CN115350241A - 一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物，以生药量计，含有5重量份的黄精和1重量份的黄芩。本发明药物组合物通过上调肺癌细胞内TFRC表达，使得细胞质及线粒体内游离铁离子含量增加，脂质过氧化物积聚，线粒体功能失调，最终诱导肺癌细胞发生铁死亡，从而有效抑制肺癌细胞增殖。

Description

一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种铁死亡诱导剂，特别是涉及一种基于中药药物组合物的铁死亡诱导剂，以及该铁死亡诱导剂在抑制肺癌细胞增殖方面的应用。

背景技术

肺癌（Lung Cancer）在全球拥有较高的发病率和死亡率，约占2020年全球癌症死亡原因的18%，成为男性癌症死亡率的最主要因素，并且在女性癌症死亡率排名中仅次于乳腺癌。

目前肺癌的治疗手段较为局限，仍以手术与放、化疗药物结合为主，免疫靶向治疗为辅，但治疗效果欠佳，且极易诱发肿瘤细胞耐药或其它有害副作用。

虽然靶向治疗在临床中逐渐被重视，但因其适用范围较小，新颖高效的肺癌治疗策略仍有待开发。

中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）在我国的应用已有上千年历史。越来越多的研究发现中药具有抗肿瘤作用，可以抑制肺癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖或转移，近年来被广泛用于各类癌症治疗和放化疗药物的辅助治疗。中药联合应用化疗药物还可以提高放化疗药物的临床疗效，减少副作用。

中医治疗肺癌的基本理论是当机体免疫能力过弱，而肿瘤生长能力过强时，通过“增强自身免疫能力”“消除病邪侵入”，调节机体内部正气与邪气的平衡，即提升机体免疫能力和抑制肿瘤细胞增殖转移。如黄芩清肺祛邪，主驱邪；黄精补肾扶正，主扶正，两者均具有补肺益气、抗炎抗癌的功效。

随着中药在抗肿瘤中的广泛应用，中药抗肿瘤的机制也得到了越来越深入的研究。研究表明，中药可以通过影响DNA甲基化、组蛋白修饰、肿瘤细胞内代谢重编程过程、铁死亡（Ferroptosis）和调节肿瘤微环境等作用抑制肿瘤细胞增殖。

近年来，有研究报道中药能够通过铁死亡途径促进肿瘤细胞死亡。Tang等(Curcumin induces ferroptosis in non-small-cell lung cancer via activatingautophagy. Thoracic cancer. 2021, 12(8): 1219-1230.)发现姜黄素激活细胞自噬途径，促进肺癌细胞发生铁死亡。

铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡，在形态学、遗传学和生物化学方面与其他类型的细胞死亡不同，其特点是细胞发生铁离子依赖性的脂质过氧化反应。铁死亡这种特殊的死亡方式已被证明与多种疾病有关，包括癌症。

因此，针对中药通过铁死亡途径促进肿瘤细胞死亡进行研究，能够为中药发挥抗肿瘤作用提供新的理论支持，也为肺癌患者的临床治疗提供新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物，为中药发挥抗肿瘤作用提供理论支持，也为肺癌患者的临床治疗提供新的思路。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物，以生药量计，所述药物组合物中含有5重量份的黄精和1重量份的黄芩。

本发明以黄精为君药，黄芩为佐使药，将黄精与黄芩按照质量比为5:1联用，结果发现该药物组合物能够有效抑制肺癌细胞生长，并通过实验验证其具体机制为药物组合物通过上调肺癌细胞内转铁蛋白TFRC的表达，导致细胞内及线粒体内游离铁离子增加，脂质过氧化物积聚，最终诱导肺癌细胞发生铁死亡。

本发明结合分析经典方剂和现代化数据库，筛选发现了本发明药物组合物对肺癌的潜在治疗作用，进而利用体外细胞学实验和小鼠皮下瘤模型研究了所述药物组合物对肺癌的作用及机制。

