CN115356313A - 一种荧光寿命成像方法及其荧光寿命成像装置 - Google Patents

Abstract

一种荧光寿命成像方法，包括以下步骤：设置二维平面扫描区域，获取所述二维平面扫描区域内的扫描点；获取所述二维平面扫描区域的荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的不同波峰波长；根据所述波峰波长大小，获取各个扫描点不同波峰波长时荧光所对应的荧光寿命曲线；根据所述不同波峰波长的荧光所对应的荧光寿命曲线，同时或依次生成不同波峰波长所对应的多光波二维荧光寿命成像、和/或多光波三维荧光寿命成像、和/或二维荧光寿命时间切片成像。此外，本发明还提供一种实现上述荧光寿命成像方法的荧光寿命成像装置与现有技术相比较，本发明的荧光寿命显微成像装置能满足多光波荧光样品的测量需要。

Description

一种荧光寿命成像方法及其荧光寿命成像装置

技术领域

本发明涉及荧光寿命成像技术领域，特别是涉及一种荧光显微成像方法及其荧光寿命成像装置。

背景技术

在自然界中有一些物质在接受光照后，或是使用荧光染料等染色再经过光照后，可发出荧光。通过观察荧光可以获取物质相应位置的形状等相关信息。根据物质这一特性，人们开发出用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等的荧光显微镜，并对物质进行定性和定量研究。另一方面，物质在激光激发后，分子吸收能量会从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时荧光最大强度I₀的1/e所需要的时间，称为荧光寿命。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件有关,通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化，而且利用荧光寿命的测定还可以了解到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等，实现对生物大分子结构、动力学信息和分子环境等进行高分辨高精度测量，因此荧光寿命显微成像技术(FLIM)的重要性日渐提升，被广泛地应用于生物学研究及临床医学研究等领域。

荧光寿命显微成像技术基于荧光发光团的荧光强度进行数据分析。请参阅图1，现有技术中时间相关单光子计数法(TCSPC)就是测量荧光寿命的其中一种手段。测量时捕获多个脉冲周期内的光子并进行累计获得荧光寿命曲线W，然后从荧光寿命曲线W得到从荧光最大强度I₀降到其1/e所需要的时间，即荧光寿命值。然而，自然界中极少单一成分的物质，在实际检测中，同一样品中可能混合了不同成分的物质，而且即便是同一成分的物质，随着结构的不同其荧光寿命成像也可能不相同，单单通过捕获光子数进行成像的方式显然无法满足不同结构或成分的样品进行荧光寿命研究的需要。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种荧光显微成像方法，能在一次测量中实现对不同结构或成分的样品进行荧光寿命成像。

本发明采取的技术方案如下：

一种荧光寿命成像方法，包括以下步骤：

设置二维平面扫描区域，在所述二维平面扫描区域内设置扫描点；

获取所述二维平面扫描区域的荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的不同波峰波长；

根据所述波峰波长大小，获取各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命曲线；

根据所述不同波峰波长的所对应的荧光寿命曲线，同时或依次生成不同波峰波长所对应的多光波二维荧光寿命成像、和/或多光波三维荧光寿命成像、和/或二维荧光寿命时间切片成像。

与现有技术相比较，本发明的荧光寿命成像方法通过对诱导荧光进行光谱分析获取波峰波长，并根据波峰波长同时或依次获取二维荧光寿命成像、多光波三维荧光寿命成像、荧光寿命时间切片成像，所得到的荧光寿命成像相关成像根据样品的结构或成分情况进行区分，准确、全面反映样品荧光寿命情况，提高荧光寿命成像精度，满足多光波荧光样品的测量需要。

进一步，生成多光波二维荧光寿命成像包括以下步骤：在同一二维平面内，根据各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命曲线获取所对应的荧光寿命值；比较各个荧光寿命值，并获取最大荧光寿命值；根据所述最大荧光寿命值对各个荧光寿命值进行归一化处理，获取各个荧光寿命值的归一化值；将所述归一化值转换为图像灰度值；根据各个扫描点在不同波峰波长时的灰度值以及扫描点位置生成多光波二维荧光寿命成像，从而实现在一次测量中获取多荧光样品不同波长所对应的二维荧光寿命图像。

