CN115349490A - 一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法，属于动物模型领域。所述方法包括以下步骤：对动物注射甲状腺球蛋白抗原11周以上，同时给予高碘喂养。本发明利用抗原免疫诱导结合高碘水喂养造模的方法，成功建立了卵巢储备功能低下动物模型。本发明的建模方法不会引起肝脏损伤等副作用，本发明建立的动物模型不仅可以用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下的药物的疗效和/或安全性，还能用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎药物的疗效和/或安全性。本发明的建模方法简单便捷，容易操作，应用前景广阔。

Description

一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法

技术领域

本发明属于动物模型领域，具体涉及一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法。

背景技术

卵巢储备功能是指卵巢内存留卵泡的数量和质量，反映女性的生育潜能。卵巢储备功能低下(decreasing ovarian reserve，DOR)是指卵巢中的存留卵子量降到阈值以致影响了生育潜能，导致生育力低下，临床表现为不孕，闭经，月经后错等。DOR进一步可发展为卵巢功能衰竭。卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性40岁以前发生卵巢功能衰竭，表现为继发性闭经或绝经、不孕。DOR及POF导致的生育力丧失及低雌激素状态已经成为影响女性生殖健康的两大威胁。随着辅助生殖技术(ART)的日臻成熟，越来越多的不育妇女解决了生育问题，但是ART的疗效远未达到人们的期望值，许多因素影响ART的成功，如卵巢储备功能、免疫因素、子宫条件以及精子质量等等，其中卵巢储备功能起着重要作用。

卵巢储备功能低下和卵巢早衰的病因迄今仍不甚明了，综合文献报道，认为可能与遗传因素、酶缺乏、促性腺激素及其受体异常、自身免疫损伤、特发性、卵巢破坏性因素(放疗、化疗、手术、感染等)、卵细胞储备过少或耗竭过多等有关。因此，许多学者都在寻找一种理想、可靠、符合病因学的方法来建立DOR及POF动物模型，以深入研究两者的发生、演变规律，探索出安全、有效的治疗方法，对提高女性的生育能力及生活质量有着具有重要意义。

文献(中国实验动物学报，2007年第15卷第1期)公开了一种用化疗药物构建DOR动物模型的方法，该方法以3.0～4.0mg/(kg·bw)的顺铂作用小鼠7d后，引起小鼠出现明显的卵巢功能衰退，成功构建了DOR动物模型。但是，该方法在引起卵巢功能衰退的同时，还引起了严重的肝脏损伤，利用该方法构建的DOR动物模型和患者临床表现不一致，不便用于治疗卵巢储备功能低下的药物的安全性评价。

因此，提供一种不会引起肝脏损伤等副作用的卵巢储备功能低下动物模型构建方法，对评价治疗卵巢储备功能低下的药物的疗效和安全性，以及研究卵巢储备功能低下和卵巢早衰发生、演变规律具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢储备功能低下动物模型或卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎动物模型的建立方法。

本发明提供了一种建立卵巢储备功能低下动物模型或卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：对动物注射甲状腺球蛋白抗原11周以上，同时给予高碘喂养。

进一步地，所述注射甲状腺球蛋白抗原的剂量为0.05-0.20mg/次，1-3次/周；

优选地，所述注射甲状腺球蛋白抗原的剂量为0.1mg/次，2次/周。

进一步地，所述注射甲状腺球蛋白抗原的方式为：第1-2周注射初次免疫乳化剂，第3周以后注射强化免疫乳化剂；其中，初次免疫乳化剂是由甲状腺球蛋白抗原的水性溶液与弗氏完全佐剂制备而成的乳化剂，强化免疫乳化剂是由甲状腺球蛋白抗原的水性溶液与弗氏不完全佐剂制备而成的乳化剂。

