有浓度依赖性双相作用，其在低浓度下表现出促痉挛效果，而在高浓度下具有解痉挛作用。在抗血管痉挛方面，其浓度的选择虽有实验室证据，但仍需要得到临床的进一步检验。
据报道，通过对钙离子的阻滞，使细胞内钙浓度下降，可以有效抑制血管平滑肌收缩。研究表明，在机械力诱发的大鼠血管痉挛模型中，局部滴加10％硫酸镁的效果极佳，表现为显著减少血管痉挛时长，甚至逆转血管痉挛形成超灌注状态。然而在肾上腺素血管痉挛模型中，10％硫酸镁局部应用后并没有改善局部灌注，因此对于使用10％硫酸镁作为解痉挛药物的适应症，仍有待进一步研究。
另一种钙离子阻滞剂是尼卡地平，此药可以通过降低血管平滑肌细胞内Ca2+浓度，而产生血管舒张效应，然而在Evans等的研究中，血管痉挛后局部使用尼卡地平并未改善血管痉挛状态。目前尼卡地平解痉挛的研究资料较少，仍无足够多的证据用以评价该药的有效性。
维拉帕米是L-型钙通道的拮抗剂，已有研究表明，在机械力血管痉挛模型中局部使用维拉帕米，可明显改善痉挛状态，增加血流灌注，一项临床回顾性资料也显示了此药的安全有效性，但临床上并未广泛使用维拉帕米作为解痉药。
临床上最常使用的一种经验性解痉药是罂粟碱，其解痉挛效果在体内和体外实验已得到证实。肌内注射罂粟碱可以显著扩张血管，从而纠正血管痉挛。但罂粟碱的使用仍然存在以下问题：1)血管部位药物利用率低；2)难以保证局部所需的持续药物量；3)仍然存在不良反应。
随着药物的二次开发，越来越多的药物被报道具有解痉效果，然而对解痉药物的研究和开发，仍然面临着诸多工作。如何更好地提高药物的利用率，以及如何保证血管痉挛时局部所需的持续药物量，成为亟待解决的技术问题。另一方面，现有的解痉挛药的供应存在温度响应性较差，无法应对血管痉挛引起的温度降低造成的组织损伤的问题，同时对于适用于不同模型的血管痉挛药物的开发，仍有待进行大量研究。
综上所述，能够高效抗血管痉挛的解痉药物尚处于研究阶段，目前在临床上仍未形成统一的标准。同时，针对于解痉药的药物递送系统也少有涉及。
由于外科手术移植完成后，极易发生血管痉挛，而一旦发生血管痉挛就需要及时在血管部位给予大量的解痉药来缓解症状并进行治疗，以保证移植后组织的存活。然而现有的药物递送体系如常用的载药水凝胶，仅能实现在人体内局部进行凝胶来实现解痉药的缓释，而无法做到对负载其中的解痉药在血管发生痉挛后可实现在血管局部实现大量药物的可控释放。该类药物递送体系的开发成为解痉药开发和利用的一大难点，如果突破，将会很好解决现有临床采用的解痉药存在的药物利用度不高、治疗效果较差、副作用明显的问题。
因此，对于新的解痉药物的开发，更重要的对于解痉药药物递送体系的开发，才能更好地实现对药物的高效利用，以更好缓解和治疗血管痉挛，并起到缓解组织损伤的作用。而该问题成为现阶段治疗血管痉挛亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，提供一种能够针对于解痉药进行很好递送的载药体系，一方面解决现有的解痉挛药往往药物利用率低、局部持续药物释放量不够、大量用药导致副作用增加的问题；另一方面解决现有的针对于解痉挛药的药物递送体系存在无法在血管痉挛局部大量释放药物，无法应对血管痉挛引起的温度降低造成的组织容易损伤的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的首要目的是提供一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶，所述温敏溶胶包括维拉帕米和用于负载维拉帕米的三嵌段聚合物；其中，所述三嵌段聚合物为聚(D,L-乳酸-乙醇酸)-聚(乙二醇)-聚(D,L-乳酸-乙醇酸)，该三嵌段聚合物中各嵌段的分子量比例为1750：1500：1750；所述温敏溶胶具有当温度从34℃升至37℃时从溶胶转变为凝胶，并缓释维拉帕米的特性；且当温度从37℃降至34℃时从凝胶转变为溶胶，并大量释放维拉帕米的特性。