进一步，生成多光波三维荧光寿命成像包括以下步骤：在设置二维平面扫描区域前，按一定间隔设置法线方向均平行于样品厚度方向的多个二维平面；分别获取各个二维平面扫描区域的荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的不同波峰波长；根据所述波峰波长大小，获取各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命曲线；根据各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命曲线获取各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命值；比较所述荧光寿命值，并获取最大荧光寿命值；根据所述最大荧光寿命值对各个荧光寿命值进行归一化处理，获取各个荧光寿命值的归一化值；将各个荧光寿命值的归一化值转换为图像灰度值；根据各个扫描点在不同波峰波长时的灰度值以及扫描点二维位置生成同一平面的多光波二维荧光寿命成像；对各个二维平面的二维荧光寿命成像根据所对应的波峰波长进行分类，并根据其厚度方向上的位置依次层叠，从而获得多光波三维荧光寿命成像，在多光波二维荧光寿命成像的基础上获取多光波三维荧光寿命成像，立体地反映三维空间中样品的荧光寿命分布情况。

进一步，生成二维荧光寿命时间切片成像包括以下步骤：同一二维平面中，根据各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命曲线，得到同一扫描点、同一波峰波长下、脉冲周期内各个时点所对应的单光子数之和；生成时间切片矩阵表，所述时间切片矩阵表的行或列按照各个扫描点依次排序、列或行按照时间间隔依次排序，单元格内容为所述扫描点在所述时点所对应的单光子数之和；比较所述时间切片矩阵表内各个单光子数之和，并获取最大单光子数之和；根据所述最大单光子数之和对各个单光子数之和进行归一化处理，获取所述单光子数之和的归一化值；将所述单光子数之和的归一化值转换为灰度值，获取同一二维平面内、各扫描点、同一波峰波长下、不同时点的灰度值；根据各个扫描点在不同时点灰度值以及所述扫描点的位置进行成像，获取同一二维平面内、同一波峰波长下，不同时点的荧光寿命时间切片成像，通过二维荧光寿命时间切片模式可以获取同一二维平面内、同一波峰波长下荧光衰减变化各个时点的成像，与现有技术使用相机拍摄中受到快门反应速度、感光像素等因素制约相比，二维荧光寿命时间时间切片模式具有高时间分辨率和高空间分辨率特点

进一步，将所述归一化值转换为灰度值时，将所述归一化值乘以255后其大小为所述灰度值，实现灰度值的简单转换。

此外，本发明还提供一种实现上述荧光寿命成像方法的荧光寿命成像装置，其技术方案如下：

一种荧光寿命成像装置，包括双光子荧光激发单元、激光扫描单元、荧光收集单元和成像分析单元；所述荧光激发单元发射激光后进入所述激光扫描单元，所述激光扫描单元控制所述激光在样品的入射位置；所述荧光收集单元获取荧光光谱，并根据所述荧光光谱获取在不同波峰波长下荧光的单光子数从而生成荧光寿命曲线，所述成像分析单元与所述荧光收集单元电连接，并根据所述不同波峰波长下单光子数获取多光波二维荧光寿命成像、和/或多光波三维荧光寿命成像、和/或荧光寿命时间切片成像。

与现有技术相比较，本发明的荧光寿命成像装置所得到的荧光寿命成像相关成像能根据样品的结构或成分情况进行区分，准确、全面反映样品荧光寿命情况，提高荧光寿命成像精度，满足多光波荧光样品的测量需要。

进一步，所述双光子荧光激发单元包括激光发射器、第一激光校准器和快门；所述激光发射器发射的激光经过所述第一激光校准器进行调整后进入所述快门，然后进入所述激光扫描单元，所述快门控制调整后的激光进入所述激光扫描单元的时长，防止激光对荧光样品造成损坏。

进一步，所述激光扫描单元包括反射镜组、透镜组和单轴位移平台；所述反射镜组将从所述快门射出的激光反射到所述透镜组，所述透镜组将激光聚焦到放置在所述单轴位移平台上的样品中使其产生发出诱导荧光；所述透镜组捕获所述诱导荧光并将其发射到所述荧光收集单元，测量过程中，通过反射镜组实现对荧光样品的扫描，生成连续的图像。

进一步，所述荧光收集装置包括滤色片、第二激光校准器、光谱采集器、增强电荷耦合器以及光子计数器；所述滤色片设置在所述第二激光校准器与所述透镜组之间；所述第二激光校准器对荧光进行聚焦后使其进入所述光谱采集器中；所述光谱采集器、所述增强电荷耦合器以及光子计数器分别与所述成像分析单元电连接；所述光谱采集器在所述成像分析单元控制下改变从其发射出来的荧光的中心波长；所述增强电荷耦合器用于获取荧光光谱；所述光子计数器用于获取所述单光子数，从而实现测量的智能化与自动化。