进一步地，所述水性溶液为去离子水溶液或磷酸盐缓冲溶液。

进一步地，所述初次免疫乳化剂中，甲状腺球蛋白抗原的浓度为0.3-0.7mg·ml^-1，优选为0.5mg·ml^-1；

所述强化免疫乳化剂中，甲状腺球蛋白抗原的浓度为0.3-0.7mg·ml^-1，优选为0.5mg·ml^-1。

进一步地，所述甲状腺球蛋白抗原为猪甲状腺球蛋白抗原；

和/或，所述注射的方式为皮下注射。

进一步地，所述高碘喂养的方式为：将碘化试剂加入水中配制成高碘水进行喂养。

进一步地，所述高碘水中，碘化试剂的浓度为0.30-1.00g·L^-1，优选为0.64g·L^-1；

和/或，所述碘化试剂为碘化钠。

进一步地，所述注射甲状腺球蛋白抗原的时间为11-15周。

进一步地，所述动物为哺乳动物，优选为小鼠。

在建立上述动物模型期间，动物按需自由进食，自由饮水。

本发明还提供了上述方法建立的动物模型在评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下或卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎的药物的疗效和/或安全性中的用途。

实验结果表明，利用本发明抗原免疫诱导结合高碘水喂养造模的方法，在初次免疫2周+强化免疫9～13周+高碘水喂养的条件下，成功建立了卵巢储备功能低下动物模型。同时，本发明在初次免疫2周+强化免疫9～13周+高碘水喂养的条件下建立的卵巢储备功能低下动物模型是伴随实验性自身免疫性甲状腺炎的动物模型。

本发明的建立方法不会引起肝脏损伤等副作用，本发明建立的动物模型不仅可以用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下的药物的疗效和/或安全性，还能用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎药物的疗效和/或安全性。

本发明的建模方法简单便捷，容易操作，应用前景广阔。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.各组小鼠卵巢HE染色结果。

图2.各组小鼠卵巢HE染色结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

1.动物

昆明小鼠，雌性，8-9周龄，48只，体重25-30g，由成都达硕实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK(川)2020030)，饲料由成都达硕实验动物有限公司提供。分笼饲养于成都中医药大学妇科实验室。饲养环境通风良好，温度保持在20-24℃，相对湿度40％-79％，昼夜光照。本研究通过成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审核，伦理审查编号：2021DL-002。

2.试剂

猪甲状腺球蛋白(安徽经科生物技术有限公司，货号：JKH0040)、碘化钠晶体(天津市科密欧化学试剂有限公司，货号：7681-82-5)、弗氏完全佐剂CFA·(货号：F5881-10)与弗氏不完全佐剂IFA(货号：F5506-10)均由sigmaaldrich试剂公司生产、四川赛因斯特生物科技有限公司提供。

3.试剂配制

将0.64g碘化钠晶体与1L纯净水混合,配成浓度为0.64g·L^-1的高碘水。将猪甲状腺球蛋白(pTg)抗原溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中配制成1mg·ml^-1抗原溶液。将弗氏完全佐剂(CFA)和抗原溶液以1：1体积比分别吸入1个50ml离心管中，将离心管放置在漩涡振荡器上高速震荡(约2000转/分)40分钟，直至形成黏稠的初次免疫乳化剂，使其最终浓度达0.5mg·ml^-1，现配现用。将弗氏不完全佐剂(IFA)和抗原溶液以1:1体积比,如同初次免疫乳化剂制备方法,制备成0.5mg·ml^-1油包水的强化免疫乳化剂。

4.实验仪器

大型台式冷冻离心机美国(Thermo Scientific公司，型号：Contfuge Stratos)，转轮式切片机(德国徕卡(Leica)公司，徕卡-2016)，JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)，BMJ-A型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)，RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司)，PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)，数字切片扫描仪(3DHISTECH Ltd，Pannoramic 250，3DHISTECH(Hungary)酶标仪(美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMAX Plus384)。

实施例1卵巢储备功能低下动物模型的构建方法

将昆明雌性小鼠适应性喂养1周后，分别于小鼠颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射初次免疫乳化剂(0.5mg·ml^-1·0.2ml)·2次/周，持续2周，期间高碘水喂养；继续小鼠皮下多点皮下注射强化免疫乳化剂(0.5mg·ml^-1·0.2ml)·2次/周，持续5-13周，期间高碘水喂养，构建得到卵巢储备功能低下动物模型。