上述三嵌段聚合物是由聚(D,L-乳酸-乙醇酸)、聚(乙二醇)和聚(D,L-乳酸-乙醇酸)按照分子量比例依次为1750：1500：1750的三种嵌段组合形成的ABA型聚合物。
本发明提供了一种可以高效用于治疗血管痉挛的温敏溶胶，该温敏溶胶作为一种溶胶-凝胶可逆温敏智能载药水凝胶，可以实现温度在34℃～37℃之间的凝胶-溶胶可逆转变。在正常人体温度下，其保持为稳定的凝胶状态，可以在体内缓释维拉帕米；而当出现血管痉挛时，由于血管痉挛引起温度降低，此时体内的凝胶可在低温下进行反向凝胶-溶胶转变，转化为溶胶状态，从而实现药物的爆裂释放和快速扩散，以达到快速、及时、高效抑制和缓解血管痉挛。本发明提供的温敏溶胶在治疗血管痉挛的同时，可以起到缓解组织损伤，动态调控血管外微环境以促进体内组织存活的作用，实现了血管痉挛经治疗后组织存活率的大幅度提升。
本发明提供的温敏溶胶，针对不同模型的血管痉挛均能起到很好的治疗效果，不仅可以适用于皮瓣移植术后出现的血管痉挛，还可以很好适用于脑动脉瘤手术后出现的血管痉挛。
进一步的是，所述三嵌段聚合物中的单体乳酸和乙醇酸的重量比为75:25。
进一步的是，所述三嵌段聚合物的制备方法包括以下步骤：
以二羟基聚乙二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，以乙醇酸和乳酸为单体，进行开环共聚反应，得到所述三嵌段聚合物。
进一步的是，所述二羟基聚乙二醇的分子量为1500，所述开环共聚反应的反应温度为150℃，反应时间为12h。
本发明的第二目的是提供一种如上所述用于治疗血管痉挛的温敏溶胶的制备方法，其是先制备三嵌段聚合物，将三嵌段聚合物溶于4℃的水中，然后将维拉帕米溶于三嵌段聚合物的水溶液中，溶解完全后，即得。
进一步的是，所述三嵌段聚合物与水的重量比为1:3。
进一步的是，所述维拉帕米的浓度为1～4mg·ml-1。
本发明的第三目的是提供一种如上所述的温敏溶胶在制备治疗血管痉挛的药物方面的应用。具体的，所述血管痉挛为伴随着与血管有关的显微外科手术出现的血管痉挛。更为优选的，所述血管痉挛为皮瓣移植术后出现的血管痉挛或脑动脉瘤手术后出现的血管痉挛。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种可以高效用于治疗血管痉挛的温敏溶胶，该温敏溶胶内部负载药物维拉帕米，可以实现温度在34℃～37℃之间的凝胶-溶胶可逆转变；该温敏溶胶在正常体温下保持为稳定的凝胶状态，当出现血管痉挛引起温度降低时，凝胶物在低温下可逆向转变为溶胶状态，并实现药物的爆烈释放和快速扩散，达到及时高效治疗血管痉挛的作用。在治疗血管痉挛的同时，本发明的温敏凝胶还可以起到缓解组织损伤，动态调控血管外微环境以促进体内组织存活的作用。
附图说明
图1为三嵌段聚合物在负载Vera之前和负载Vera之后的表征结果；a)1H NMR表征结果；b)三嵌段聚合物的相图转变性质；c)ζ电位测量；d)胶束大小分布；e)三嵌段聚合物负载Vera和未负载Vera的储存模量(G′)和损耗模量(G″)变化；f)三嵌段聚合物负载不同浓度Vera的累积释放曲线；g)RTS水凝胶系统在体外的温度响应性；h)RTS水凝胶系统在体内的温度响应性。
图2为RTS水凝胶在体外抑制细胞外钙内流的结果；a)代表图像；b)A7r5细胞内钙内流测试的示意图；c)A7r5细胞荧光强度最大变化总结图，由钙指示剂Fluo-4测量(n＝3)，(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图3为RTS水凝胶在体外抑制血管痉挛的结果；a)PE诱导动脉环收缩的张力测量示意图；b)PE诱导张力变化的代表图像；c)第1天和d)第4天收缩曲线及最大收缩变化总图(n＝4)，(*p＜0.05，***p＜0.005)。