进一步，所述光谱采集器包括沿光路依次设置的反射镜、第一准直反射镜、电控分光光栅、第二准直反射镜和光路选择镜；所述反射镜将经所述第二激光校准器聚焦的荧光光束反射到所述第一准直反射镜进行准直，然后进入所述电控分光光栅，然后发射到所述第二准直反射镜，所述光路选择镜将不同波长的光束选择同时或依次发射到所述增强电荷耦合器、和/或所述光子计数器，实现根据波峰波长获取不同的荧光寿命成像。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为现有技术中时间相关单光子计数法(TCSPC)的示意图；

图2为本发明中荧光寿命成像装置的结构简略图；

图3为本发明中荧光寿命成像装置的整体结构示意图；

图4为本发明中光谱采集器的结构示意图；

图5为使用本发明的荧光寿命成像装置进行荧光寿命成像的流程示意图；

图6为本发明中根据不同波峰波长的荧光寿命值进行二维荧光寿命成像的流程示意图；

图7为本发明中根据各个时点的单光子数之和进行荧光寿命时间切片成像的流程示意图；

图8为本发明实施例中获得的明场二维图像；

图9为本发明的实施例中所获得的样品荧光光谱；

图10为本发明实施例中测量所得不同波峰波长所对应的二维荧光寿命成像；

图11为本发明实施例中波峰波长λ1＝460nm时所对应的三维维荧光寿命成像；

图12为本发明实施例中所生成时间切片矩阵表的一部分数据；

图13(a)为本发明实施例中所述波峰波长λ1、时点t＝1ns时所生成的荧光寿命时间切片成像；

图13(b)为本发明实施例中所述波峰波长λ1、时点t＝2ns时所生成的荧光寿命时间切片成像；

图13(c)为本发明实施例中所述波峰波长λ1、时点t＝5ns时所生成的荧光寿命时间切片成像。

具体实施方式

本发明的荧光寿命成像方法及其荧光寿命成像装置利用物质不同成分、结构所发出的荧光波长不一样的特点，将荧光波长与荧光强度相结合，获取多种更佳的荧光寿命成像。

请结合参阅图2与图3，本发明所提供的荧光寿命显微成像装置包括依次连接的双光子荧光激发单元10、激光扫描单元20、荧光收集单元30和成像分析单元40。所述荧光激发单元10发射激光后进入所述激光扫描单元20，所述激光扫描单元20控制所述激光在待测试的样品(图未示)上的入射位置。所述荧光收集单元30获取包括所述样品发出荧光的光谱、荧光强度、所激发的单光子数等多种信息，并将其传输到所述成像分析单元40进行数据分析从而在一次实验中获取多种荧光寿命相关的成像。

其中，所述双光子荧光激发单元10包括激光发射器11、第一激光校准器12和快门13。所述激光发射器11发射的激光经过所述第一激光校准器12进行调整后进入所述快门13。通过所述快门13的开闭控制激光进入所述样品中的时长，防止高能量的激光长时间聚焦在所述样品上造成其损坏。控制所述双光子荧光激发单元10发射激光的密度与波长，使得所述样品上产生双光子诱导荧光。在本实施例中，所述激光发射器11发射飞秒激光，其波长可在660-1300nm之间，频率为80Mhz。所述第一激光校准器12为光学计算机，即4F光学系统，能对光束进行扩束和准直，使得光束保持平行进入所述样品。所述快门13为电子快门，并与所述成像分析单元40电连接，由所述成像分析单元40控制其开关时间。