实施例2卵巢储备功能低下动物模型的构建方法

将昆明雌性小鼠适应性喂养1周后，分别于小鼠颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射初次免疫乳化剂(0.5mg·ml^-1·0.2ml)·2次/周，持续2周，期间高碘水喂养；继续小鼠皮下多点皮下注射强化免疫乳化剂(0.5mg·ml^-1·0.2ml)·2次/周，持续13周，期间高碘水喂养；停止抗原免疫诱导，继续高碘水喂养2-4周，构建得到卵巢储备功能低下动物模型。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1不同造模时间下的动物模型评价

1.实验方法

1.1分组与造模

将96只昆明雌性小鼠适应性喂养1周后，按小鼠体重大小编号，采用随机数字表法进行分组，分为J对照组、BIW对照组、J模型组、BIW模型组。J模型组与BIW模型组按照取材时间窗分为J1-J7组与BIW1-BIW7组。J对照组与BIW对照组分别于小鼠颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射PBS缓冲液1次·0.2ml·周^-1和2次·0.2ml·周^-1。J模型组与BIW模型组分别于小鼠颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射初次免疫乳化剂1次·0.2ml·周^-1和2次·0.2ml·周^-1，持续2周；继续分别多点皮下注射强化免疫乳化剂1次·0.2ml·周^-1和2次·0.2ml·周^-1，持续5-13周；停止抗原免疫诱导，继续高碘水喂养2-4周。各组干预方法见表1。

表1.各组造模取材时间窗及干预方法

取材时间	J组	BIW组	取材(n)	干预方法
					第7周	J对照组	BIW对照组	5	皮下多点注射PBS缓冲液7周+自来水喂养
第7周	J1组	BIW1组	6	初次免疫2周+强化免疫5周+高碘水喂养
					第9周	J2组	BIW2组	6	初次免疫2周+强化免疫7周+高碘水喂养
第11周	J3组	BIW3组	5	初次免疫2周+强化免疫9周+高碘水喂养
					第13周	J4组	BIW4组	5	初次免疫2周+强化免疫11周+高碘水喂养
第15周	J5组	BIW5组	5	初次免疫2周+强化免疫13周+高碘水喂养
					第17周	J6组	BIW6组	5	停止抗原免疫诱导，继续高碘水喂养2周
第19周	J7组	BIW7组	5	停止抗原免疫诱导，继续高碘水喂养4周

1.2取材

通过阴道涂片观察小鼠动情周期，选择动情前期，以水合氯醛麻醉(4％)腹腔注射麻醉，通过眼眶静脉丛采血，离心后吸取上层小鼠血清冻存待测。脱颈处死小鼠，剥离甲状腺置于4％多聚甲醛固定液中固定，用于HE染色。摘取小鼠双侧卵巢，将右侧卵巢置于4％多聚甲醛固定液中固定，用于HE染色，左侧卵巢放入EP管，液氮速冻待测。

1.3甲状腺与卵巢组织病理学观察

甲状腺组织病理评分参考Charveire分类法，固定的甲状腺、卵巢组织包埋于石蜡中，以5μm厚度连续切片，HE染色后在放大100倍和400倍观察甲状腺组织病理改变和卵巢的各级卵泡计数。

1.4酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清甲状腺抗体、甲功、AMH及氧化应激标记物

参照ELISA试剂盒说明书标准操作流程分别检测各组小鼠血清中甲状腺抗体TPOAb、TGAb，甲功TSH、FT3、FT4，卵巢储备功能指标AMH和氧化应激标记物GSH-PX、MDA、ROS、SOD的浓度。

1.5统计学方法

若数据符合正态分布，方差齐，则使用ANOVA单因素方差分析中的LSD检验进行组间多重比较；若方差不齐，则用Games-Howelltest检验进行组间多重比较。所有统计检验均采用双侧检验，当P＜0.01具有显著统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各级卵泡计数