图4为RTS水凝胶促进组织存活实验结果；a)动物实验示意图；b)各组皮瓣坏死面积百分比(n＝3)；c)各组皮瓣外观及热成像图；d)肌肉组织HE染色；e)肌肉组织Masson染色；f)皮瓣坏死与存活交界处HE染色(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图5为RTS水凝胶在体内抑制血管痉挛实验结果；a)血管超声多普勒检测示意图；b)各组流速比总结图；c)冷刺激前后各组血流及流速代表图像(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图6为RTS水凝胶可以随着温度的下降减轻组织损伤；a)动物实验示意图；每个组的b)SOD；c)GSH；d)MPO和e)MDA变化水平；f)肌肉组织HE染色；g)皮肤组织HE染色(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图7为RTS水凝胶抑制钙内流和血管痉挛的示意图；a)RTS水凝胶体系的制备；b)RTS水凝胶的凝胶-溶胶可逆转变性能；c)RTS水凝胶可以缓解组织损伤，随着血管痉挛引起的温度下降，其快速反向转化为溶胶状态，从而导致药物的爆裂释放和扩散。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种用于治疗血管痉挛的温敏溶胶，该温敏溶胶包括维拉帕米和用于负载维拉帕米的三嵌段聚合物；
本发明提供的温敏溶胶在常温下处于溶胶状态，因而可以进行注射，当温度从34℃升至37℃时具有从溶胶转变为凝胶的特性，当温度从37℃降至34℃时具有从凝胶转变为溶胶的特性，因而本发明提供的温敏溶胶是一种智能可逆溶胶-凝胶体系，简称为RTS水凝胶。(一)本发明提供的温敏溶胶的制备方法如下：
(1)三嵌段聚合物的合成
以分子量为1500的二羟基聚乙二醇为引发剂，以辛酸亚锡为催化剂，进行乙醇酸和乳酸的开环共聚反应，具体步骤为：在真空条件下，于三颈烧瓶中加入20g聚乙二醇，升温至150℃反应3h，将烧瓶冷却至室温，然后加入乙醇酸和乳酸单体，单体比例为25：75；为消除残余水分，期间更换三次氩气；然后加入辛酸亚锡后，在氩气气氛下于升温至150℃反应12h，反应后的粗品产物用80℃水冲洗3次，冻干后除去残余水分，即得三嵌段聚合物。三嵌段聚合物中各嵌段的分子量比例为1750：1500：1750。
(2)制备载药温敏溶胶
将三嵌段聚合物按质量百分占比为25wt％溶于4℃的水中得到聚合物水溶液，然后将维拉帕米(Vera)溶于浓度分别为1、2或4mg·ml-1的聚合物水溶液中，采用磁力搅拌进行完全溶解，制得负载维拉帕米的可逆温敏溶胶，记为Vera@RTS-Gel。
(二)三嵌段聚合物的表征方法
(1)1H NMR谱测量
以CDCl3(氘代三氯甲烷)为溶剂，在25℃下，通过400MHz核磁共振波谱仪(Bruker，AVANCE III HD)获得三嵌段聚合物的化学结构和组成。以四甲基硅烷为内标，在ppm中提出化学位移。
(2)溶胶-凝胶和凝胶-溶胶转变测量
采用管倒置法测定聚合物水溶液的转变温度。首先，将溶液倒入小瓶后放入低温水浴中，提高温度后，将小瓶在水中保存10分钟，然后倒置。如果30s内没有沿壁流动，则判定为凝胶，初始温度定为Tgel。随着温度的升高，凝胶变成悬浮液，确定初始温度为Tsol(悬浮液)。通过研究不同温度下聚合物浓度的变化范围，确定聚合物水溶液的状态图。
(3)水动力直径和ζ电位的测量
在含有不同浓度Vera或不含Vera的聚合物水溶液中，透析后在25℃的温度下，用DLS仪器(Zetasizer Nano ZS90，Malvern)测量，散射角设置为90°。