因此，本发明还进一步提供了所述药物组合物在制备通过线粒体铁死亡途径抑制肺癌细胞增殖的药物中的应用。

具体地，所述的药物组合物是通过上调肺癌细胞内转铁蛋白TFRC的表达，干预肺癌细胞铁代谢和肺癌细胞铁死亡。

更具体地，所述的药物组合物是通过上调肺癌细胞内转铁蛋白TFRC的表达，导致细胞内及线粒体内游离铁离子增加，脂质过氧化物积聚，诱导肺癌细胞发生铁死亡。

本发明首先观察了所述药物组合物在体内外对肺癌细胞的作用。不同浓度的药物组合物对肿瘤细胞A549和LLC均有增殖抑制作用，与对照组比较有显著差异，且成浓度依赖关系；小鼠皮下移植瘤实验结果也显示，药物组合物可以显著抑制小鼠皮下瘤生长。细胞学实验和小鼠皮下移植瘤实验结果表明，药物组合物在体内外均可以抑制肺癌细胞的增殖。

进而，在针对瘤体组织进行的蛋白质组学分析中发现，肺癌细胞内的铁转运蛋白TFRC表达量在用药后显著上调。通过查找TCGA数据库，发现与正常人群比较，肺癌病人中的TFRC表达量显著降低，从而证明了所述药物组合物可能是通过上调TFRC表达水平，抑制肿瘤细胞的增殖。

TFRC作为转铁蛋白受体（TFRs）的一种亚型，在细胞表面广泛表达，可与铁-铁转运复合物结合，促进细胞内铁离子的摄入，在细胞发生铁死亡这一过程中具有重要地位。当游离铁离子在肺癌细胞内发生积聚，导致细胞及线粒体内铁离子稳态失衡，芬顿反应（游离的二价铁离子Fe²⁺与过氧化氢H₂O₂反应，生成具有高氧化性的羟自由基·OH）更加活跃，羟自由基及各类活性氧物质的生成增多；当ROS含量超过机体抗氧化系统的清除水平时，肺癌细胞膜及细胞器膜上的不饱和脂肪酸即可被氧化，形成脂质过氧化物，直接或间接地破坏各类细胞器和细胞的结构与功能，导致细胞损伤或死亡。

进而，本发明针对所述药物组合物通过上调TFRC表达使得肺癌细胞发生铁死亡这一机制进行了实验验证，结果显示，所述药物组合物能上调TFRC在肺癌细胞A549和LLC内的表达水平，并且铁死亡抑制剂与所述药物组合物联用，能显著缓解药物组合物对肿瘤细胞的杀伤作用；药物组合物与对照组比较，肿瘤细胞的细胞质及线粒体内游离铁离子含量显著增加，线粒体膜电位明显降低，胞内ROS显著增加，细胞质及线粒体内脂质过氧化物明显积聚。

以上结果共同验证了本发明药物组合物通过诱导肺癌细胞发生铁死亡，从而抑制肺癌细胞生长，这将有望为临床中肺癌病人的治疗提供新的方案策略。

附图说明

图1是药物组合物对肺癌细胞形态的影响。

图2是不同比例药物组合物对肺癌细胞A549和LLC增殖的抑制率。

图3是药物组合物抑制小鼠皮下瘤生长的组织图像和肿瘤体积统计结果。

图4是小鼠的肿瘤体积增长曲线和体重增长曲线。

图5是铁死亡抑制剂Fer-1和DFOM抑制药物组合物在A549和LLC中诱导的铁死亡。

图6是药物组合物上调TFRC的表达。

图7是药物组合物分别增加A549和LLC细胞质与线粒体内的游离铁离子含量。

图8是药物组合物分别升高A549和LLC细胞质与线粒体内的脂质过氧化水平。

图9是药物组合物降低A549和LLC细胞的线粒体膜电位。

图10是药物组合物增加细胞内的ROS含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

本发明实施例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。

本发明实施例中使用的细胞包括：人肺癌细胞A549（中国科学院细胞培养库），培养于RMPI 1640（含10% FBS，1% Pen Strep）培养基中；鼠源Lewis肺癌细胞LLC（上海中桥新洲技术有限公司），用DMEM（含10% FBS，1% Pen Strep）培养基培养；置于37℃、5% CO₂培养箱中，胰蛋白酶消化传代，每2-3天传代一次。

本发明实施例使用的实验动物为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级C57BL/6雄鼠，4周龄，体重约20g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，在上海同济大学沪北校区动物饲养室饲养，屏障系统洁净层流架内温度（25±1）℃，相对湿度40%-60%，生长所需垫料、饲料和饮水均经灭菌处理，每日保持12h光照、12h阴暗周期。所有实验均按照同济大学动物实验委员会的动物护理指南进行。