所述激光扫描单元20包括反射镜组21、透镜组22和单轴位移平台23。所述反射镜组21将从所述快门13射出的激光反射到所述透镜组22，所述透镜组22将激光聚焦到放置在所述单轴位移平台23上的样品中，使其产生双光子效应发出诱导荧光。所述透镜组22捕获所述诱导荧光并将其发射到所述荧光收集单元30。在本实施例中，所述反射镜组21为与所述成像分析单元40电连接的MEMS振镜，与普通反射镜组相比，能进行微小调整，可精确地改变光束聚焦在所述样品上的位置，并保证在所述成像分析单元40控制下光束按照设定好的轨迹在所述样品上进行二维扫描。所述透镜组22为显微物镜，能对光束进行聚焦和反射。进一步，所述激光扫描单元20还包括第一二向色镜24和明场组件25，所述明场组件25包括照明器251和探测器252。所述照明器251设置在所述单轴位移平台23上方或所述反射镜组21内并向所述样品投射光线，使得所述样品处于明视场中，以便于对所述样品的观察，选取光束入射的最佳位置。在收集荧光的过程中，所述照明器251处于关闭状态，以免对测量结果产生影响。所述第一二向色镜24对经过所述样品发出的诱导荧光分别进行透射与反射，并控制透射光线与反射光线的强度比例。所述第一二向色镜24的反射光束进入所述探测器252，透射光束进入所述荧光收集装置30。所述探测器252与所述成像分析单元40电连接，并获取所述样品上的影像。对样品进行观察时，即所述激光发射器11没有发射激光时，打开所述照明器251，调节所述第一二向色镜24，使其反射光线与透射光线的强度比为1:0，即光线全部反射进入所述探测器252，实现在足够的明场条件下，对没有激光照射前样品进行观察，选取最佳入射位置。所述激光发射器11发射激光后，所述样品经所述激光激发后发出荧光，调节所述第一二向色镜24，使其反射光线与透射光线的强度比为1:9，大部分光线透射到所述荧光收集装置30，剩余小部分光线反射进入所述探测器252以便于测量过程中继续对所述样品进行观测；又或是调节所述第一二向色镜24，使其反射光线与透射光线的强度比为0:1，光线全部透射到所述荧光收集装置30以获取更佳的图像效果。此外，所述激光扫描单元20还可以是现有技术中的反射式显微镜。进一步，所述透镜组22与所述第一二向色镜24之间还设有第二二向色镜26，调节所述第二二向色镜26使其将从所述透镜组22透射出来的激光全部反射回所述透镜组22，透射荧光到所述荧光收集装置30，以避免所述透镜组22中的激光对荧光的检测产生影响。

所述荧光收集装置30包括滤色片31、第二激光校准器32、光谱采集器33、增强电荷耦合器(ICCD)34以及光子计数器(PMT)35。所述滤色片31设置在所述第二激光校准器32与所述透镜组22之间，对所述样品发出的荧光光束进行过滤，选取一定波长范围的光束以降噪。过滤后的荧光光束经所述第二激光校准器32聚焦后进入所述光谱采集器33。在本实施例中，所述第二激光校准器32为4F光学系统。所述光谱采集器33对荧光光束进行分束与调节后分别被所述增强电荷耦合器34和所述光子计数器35捕获。所述增强电荷耦合器34快速测量包括波长曲线在内的荧光光束光谱，所述光子计数器35获取荧光的光子数。所述光谱采集器33、增强电荷耦合器34和所述光子计数器35分别于所述成像分析单元40电连接，并根据所述增强电荷耦合器34所获取波长曲线的波峰值调节所述光谱采集器33，使得所述光子计数器35捕获荧光波长为一定值的单光子数。进一步，所述光子计数器35包括相互电连接的光电倍增管351和TCSPC数据采集卡352，从所述光谱采集器33发出的荧光进入所述光电倍增管351，所述TCSPC数据采集卡352与所述成像分析单元40电连接。所述TCSPC数据采集卡将所述光电倍增管351的电信号转换为数字信号后再发送到所述成像分析单元40。在本实施例中，所述光电倍增管351为单光子计数型。

请参阅图4，在本实施例中，所述光谱采集器33包括沿光路依次设置的反射镜331、第一准直反射镜332、电控分光光栅333、第二准直反射镜334和光路选择镜335。所述反射镜331将经所述第二激光校准器32聚焦的荧光光束反射到所述第一准直反射镜332进行准直，然后进入所述电控分光光栅333，荧光光束根据其波长发生被分束并衍射，然后发射到所述第二准直反射镜334，所述光路选择镜335将不同波长的光束选择同时或依次发射到所述增强电荷耦合器34、所述光子计数器35。所述电控分光光栅333与所述成像分析单元40电连接，所述成像分析单元40根据所述增强电荷耦合器34所获得波长波峰值调整所述电控分光光栅333的偏转角度、狭缝宽度等从而改变从所述光谱采集器33出来的荧光中心波长，使得所获得光子数为强度处于峰值所对应不同波长时的光子数，从而获得不同波长波峰值下的荧光寿命与强度。在本实施例中，所述第一准直反射镜332和所述第二准直反射镜334为球面反射镜，所述光路选择镜335为分束镜或折转镜。此外，所述光谱采集器33还可以是现有技术中其他的光谱仪。