(4)流变特性分析
采用应变控制流变仪(Kinexus，Malvern)测量聚合物在有无Vera时的水溶液转变。在间隙为0.03mm、速率为0.5℃·min-1、频率为10rad·s-1时，测试试样的黏度(η)、储存模量(G′)和损耗模量(G″)结果。
实验例1
(一)实验方法
1、体外释放研究
在37℃下，检测了三组含有不同浓度Vera(1、2、4，单位：mg·ml-1)的25wt％聚合物水溶液的体外释放行为。
首先，将0.25g聚合物水溶液倒入玻璃管中，每管加入5ml 37℃PBS缓冲液，37℃水浴平衡15min，每天同一时间取出缓冲液计量，用相同方法重新填充。然后用高效液相色谱法测定PBS中Vera的浓度，紫外检测器最佳检测波长设定为278nm。
2、温度响应性测试
在体外，连续观察不同温度的水中注入水溶性色素溶解水凝胶的过程。在体内，将水溶性荧光分子(Sulfo-Cy5.5 NHS酯)负载在RTS水凝胶中，然后随温度变化将水凝胶注入皮瓣组织。通过体内荧光图像分析系统(PerkinElmer，美国)观察荧光分子的分布。
3、细胞生物相容性
将A7r5细胞和HUVEC细胞(A7r5细胞来源于中国科学院细胞库/干细胞库；人脐静脉内皮细胞(HUVECs)由美国Lonetics公司提供。)分别接种于24孔板和96孔板中，放置12h，然后以不同浓度(0、1、5、10、50、100、500、1000，单位：μg·ml-1)的含PELGA聚合物的培养液替代原培养液，培养24h后进行活/死染色和CCK-8实验。培养的细胞用活细胞/死细胞染色试剂盒处理，用荧光显微镜(PCOM，尼康，日本)检查。在CCK-8实验中，处理1h后，用FlexStation 3微孔板读板机(molecular devices，日本)在450nm处测量吸收值。
4、钙内流测量
将A7r5细胞接种于12孔板中，加载Fluo-4 AM(钙离子荧光探针)。每组在第1天或第4天分别用含有或不含Vera的凝胶释放液的Krebs-Henseleit溶液或Vera@RTS-Gel inKrebs-Henseleit溶液处理细胞，然后用无钙缓冲液孵育细胞。加入2.5mM CaCl2触发钙内流，用荧光显微镜连续记录荧光强度。
(二)实验结果
1、Vera@RTS-Gel的制备与表征
(1)图1中a部分显示了三嵌段聚合物的1H NMR谱和化学结构，表明在4.80ppm(-COCH2O-)、3.65ppm(-CH2CH2O-)和1.55ppm(-COCH(CH3)O-)处得到了数均分子量MW和Mn。如图1中b部分所示，三嵌段聚合物的水溶液在温度升高触发下可以形成半固态凝胶，当恢复到低温时，可以迅速转变为流动的溶胶状态。在低于或高于溶胶-凝胶转变温度(Tgel)时，溶液呈现出两种不同的形态。将该水凝胶简记为RTS水凝胶。
由于显微手术游离皮瓣移植后通常需要对血管痉挛进行治疗，因此选择钙拮抗剂Vera(维拉帕米)作为治疗介质。将Vera和聚合物水溶液均匀混合，在4℃条件下制备了负载Vera的三嵌段聚合物水凝胶。如图1中c部分所示，通过ζ电位变化对聚合物胶束加入Vera前后的表面进行表征，这种变化说明聚合物与Vera之间是通过静电相互作用的方式发生复合的。参见图1中d部分，动态光散射(DLS)粒径分析表明，两亲性聚合物在水体系中可以进行自组装，形成粒径在35nm左右的胶束，而加入Vera不会影响胶束的结构和尺寸。