表2.各组小鼠各级卵泡及黄体数目

组别

n

原始卵泡

初级卵泡

次级卵泡

成熟卵泡

闭锁卵泡

黄体数

BIW对照组

5

13.40±2.07

12.60±2.96

6.00±2.23

1.00±1.00

2.20±1.30

4.20±1.30

BIW1组

6

9.50±2.42

8.50±3.72

3.00±1.41

1.33±1.03

3.00±1.54

3.50±1.04

BIW2组

6

9.66±2.16

7.50±4.50

3.00±1.78

0.67±1.211

3.17±1.16

1.83±1.16<sup>*</sup>

BIW3组

5

8.80±1.48<sup>*</sup>

6.00±2.23

3.80±1.64

1.20±.83

9.00±3.16<sup>*</sup>

1.60±0.89<sup>*</sup>

BIW4组

5

8.20±1.30<sup>**</sup>

5.00±2.34<sup>*</sup>

2.80±1.48

1.00±1.22

8.20±3.76<sup>*</sup>

1.40±0.55<sup>**</sup>

BIW5组

5

7.40±2.51<sup>**</sup>

4.80±2.77<sup>*</sup>

2.00±1.00<sup>*</sup>

1.80±1.09

9.00±3.16<sup>*</sup>

1.20±0.44<sup>**Δ1</sup>

BIW6组

5

6.20±1.92<sup>**</sup>

3.80±2.77<sup>**</sup>

1.80±1.09<sup>*</sup>

1.40±0.54

9.60±3.64<sup>**</sup>

1.20±1.64<sup>**Δ1</sup>

BIW7组

5

6.00±1.22<sup>**</sup>

3.43±3.40<sup>**</sup>

1.80±0.83<sup>*</sup>

1.00±0.70

9.40±3.50<sup>**</sup>

1.00±1.23<sup>**Δ1</sup>

注：模型组(BIW1-7组)与BIW对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；模型组组间比较，与BIW1组比较：^Δ1P＜0.05，^ΔΔ1P＜0.01；与BIW2组比较：^Δ2P＜0.05，^ΔΔ2P＜0.01；与BIW3组比较：^Δ3P＜0.05，^ΔΔ3P＜0.01；与BIW4组比较：^Δ4P＜0.05，^ΔΔ4P＜0.01；与BIW5组比较：^Δ5P＜0.05，^ΔΔ5P＜0.01；与BIW6组比较：^Δ6P＜0.05，^ΔΔ6P＜0.01；与BIW7组比较：^Δ7P＜0.05，^ΔΔ7P＜0.01。

与BIW对照组相比：BIW3组原始卵泡明显减少(P＜0.05)，BIW4组、BIW5组、BIW6组、BIW7组原始卵泡显著减少(P＜0.01)；BIW4组、BIW5组初级卵泡明显减少(P＜0.05)，BIW6组、BIW7组初级卵泡显著减少(P＜0.01)；BIW5组、BIW6组、BIW7组次级卵泡明显减少(P＜0.05)；BIW3组、BIW4组、BIW5组闭锁卵泡明显增多(P<0.05)，BIW6组、BIW7组闭锁卵泡显著增多(P<0.01)；BIW2组、BIW3组黄体数明显减少(P<0.05)；BIW4组、BIW5组、BIW6组、BIW7组黄体数显著减少(P<0.01)，其余模型组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

BIW模型组组间比较：BIW1组、BIW2组、BIW3组、BIW4组、BIW5组、BIW6组、BIW7组组间原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡差异无统计学意义(P＞0.05)，BIW5组、BIW6组、BIW7组的黄体数较BIW1组明显减少(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。。各组小鼠卵巢HE染色见图1和图2。

可以看出，利用本发明抗原免疫诱导结合高碘水喂养造模的方法，在初次免疫2周+强化免疫9～13周+高碘水喂养的条件下，成功建立了卵巢储备功能低下动物模型。

2.2甲状腺的HE染色

J组与BIW组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度、甲状腺滤泡结构改变、病理总分方差不齐，故采用Games-Howelltest检验。J模型组和BIW模型组的甲状腺HE染色结果分别见表3、表4。

表3.J组甲状腺Charveire评分统计结果

注：同表2。

与J对照组相比：J1、2组的甲状腺未见明显病理改变(P＞0.05)；J3组3/5例小鼠出现明显的甲状腺淋巴细胞浸润和滤泡结构改变，即成模率60％，但该组各病理评分差异无统计学意义(P＞0.05)；J4-7组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度、甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分均显著升高(P<0.01)。J模型组组间比较：J4-7组小鼠甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分较J1-3组显著升高(P<0.01)；J4组、J5组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度均较J1组、J2组明显增加(P<0.05)；J6、7组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度较J1组、J2组显著增加(P<0.01)且较J3组明显增加(P<0.05)。其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