所述成像分析单元40为设有中央处理器(图未示)和显示器41的计算机，内装有labview程序，能同时控制所述快门13的开关时长、所述反射镜组21之间位置的微调、所述明场组件25拍摄图像的获取、所述电控分光光栅333的调整以及所述增强电荷耦合器34、所述光子计数器35获取数据。所述成像分析单元40根据所述光子计数器35的测量数据进行多光波荧光寿命成像、三维荧光寿命成像以及荧光寿命时间切片成像。

根据上述荧光寿命成像装置的结构，现对其测试步骤进行说明：

多光波二维荧光寿命成像模式：

请参阅图5，通过多光波荧光寿命成像模式可在一次测量中获取多荧光样品不同波长所对应的二维荧光寿命图像。

步骤S10：设置二维平面扫描区域。

在所述单轴位移平台23上设置样品，打开所述明场组件25，获取样品的明场二维图像，并根据所述明场二维图像设置在同一二维平面内的扫描区域。

在本实施例中，所获取的明场二维图像如图9所示，所述扫描区域为40um*40um。

步骤S20：在所述二维平面内，按照X、Y坐标将所述扫描区域按照一定尺寸间隔设置多个扫描点，X、Y坐标方向分别为所述样品的长度方向与宽度方向。

在本实施例中，以1um为单位设定扫描点，获得40*40＝1600个扫描点，分别为点A1到点A1600。

步骤S30：获取所述二维平面的样品荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的波峰波长。

打开所述激光发射器11，调节所述反射镜组21，激光依次经过所述第一激光校准器12、所述快门13、所述透镜组22聚焦到所述样品上，并且控制所述反射镜组21可使得激光在所述二维平面上进行扫描，使各扫描点发出诱导荧光，所述光谱采集器33采集所述诱导荧光，所述增强电荷耦合器34根据所采集的诱导荧光生成光子数-波长光谱，并传输至所述成像分析单元40。

在本实施例中，所获得的光子数-波长光谱如图9所示，所述光谱中存在3个光子数波峰，分别为波峰a1、a2和a3，其对应的波峰波长分别为460nm、540nm和610nm，由于光子数与光强之间为正比关系，因此样品的荧光在波峰波长为λ1＝460nm、λ2＝540nm和λ3＝610nm时光强较大，这3个波峰波长所对应的荧光强度较能反映样品的荧光寿命。

步骤S40：获取各个扫描点在同一波峰波长时所对应的荧光寿命曲线以及荧光寿命值。

首先控制所述反射镜组21使得激光聚焦到所述点A1，所述成像分析单元40根据所述波峰波长a1调整所述电控分光光栅333的中心波长或所述光谱采集器33的狭缝距离，使得从所述光谱采集器33出来的荧光中心波长等于所述波峰波长λ1。所述光子计数器35获取在多个脉冲周期中各时点的光子数，根据单光子时间相关计数法(TCSPC法)获得所述点A1在所述电控分光光栅333的中心波长等于所述波峰波长λ1时的荧光寿命曲线。然后根据所述荧光寿命曲线获取所述点A1在所述波峰波长λ1时的荧光寿命值a1b1。最后调整所述反射镜组21，使得所述激光发射器11发出的激光依次聚焦到所述点A2到点A1600，依次获取所述点A2到所述点A1600在所述波峰波长a1时的荧光寿命值a1b2到a1b1600。

在本实施例中，所述脉冲周期为12.5ns，积分时间在50ms以上，所述脉冲周期数量为10⁶次。

步骤S50：获取各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命值。

在本实施例中，所述成像分析单元40根据所述波峰波长a2调整所述电控分光光栅333的中心波长，使得所述电控分光光栅333的中心波长分别等于所述波峰波长λ2，并重复步骤S40，获取各个扫描点在所述波峰波长λ2下的对应的荧光寿命值a2b1到a2b1600。然后使得所述电控分光光栅333的中心波长分别等于所述波峰波长λ3，获取各个扫描点在所述波峰波长λ3下的对应的荧光寿命值a3b1到a3b1600。

步骤S60：根据各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命分别获取不同波峰波长时的多光波二维荧光寿命成像。请参阅图6，包括以下步骤：