(2)为了响应血管痉挛引起的温度变化，RST水凝胶首先需要合适的转变温度。以显微外科游离皮瓣移植为例，临床经验表明，发生严重动脉损伤后，温度下降约3℃，因此将过渡温度设定在34℃左右。考虑到药物装载可能造成的影响，需要检查添加Vera后的性质变化，如Tgel。如图1中e部分所示，应变控制流变仪用于研究聚合物水溶液在温度上的转变性质，随着温度的升高，储存模量(G′)逐渐超过损失模量(G″)，聚合物溶液粘度急剧增加，表明原位凝胶通过胶束聚集形成渗透胶束网络。一般来说，G′＝G″的温度被认为是转变温度，经检查，装入Vera后Tgel略有增加。通过验证不同配方的转变温度发现，当Vera在浓度为4mg·ml-1的25wt％三嵌段聚合物溶液中加载时，Tgel可以位于34℃左右。这不仅很好保证了水凝胶系统的可注射性和原位凝胶化能力，最重要的是满足了对血管痉挛引起的温度变化的响应性要求。
(3)由于对温度变化引发的血管痉挛的治疗效果需要在术后一段时间内持续维持药物含量，因此RTS水凝胶能够具备适当的缓释行为也是非常重要的。在体外，研究了负载不同浓度Vera的RTS水凝胶在7天内的释放行为。转至凝胶状态后加入PBS溶液，在最大吸收波长处采用高效液相色谱法准确检测释放液浓度。绘制的释放曲线结果表明，在7天内实现了有效的缓释(图1中f部分)。第1天，负载不同含量Vera的RTS水凝胶体系平均释放总量的24.19％、27.21％和28.17％。第2～7d，每天释放相对均匀，不同浓度下的释放行为差异不显著。因此，它们都可以被视为有效的持续输送系统。基于以上结果，选择将Vera(4mg·ml-1)加载到三嵌段聚合物溶液(25wt％)中制备的水凝胶进行后续研究。
(4)随后，对于制备的Vera负载的“可逆热敏”水凝胶(Vera@RTS-Gel)，测试了其在体外和体内的温度响应能力。如图1中g部分所示，在不同温度下注入水中，水凝胶在接触水面后立即呈现出不同的状态。当温度较低时，色素从溶胶态的水凝胶中迅速溶解到周围的水中；当温度较高时保持凝胶状态，色素也同时保持凝胶状态。图1中h部分显示，将载水可溶性荧光分子的RTS水凝胶注射到游离皮瓣组织中，在组织的不同温度下，利用活体荧光成像系统观察药物扩散的影响。结果表明，RTS水凝胶可以在正常体温下保持稳定的凝胶状态，同时在低温下进行反向凝胶-溶胶转变和药物快速释放。
这些结果表明，RTS水凝胶的状态和相关释放行为能够快速响应温度变化。这一性质为注射后原位凝胶结合治疗血管痉挛引起的温度变化提供了动态调控血管外微环境的基础。
2、PELGA聚合物的生物相容性
本实验利用大鼠平滑肌细胞系(A7R5s)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)验证了三嵌段聚合物具有良好的生物相容性。通过细胞活/死染色法和CCK-8法评估了三嵌段聚合物对细胞存活的影响。结果表明，三嵌段聚合物具有良好的生物相容性，为体内植入提供了重要依据。
3、抑制细胞外钙内流和血管痉挛的体外作用
血管平滑肌细胞(VSMCs)内Ca2+浓度升高是平滑肌收缩的关键因素，与兴奋-收缩耦合密切相关。血管痉挛的本质是血管平滑肌局部的持续痉挛收缩，此时Ca2+浓度的增加依赖于细胞外Ca2+的持续内流进入细胞，能够阻止Ca2+内流将针对关键因素对抗血管痉挛。为了验证RTS水凝胶的这种作用，选择钙指示剂Fluin-4AM分子探针用于直观地反映A7R5细胞中的Ca2+浓度。在细胞外Ca2+浓度升高的刺激下，可以通过荧光显微镜观察到由于Ca2+内流导致的细胞内Ca2+浓度升高。随后用刺激后最强的荧光强度与初始荧光强度进行比较。与Control组和Gel组的上升3倍以上相比，Vera@RTS-Gel组的上升明显受到抑制，与Vera组相当(图2中a和c部分)。以上结果验证了在细胞水平上，RTS水凝胶通过限制细胞外Ca2+内流发挥了抑制血管痉挛的作用。