铁死亡抑制剂Fer-1：2.5μM，HY-100579，MCE，China。

铁死亡抑制剂DFOM：10μM，HY-B0988，MCE，China。

以下为实施例中使用药物组合物（简称HH）作为实验药物的具体用法和用量。

根据临床用药指征，每人每日服用量相当于黄精生饮片30g，黄芩生饮片6g。

本发明实施例中使用的黄精与黄芩均为中药提取浓缩颗粒剂，由江阴天江药业有限公司生产，每4g黄精颗粒相当于10g生饮片，每2g黄芩颗粒相当于10g生饮片，按照黄精与黄芩的用量比为5:1，实施例中使用的实验药物HH为黄精颗粒:黄芩颗粒=10:1。

小鼠用药剂量（g）按照公式：小鼠每日服药剂量=9.1×每人每日服用剂量g/60kg，每只小鼠每日服用黄精生饮片4.55g，黄芩生饮片0.91g。

动物实验采用饲料给药方式，按照每只小鼠采食量3g/天制作HH饲料，每公斤普通饲料中添加12.13g黄精颗粒和1.213g黄芩颗粒，由无锡帆泊生物技术有限公司制作。

细胞实验使用的HH浓度分别为2.75mg/mL、5.5mg/mL、11mg/mL和22mg/mL。

以下实施例中的实验数据均采用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果用

表示；组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05为具有统计学差异。

实施例1：药物组合物抑制肺癌细胞活力、诱导肺癌细胞死亡。

使用不同浓度的药物组合物处理肺癌细胞A549和LLC，24h后镜下观察肺癌细胞A549和LLC的形态。

图1中显示，经过不同浓度的药物组合物处理后，A549和LLC的形态均出现异常改变，A549贴壁性变差，由梭形逐渐变圆，漂浮细胞数增多；LLC出现异常触角，活力下降。同时，肺癌细胞A549和LLC的数量也明显减少，并呈浓度依赖性。

在不同浓度药物组合物作用肺癌细胞A549和LLC 48h后，CCK8检测细胞活力。检测结果表明，不同浓度药物组合物对肺癌细胞A549和LLC的增殖均有不同程度抑制，抑制作用随着药物组合物浓度的增加而增强（图2A），表明药物组合物呈剂量依赖性抑制肺癌细胞A549和LLC的生长。

以药物组合物针对肺癌细胞A549和LLC作用48h后，得到半数抑制浓度（IC₅₀）分别为9.315mg/mL和5.886mg/mL。

作为对照，增加了黄芩在药物组合物中的含量，将黄精与黄芩的生饮片剂量增加至2.5:1。

图2B和图2C中测得增加黄芩后的药物组合物对A549和LLC细胞作用48h后的IC₅₀分别为2.286mg/mL和6.618mg/mL。

因此，本发明最终选择药物组合物中黄精与黄芩的生饮片剂量为5:1进行实验，在黄芩发挥“驱邪”作用的同时发挥黄精的“扶正”益气作用。

实施例2：药物组合物抑制小鼠皮下瘤生长。

运用C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型探讨药物组合物对治疗体内肿瘤的作用。

将C57BL/6小鼠适应性饲养一周后，于小鼠背部注射1×10⁶个Lewis肺癌细胞，建立肺癌移植瘤模型。将模型小鼠随机分为用药组和对照组，用药组小鼠饲料换成含有药物组合物的特定饲料。

各组小鼠连续观察18天，实验中隔天记录小鼠体重和瘤体大小。

首先对剥离的瘤体组织进行统计分析，发现用药18天后，用药组小鼠的瘤体较对照组明显缩小（图3A），且有显著性差异（图3B）。

进一步对小鼠瘤体的增长速度和体重进行统计分析，发现用药组小鼠的瘤体增长速度较对照组显著降低（图4A），而用药组小鼠的体重与对照组小鼠无显著性变化（图4B）。

谷草转氨酶（AST）和肌酐（Cr）被用于评估药物组合物干预后小鼠的肝肾功能。实验结果显示用药组小鼠ASL和Cr水平较对照组未见明显改变。

动物实验结果表明，本发明药物组合物对小鼠皮下瘤有治疗作用。

实施例3：药物组合物通过铁死亡途径发挥杀伤肿瘤细胞作用。

为探索药物组合物是否通过铁死亡途径发挥对肺癌细胞的杀伤作用，选用两种铁死亡特异性抑制剂Fer-1和DFOM进行验证。

首先，针对两种铁死亡抑制剂的细胞毒性作用进行考察，结果发现2.5μM Fer-1和10μM DFOM对细胞的毒副作用较小，其细胞生存率降低幅度较小。

接着，分别以两种铁死亡抑制剂与本发明药物组合物联用，对肺癌细胞A549和LLC处理48h。

图5给出了不同处理对细胞A549和LLC活力的影响，其中药物组合物对A549细胞的处理浓度为11mg/mL，对LLC细胞的处理浓度为5.5mg/mL；Fer-1浓度2.5μM，DFOM浓度10μM。