步骤S61：比较各个扫描点在不同波峰波长时所对应的荧光寿命值，并获得最大荧光寿命值。

在本实施例中，比较所述荧光寿命值a1b1到a1b1600、a2b1到a2b1600、a3b1到a3b1600，从中获得最大荧光寿命值。

步骤S62：根据所述最大荧光寿命值对所有二维荧光寿命值进行归一化处理。

在本实施例中，根据所述最大荧光寿命值对所述荧光寿命值a1b1到a3b1600进行归一化处理，获取所述荧光寿命值的归一化值。

步骤S63：将所述荧光寿命值的归一化值转换为图像的灰度值。

在本实施例中，所述荧光寿命值a1b1到a1b1600、a2b1到a2b1600、a3b1到a3b1600归一化后的值分别乘以255后所对应的值即其所对应的灰度值。

步骤S64：根据所述灰度值以及所述扫描点的位置生成不同波峰波长所对应的二维荧光寿命成像，从而获取多光波二维荧光寿命成像。

在本实施例中，首先根据所述荧光寿命值a1b1到a1b1600所对应灰度值生成所述波峰波长λ1时的二维荧光寿命成像，然后根据所述荧光寿命值a2b1到a2b1600所对应灰度值生成所述波峰波长λ2时的二维荧光寿命成像，最后根据所述荧光寿命值a3b1到a3b1600所对应灰度值生成所述波峰波长λ3时的二维荧光寿命成像，其结果如图10所示，从左到右分别为所述电控分光光栅333的中心波长等于所述波峰波长460nm、540nm和610nm时所对应的二维荧光寿命成像。

多光波三维荧光寿命成像模式：

请参阅图5，在二维荧光寿命成像的基础上获取三维荧光寿命成像，立体地反映三维空间中样品的荧光寿命分布情况。

步骤S70：获取样品在厚度方向上的多个法线方向平行于所述厚度方向的二维平面，并获取其中一个二维平面的样品荧光光谱。

沿所述样品的厚度以一定的间隔在Z轴方向上将所述样品分为若干个相互平行的二维平面，获取最上方二维平面或最下方二维平面的样品荧光光谱，从而获得所述样品不同波峰波长。

在本实施例中，按100nm为单位在Z轴方向上将所述样品划分为多个二维平面S1、S2……。

步骤S80：分别获取各个二维平面中不同波峰波长的二维荧光寿命成像

依次调整所述单轴位移平台23，使得激光分别聚焦到所述Z轴平面上S1、S2……，并重复进行步骤S10到步骤S70后获得在同一二维平面内、不同波峰波长所对应的二维荧光寿命成像。

步骤S90：对各个二维平面的二维荧光寿命成像根据所对应的波峰波长进行分类，并沿Z轴坐标依次层叠，获取不同波峰波长时的三维荧光寿命成像。

差值在±20nm以内的波峰波长看作为同一波峰波长，将同一波峰波长不同的二维荧光寿命成像按照其Z轴坐标进行层叠，获得同一波峰波长下的三维荧光寿命成像，将不同波峰波长的二维荧光寿命成像按Z轴坐标进行层叠，从而不同波峰波长的三维荧光寿命成像。

大多数情况下，样品所发出的不同波峰波长的荧光一般是由样品中的各物质以及各物质的结合物所产生。对于同一样品，其组成物质基本不变，因此各物质以及各物质结合物所产生的荧光波峰波长只会在±10nm到20nm范围内的波动。据此所述波峰波长在20nm内波动的荧光可以看作是由同一物质所产生，视为同一波峰波长。但是这些荧光因为物质每一个二维平面上分布会有所不同导致荧光的分布也会不同，所以需要重复对每个二维平面都采集一次光谱。

在本实施例中，所述波峰波长λ1、λ2、λ3所对应的三维荧光寿命成像为3个，其中所述波峰波长λ1＝460±10nm所对应的三维荧光寿命成像如图11所示。

二维荧光寿命时间切片模式：

通过荧光寿命时间切片模式可以获取同一二维平面内、同一波峰波长下荧光衰减变化各个时点的二维成像，与现有技术使用相机拍摄中受到快门反应速度、感光像素等因素制约相比，二维荧光寿命时间时间切片模式具有高时间分辨率和高空间分辨率特点。

步骤S100：获取各个扫描点同一波峰波长时所对应荧光寿命曲线，得到脉冲周期内各个时点所对应的单光子数之和。

在本实施例中，重复进行步骤S10到S40，根据单光子时间相关计数法分别获得所述点A1到点A1600在所述波峰波长λ1下，多个脉冲周期中各时点的单光子数，以一定的时间间隔为单位，获取在各个时点的单光子数之和，即在各个时点的光强。