利用微血管张力测量系统和苯肾上腺素(PE)诱导的刺激，可以稳定诱导微血管收缩时的张力变化，并准确显示。在此基础上，进行了在血管组织水平上检测RTS水凝胶抑制血管痉挛的效果。在第1天或第4天与RTS水凝胶或Vera@RTS-Gel释放液孵育后，与其他组相比，PE的加入引起了动脉环的浓度依赖性反应。通过信号采集系统实时获取张力变化，并与60mm KCl诱导的基础张力进行比较。图3中b部分显示Vera@RTS-Gel组PE诱导的收缩曲线向右偏移。如图3中c和d部分所示，Vera@RTS-Gel组的最大收缩量显著低于Control组和Gel组，与Vera组相当。
以上，从细胞和组织水平，检查了钙内流的起始因素和血管张力的最终表现，验证了RTS水凝胶的抑制作用，为其通过抑制钙内流和血管痉挛来调节血管外微环境以促进体内组织存活提供了基础。
4、体内抑制血管痉挛，促进皮瓣存活的作用
为了研究RST水凝胶在体内的作用，选择了带明确血管蒂的游离腹直肌横瓣动物模型。在临床上，这类游离皮瓣生存最关键的因素在于血管的供血情况，其组织生存状况将反映术后血管痉挛处理的结果。为了排除血管吻合操作的不稳定性，采用微型夹钳夹紧和松开来模拟这一过程。待血流恢复后，用注射器在动脉周围多点注射水凝胶溶液，避免动脉受压。注射后的水凝胶在体温刺激下，由于胶束聚集而发生溶胶-凝胶原位转变，成为血管周围药物释放库(图4中a部分)。根据临床皮瓣手术的要求，应注意避免低温对皮瓣存活的不利影响。
后续的研究从两个方面进行，分别模拟了动脉痉挛引起血管损伤导致温度降低和不降低的情况。对未进行缺血处理的大鼠进行常规喂养。为了检测体内动脉血管痉挛的抑制作用，评估了动脉血管对局部低温刺激的反应。术后第1天和第4天，用冰袋刺激动脉近端，利用超声多普勒成像系统实时监测远端收缩期最大血流速度变化(图5中a部分)。用刺激后与刺激前的血流速度之比来说明刺激对血管收缩后血供的影响。结果提示Vera@RTS-Gel组治疗前的流速比明显小于Control组、Gel组和Vera组。Vera组作为常规治疗的代表，在给药前后表现不同，表现出局部药物浓度的不稳定性(图5中b和c部分)。以上结果表明Vera@RTS-Gel作为药物缓释库，可以通过在术后一段时间内持续抑制血管痉挛，维持更稳定的血管周药物浓度，更好地发挥调节血管外微环境的作用。
一般来说，皮瓣的存活是手术结果最直观的表现。选择术后第7天观察皮瓣存活情况，以便当时明确判断。皮瓣坏死率表示为坏死面积/总皮瓣面积×100％，坏死与活皮的界限较清楚(图4中c部分)。如图4中b部分所示，Vera@RTS-Gel组平均坏死率明显高于Control组、Gel组和Vera组。以皮瓣的肌肉组织和皮瓣坏死区与存活区交界处的皮肤组织为例，进行后续的组织学观察，Control组和Gel组肌肉组织HE染色和Masson染色显示，正常肌肉组织大量破坏，肌细胞大量再生，胶原纤维增生，结构较正常组织明显改变，而Vera@RTS-Gel组只有小区域表现异常(图4中d和e部分)。皮肤HE染色显示，Control组和Gel组的坏死深度和组织破坏程度明显更严重，而Vera@RTS-Gel组的坏死仅限于浅表层(图4中f部分)。
以上结果表明：Vera@RTS-Gel系统在预防术后动脉血管痉挛的发生和促进组织生存方面具有更好的应用潜力，其疗效明显优于常规治疗方式。
5、温度下降对减轻组织损伤的体内效应
为了探讨植入组织的RTS水凝胶是否能快速响应血管痉挛引起的温度下降，从而启动保护作用，选择在术后第1天对皮瓣进行了模拟缺血治疗。提起皮瓣，阻止血液流动，会导致温度下降，因为血液灌注不足，然后植入的RTS水凝胶可以逆转为响应温度下降的溶胶状态，并大量释放药物。Vera组为常规临床治疗组，大鼠在缺血治疗后立即局部注射Vera，这在临床中几乎是不可能达到的。其余治疗组分别为不缺血处理的假手术组、对照组和缺血处理的凝胶组。缺血处理后再灌注，取标本作进一步分析。在这一过程中，缺血本身以及随后的再灌注过程都会对皮瓣组织造成细胞损伤。结果与缺血时间密切相关，因此在临床实践中，早期给予血管扩张药物是为了尽快缓解血管痉挛，恢复灌注，缩短缺血时间。