图5A和图5B中，与药物组合物明显降低了细胞A549和LLC活力的结果比较，药物组合物与铁死亡抑制剂Fer-1联用后的细胞存活率显著增加，证明Fer-1能够缓解药物组合物对肺癌细胞的杀伤作用。

同样，图5C和图5D中，与药物组合物明显降低了细胞A549和LLC活力的结果比较，药物组合物与铁死亡抑制剂DFOM联用后的细胞存活率明显增加，证明DFOM也能够缓解药物组合物对肺癌细胞的杀伤作用。

实施例4：药物组合物对肿瘤细胞内TFRC表达量和铁离子含量的影响。

本发明通过对用药组和对照组小鼠瘤体进行蛋白质组学分析，筛选出了若干个差异蛋白。其中，差异蛋白TFRC在用药组中明显上调。同时搜索TCGA数据库，发现TFRC在肺癌人群中的表达水平显著较正常人群低。

本发明进一步对用药组瘤体中Tfrc的转录表达进行分析，发现Tfrc的表达量在用药组中显著增加，说明使用本发明药物组合物后小鼠瘤体中TFRC表达显著升高。

进而，使用本发明药物组合物处理A549和LLC细胞6h后，qPCR检测细胞中TFRC的mRNA表达情况，细胞内TFRC转录水平的表达量较对照组显著增加（图6A）；用药24h后，WB法检测细胞A549和LLC中TFRC的蛋白表达也明显上调（图6B）。

用药24h后，分别以FerroOrange工作液（F374，DOJINDO，JAPAN）和Mito-FerroGreen工作液（M489，DOJINDO，JAPAN）检测A549和LLC细胞质与线粒体内的游离铁离子含量，共聚焦显微镜下观察。图7中A和B显示用药后细胞质与线粒体中的铁离子含量均显著增加，并且与用药浓度正相关，药物组合物浓度越高，细胞质和线粒体内的铁离子含量越高。

药物组合物作用24h后，分别以Liperfluo工作液（L248，DOJINDO，JAPAN）和MitoPeDPP工作液（M466，DOJINDO，JAPAN）对A549和LLC细胞质及线粒体内的脂质过氧化物进行检测，观察结果如图8所示，发现用药后细胞质（A）及线粒体（B）内的脂质过氧化物含量均明显增加。

上述结果表明，本发明药物组合物通过上调TFRC表达，促使肿瘤细胞富集大量游离铁离子。当细胞内游离Fe²⁺含量增加时，芬顿反应更加活跃，羟自由基及各类活性氧类生成增多，脂质过氧化物增加。

进一步地，在对线粒体的膜电位进行检测发现，在肺癌细胞A549和LLC中，用药组的线粒体膜电位明显低于对照组，且结果具有统计学差异（图9），提示药物组合物可能破坏线粒体的膜稳定性。

同时，流式测定用药24h后细胞A549和LLC内ROS含量，发现用药组细胞内ROS水平明显上升（图10）。细胞中ROS的积累使得细胞更易受到氧化攻击，加剧细胞不稳定性，促进细胞死亡。

因此，上述实验结果显示，本发明药物组合物通过上调肺癌细胞内TFRC的表达，使得细胞质及线粒体内游离铁离子含量增加，进一步导致脂质过氧化物积聚，线粒体功能失调，最终诱导肺癌细胞发生铁死亡。

本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种可以作为铁死亡诱导剂的药物组合物，以生药量计，所述药物组合物中含有5重量份的黄精和1重量份的黄芩。

2.权利要求1所述药物组合物在制备通过线粒体铁死亡途径抑制肺癌细胞增殖的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述药物组合物通过上调肺癌细胞内转铁蛋白TFRC的表达，干预肺癌细胞铁代谢和肺癌细胞铁死亡。

4.根据权利要求2所述的应用，所述药物组合物通过上调肺癌细胞内转铁蛋白TFRC的表达，导致细胞内及线粒体内游离铁离子增加，脂质过氧化物积聚，诱导肺癌细胞发生铁死亡。

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