步骤S110：根据各时点的单光子数之和生成时间切片矩阵表。

建立行数按照扫描点序号变化、列数按照时间间隔变化的时间切片矩阵表，每个单元格内填入相应扫描点在相应时点的单光子数之和。

请参阅图12，在本实施例中，扫描点数为1600个，以发生激光的时点0点，以25ps为时间间隔，因此所述时间切片矩阵表的行数为1600行，分别代表所述点A1到所述点A1600，第一行第一列代表在25ps时所述点A1的单光子数之和，第一行第二列代表在50ps时所述点A1的单光子数之和，第二行第二列代表在50ps时所述点A2的单光子数之和，依次类推。

步骤S120：根据所述时间切片矩阵表生成荧光寿命时间切片成像。

根据各个时点同一平面内不同扫描点的单光子数之和，进行荧光寿命时间切片图转换，请参阅图7，包括以下步骤：

步骤S121：比较所述时间切片矩阵表中各单光子数之和，并获取单光子数之和的最大值

步骤S122：根据所述最大单光子数之和对各个单光子数之和进行归一化处理，获取所述单光子数之和归一化值。

步骤S123:将所述单光子数之和的归一化值转换为灰度值，从而获得各扫描点在不同时点的灰度值。

所述单光子数之和的归一化值分别乘以255后所对应的值为在所述A1点到A1600点的灰度值在以25ps为间隔不同时点的灰度值。

步骤S124：根据各个扫描点在不同时点灰度值以及所述扫描点的位置进行成像，获取在同一波峰波长下，不同时点的荧光寿命时间切片成像。

在本实施例中，通过步骤S121到步骤S123可从所述时间切片矩阵表的第一列可以获得从发射激光时点开始计算，25ps时所述点A1到所述点A1600所对应的单光子数以及所对应的灰度值，从而生成25ps这一刻的荧光寿命时间切片成像。依次类推，所述波峰波长λ1时，时点t＝1ns、时点t＝2ns以及时点t＝5ns的荧光寿命时间切片成像如图13(a)到(c)所示。

与现有技术相比较，本发明的荧光寿命成像方法以及荧光寿命成像装置具有以下优点：

(1)能实现不同波长荧光的光谱信息与荧光寿命同步采集，能准确、全面反映样品荧光寿命情况，提高荧光寿命成像精度，满足多光波荧光样品的测量需要。

(2)能同时或依次获取二维荧光寿命成像、多光波三维荧光寿命成像、荧光寿命时间切片成像，工作效率高。

(3)所获得的荧光寿命成像能从多个维度、多个时点反映的荧光寿命分布情况，为测量提供多种数据。

(4)现有技术使用相机拍摄中受到快门反应速度、感光像素等因素制约相比，具有高时间分辨率和高空间分辨率特点。

(5)图像生成方式简单，运算快，效率高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种荧光寿命成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

设置二维平面扫描区域，在所述二维平面扫描区域内设置扫描点；

获取所述二维平面扫描区域的荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的不同波峰波长；

根据所述波峰波长大小，获取各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命曲线；

根据所述不同波峰波长的所对应的荧光寿命曲线，同时或依次生成不同波峰波长所对应的多光波二维荧光寿命成像、和/或多光波三维荧光寿命成像、和/或二维荧光寿命时间切片成像。

2.根据权利要求1所述的荧光寿命成像方法，其特征在于：生成多光波二维荧光寿命成像包括以下步骤：

在同一二维平面内，根据各个扫描点不同波峰波长时所对应的荧光寿命曲线获取所对应的荧光寿命值；

比较各个荧光寿命值，并获取最大荧光寿命值；

根据所述最大荧光寿命值对各个荧光寿命值进行归一化处理，获取各个荧光寿命值的归一化值；

将各个荧光寿命值的归一化值转换为图像灰度值；

根据各个扫描点在不同波峰波长时的灰度值以及扫描点位置生成多光波二维荧光寿命成像。

3.根据权利要求1所述的荧光寿命成像方法，其特征在于：生成多光波三维荧光寿命成像包括以下步骤：

在设置二维平面扫描区域前，按一定间隔设置法线方向均平行于样品厚度方向的多个二维平面；

分别获取各个二维平面扫描区域的荧光光谱，得到光强处于峰值时所对应的不同波峰波长；

根据所述波峰波长大小，获取各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命曲线；

根据各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命曲线获取各个二维平面内、各个扫描点、不同波峰波长所对应的荧光寿命值；