表4.BIW组甲状腺Charveire分类评分统计结果

注：同表2。

与BIW对照组相比，BIW1组小鼠甲状腺未见明显病理改变(P＞0.05)；BIW2组3/6小鼠出现甲状腺出现明显的甲状腺淋巴细胞浸润和甲状腺滤泡结构改变，即成模率50％，但该组各病理评分差异无统计学意义(P＞0.05)。BIW3-7组小鼠甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分均显著升高(P＜0.01)，BIW3组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度明显增加(P＜0.05)，BIW4-7组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度显著增加(P＜0.01)。BIW模型组组间比较，BIW3-5组小鼠甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分均较BIW1组明显升高(P＜0.05)，BIW6、7组小鼠甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分均较BIW1、2组显著升高(P＜0.01)，BIW3-5组均较BIW1组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度明显升高(P＜0.05)，BIW6、7组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度较BIW1、2组显著升高(P＜0.01)。其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

J模型组和BIW模型组甲状腺病理评分随着造模时间延长均有逐渐升高的趋势。

2.3血清甲状腺抗体、甲状腺功能

结果分别见表5、表6。

表5.J组小鼠血清ELisa结果

组别	TGAb(IU/mL)	TPOAb(pg/mL)	FT3(pmol/L)	FT4(pmol/L)	TSH(mU/L)
						J对照	9.64±1.28	21.81±3.20	4.99±0.45	7.51±1.22	3.47±0.49
J1组	12.28±2.09	23.38±2.60	4.66±0.61	6.95±0.69	3.58±0.69
						J2组	9.90±0.97	23.32±4.32	4.63±0.83	7.39±1.43	3.43±0.74
J3组	11.79±0.69	26.51±2.02	4.46±0.65	6.42±1.10	4.39±1.43
						J4组	12.84±2.04<sup>*Δ2</sup>	31.81±6.78<sup>**ΔΔ1，2Δ3</sup>	4.27±0.64	6.65±0.87	4.41±0.58
J5组	13.98±4.00<sup>**ΔΔ2</sup>	35.80±4.62<sup>**ΔΔ1,2,3</sup>	4.22±0.65	6.65±0.90	4.35±1.56
						J6组	12.07±0.97<sup>*</sup>	31.46±4.24<sup>**ΔΔ1,2</sup>	4.14±0.74<sup>*</sup>	5.51±0.77<sup>**Δ1</sup>	4.56±0.92<sup>*Δ2</sup>
J7组	13.31±2.51<sup>**ΔΔ2</sup>	32.32±5.80<sup>**ΔΔ1,2,Δ3</sup>	4.14±0.67<sup>*</sup>	5.67±1.06<sup>**Δ1</sup>	4.71±0.52<sup>*Δ1，2</sup>

注：同表2。

与J对照组相比：J4-7组TPOAb水平显著升高(P＜0.01)；J4组、J6组TGAb水平明显升高(P<0.05)，J5组、J7组TGAb水平显著升高(P<0.01)；J6组、J7组TSH水平明显升高(P<0.05)，FT3、FT4水平明显下降(P<0.05)。J模型组组间比较：J5组、J7组TGAb水平较J2组显著升高(P<0.01)，J4组TGAb水平较J2组明显升高(P<0.05)；J4-7组TPOAb水平较J1组、J2组显著升高(P<0.01)，J4组、J5组、J7组TPOAb水平较J3组升高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；J模型组组间FT3差异不具有统计学意义(P＞0.05)，J6组、J7组FT4较J1组明显下降(P<0.05)；J6组TSH水平较J1组明显升高(P<0.05)，J7组较J1组、J2组明显升高(P<0.01)。其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