组织缺血再灌注损伤是由氧自由基介导的。SOD和GSH是机体重要的抗氧化剂，当氧自由基产生过多时，SOD活性和GSH水平下降。MDA是脂质过氧化反应的终产物之一，与自由基代谢密切相关。MPO是中性粒细胞的标志酶，与中性粒细胞的数量直接相关。从皮瓣的远端取出组织进行生化分析以反映组织损伤的程度。如图6中b至e部分所示，Vera@RTS-Gel组的组织损伤程度较Control组、Gel组和Vera组均有明显改善。这可能与RTS水凝胶在再灌注后恢复凝胶状态，并继续作为储层释放药物有关。随后的组织学分析也显示，服药组肌肉组织肌纤维坏死变性程度和炎症细胞浸润程度明显改善，皮肤组织结构也更接近正常组织(图6中f和g分图)。
以上结果说明RTS水凝胶对血管痉挛引起的组织损伤具有保护作用，提示通过动态调节血管外微环境，对温度变化有敏感的反应，具有良好的治疗效果。
对比例1
采用本发明的三嵌段共聚物(25wt％)负载解痉挛药罂粟碱(4mg·ml-1)，虽然该三嵌段共聚物同样能够负载罂粟碱，得到水凝胶体系，但该水凝胶体系在第1天平均释放罂粟碱的总量为23.87％，同时该水凝胶体系用于组织缺血再灌注损伤模型，其组织损伤程度仅比Gel组略有改善，而与Vera@RTS-Gel组相比效果下降明显。因此选择本发明的维拉帕米与三嵌段共聚物组合，得到的温敏溶-凝胶体系效果最佳。
Claims (7)
1.一种温敏溶胶在制备治疗血管痉挛治疗剂或抑制剂中的应用，提高组织存活率，其特征在于，所述温敏溶胶包括维拉帕米和用于负载维拉帕米的三嵌段聚合物；
其中，所述三嵌段聚合物为聚(D,L-乳酸-乙醇酸)-聚(乙二醇)-聚(D,L-乳酸-乙醇酸)，该三嵌段聚合物中各嵌段的分子量比例为1750：1500：1750；所述温敏溶胶具有当温度从34℃升至37℃时从溶胶转变为凝胶，并缓释维拉帕米的特性；且当温度从37℃降至34℃时从凝胶转变为溶胶，并大量释放维拉帕米的特性；
所述血管痉挛为伴随着与血管有关的显微外科手术出现的血管痉挛，或为皮瓣移植术后出现的血管痉挛或脑动脉瘤手术后出现的血管痉挛。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三嵌段聚合物中单体乳酸和乙醇酸的摩尔比为75:25。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述三嵌段聚合物的制备方法包括以下步骤：以二羟基聚乙二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，以乙醇酸和乳酸为单体，进行开环共聚反应，得到所述三嵌段聚合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二羟基聚乙二醇的分子量为1500，所述开环共聚反应的温度为150℃，反应时间为12h。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是先制备三嵌段聚合物，并将三嵌段聚合物溶于水中，然后将维拉帕米溶于三嵌段聚合物的水溶液中，溶解完全后，即得所述用于治疗血管痉挛的温敏溶胶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述三嵌段聚合物与水的重量比为1:3。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述维拉帕米的浓度为1～4mg/ml。
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