比较所述荧光寿命值，并获取最大荧光寿命值；

根据所述最大荧光寿命值对各个荧光寿命值进行归一化处理，获取各个荧光寿命值的归一化值；

将各个荧光寿命值的归一化值转换为图像灰度值；

根据各个扫描点在不同波峰波长时的灰度值以及扫描点二维位置生成同一平面的多光波二维荧光寿命成像；

对各个二维平面的二维荧光寿命成像根据所对应的波峰波长进行分类，并根据其厚度方向上的位置依次层叠，从而获得多光波三维荧光寿命成像。

4.根据权利要求1所述的荧光寿命成像方法，其特征在于：生成荧光寿命时间切片成像包括以下步骤：

同一二维平面中，根据各个扫描点不同波峰波长时荧光所的荧光寿命曲线，得到同一扫描点、同一波峰波长下、脉冲周期内各个时点所对应的单光子数之和；

生成时间切片矩阵表，所述时间切片矩阵表的行或列按照各个扫描点依次排序、列或行按照时间间隔依次排序，单元格内容为所述扫描点在所述时点所对应的单光子数之和；

比较所述时间切片矩阵表内各个单光子数之和，并获取最大单光子数之和；

根据所述最大单光子数之和对各个单光子数之和进行归一化处理，获取所述单光子数之和的归一化值；

将所述单光子数之和的归一化值转换为灰度值，获取同一二维平面内、各扫描点、同一波峰波长下、不同时点的灰度值；

根据各个扫描点在不同时点灰度值以及所述扫描点的位置进行成像，获取同一二维平面内、同一波峰波长下，不同时点的荧光寿命时间切片成像。

5.根据权利要求2至4任一项所述的荧光寿命成像方法，其特征在于：将所述归一化值转换为灰度值时，将所述归一化值乘以255后其大小为所述灰度值。

6.一种荧光寿命成像装置，其特征在于：包括双光子荧光激发单元、激光扫描单元、荧光收集单元和成像分析单元；所述荧光激发单元发射激光后进入所述激光扫描单元，所述激光扫描单元控制所述激光在样品的入射位置；所述荧光收集单元获取荧光光谱，并根据所述荧光光谱获取在不同波峰波长下荧光的单光子数从而生成荧光寿命曲线，所述成像分析单元与所述荧光收集单元电连接，并根据所述不同波峰波长下单光子数获取多光波二维荧光寿命成像、和/或多光波三维荧光寿命成像、和/或荧光寿命时间切片成像。

7.根据权利要求6所述的荧光寿命成像装置，其特征在于：所述双光子荧光激发单元包括激光发射器、第一激光校准器和快门；所述激光发射器发射的激光经过所述第一激光校准器进行调整后进入所述快门，然后进入所述激光扫描单元。

8.根据权利要求7所述的荧光寿命成像装置，其特征在于：所述激光扫描单元包括反射镜组、透镜组和单轴位移平台；所述反射镜组将从所述快门射出的激光反射到所述透镜组，所述透镜组将激光聚焦到放置在所述单轴位移平台上的样品中使其产生发出诱导荧光；所述透镜组捕获所述诱导荧光并将其发射到所述荧光收集单元。

9.根据权利要求8所述的荧光寿命成像装置，其特征在于：所述荧光收集装置包括滤色片、第二激光校准器、光谱采集器、增强电荷耦合器以及光子计数器；所述滤色片设置在所述第二激光校准器与所述透镜组之间；所述第二激光校准器对荧光进行聚焦后使其进入所述光谱采集器中；所述光谱采集器、所述增强电荷耦合器以及光子计数器分别与所述成像分析单元电连接；所述光谱采集器在所述成像分析单元控制下改变从其发射出来的荧光的中心波长；所述增强电荷耦合器用于获取荧光光谱；所述光子计数器用于获取所述单光子数。

10.根据权利要求9所述的荧光寿命成像装置，其特征在于：所述光谱采集器包括沿光路依次设置的反射镜、第一准直反射镜、电控分光光栅、第二准直反射镜和光路选择镜；所述反射镜将经所述第二激光校准器聚焦的荧光光束反射到所述第一准直反射镜进行准直，然后进入所述电控分光光栅，然后发射到所述第二准直反射镜，所述光路选择镜将不同波长的光束选择同时或依次发射到所述增强电荷耦合器、和/或所述光子计数器。

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