表6.BIW组小鼠血清ELisa结果

注：同表2。

与BIW对照组相比：Biw3组、Biw4组TGAb水平明显升高(P<0.05)，BIW 5-7组TGAb水平显著升高(P<0.01)；Biw3-7组TPOAb浓度显著升高(P<0.01)；BIW 6组FT3、FT4水平显著下降(P<0.01)；BIW 7组FT3、FT4水平明显下降(P<0.05)；BIW5组TSH水平明显升高(P<0.05)；BIW6组、BIW7组TSH水平显著升高(P<0.01)。BIW模型组组间比较：BIW 5组TGAb水平较BIW1组、BIW 2组显升高(P<0.05)，Biw6组、Biw7组TGAb水平较BIW1组、BIW 2组显著升高(P<0.01)；Biw4-7组TPOAb水平显著高于BIW1组、BIW2组(P<0.01)，BIW3组TPOAb水平较BIW1组、BIW2组升高(P<0.01，P<0.05)；BIW6组FT3较BIW1组、BIW2组显著下降(P<0.01)；BIW6组、BIW7组TSH较BIW1组升高(P<0.05，P<0.01)，BIW7组TSH较BIW2组明显升高(P<0.05)。其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

2.4血清氧化应激标记物及AMH水平

表7.各组小鼠血清中GSH-PX、MDA、ROS、SOD浓度

注：同表2。

与BIW对照组相比：Biw3组、Biw4组GSH-PX明显降低(P<0.05)，Biw5组、Biw6组、Biw7组GSH-PX显著降低(P<0.01)；Biw3组MDA明显升高(P<0.05)，BIW4组、Biw5组、Biw6组、Biw7组MDA显著升高(P<0.01)；Biw3组、BIW4组ROS明显升高(P<0.05)，Biw5组、Biw6组、Biw7组ROS显著升高(P<0.01)；Biw4组、Biw5组SOD浓度明显降低(P<0.05)，Biw6组、Biw7组SOD浓度显著降低(P<0.01)；BIW3组AMH水平明显下降(P<0.05)；BIW4组、Biw5组、Biw6组、Biw7组AMH水平显著下降(P<0.01)；其余模型组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

BIW模型组组间比较：Biw5组、Biw7组GSH-PX浓度明显低于BIW2组(P<0.05)，Biw6组GSH-PX浓度明显低于BIW1组(P<0.05)和显著低于BIW2组(P<0.01)；BIW4组、Biw5组、Biw6组、Biw7组MDA浓度明显高于BIW1组(P<0.05)，Biw6组、Biw7组MDA浓度显著高于BIW2组(P<0.01)，BIW5组MDA明显高于BIW2组(P<0.05)；Biw3组、BIW4组、Biw5组、Biw6组、Biw7组ROS浓度显著高于BIW1组(P<0.01)，BIW6组、BIW7组ROS浓度显著高于BIW2组(P<0.01)，BIW5组ROS浓度明显高于BIW2组(P<0.05)，BIW6组ROS浓度明显高于BIW3组(P<0.05)；Biw6组、Biw7组SOD浓度明显低于BIW1组(P<0.05)，Biw7组SOD浓度明显低于BIW2组(P<0.05)；BIW4组、Biw5组、Biw6组、Biw7组AMH较BIW1组、BIW2组明显下降(P<0.01)；其余组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

从上述实验结果看出，第7周取材的BIW1组小鼠，仅有1只小鼠(⑥号)有甲状腺滤泡结构略有改变，甲状腺淋巴细胞浸润、甲状腺抗体(TGAb、TPOAb)、甲功、各级卵泡计数、黄体与对照组差异不具有统计学意义；第9周取材的BIW2组有50％(3/6)小鼠出现甲状腺淋巴细胞浸润和滤泡结构改变，TGAb、TPOAb有所升高，此时黄体数目较对照组明显减少，但各级卵泡计数差异不具有统计学意义；第11周取材的BIW3组小鼠均出现甲状腺淋巴细胞浸润、滤泡结构改变和甲状腺抗体(TGAb、TPOAb)明显/显著升高，氧化应激(ROS、MDA)明显增加，抗氧化应激标记物GSH-PX明显下降，此时小鼠原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡均较BIW对照组明显减少，闭锁卵泡明显增多。

也就是说，利用本发明抗原免疫诱导结合高碘水喂养造模的方法，在初次免疫2周+强化免疫9～13周+高碘水喂养的条件下，成功建立了卵巢储备功能低下动物模型。同时，本发明在初次免疫2周+强化免疫9～13周+高碘水喂养的条件下建立的卵巢储备功能低下动物模型是伴随实验性自身免疫性甲状腺炎的动物模型。

综上，本发明提供了一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法。本发明利用抗原免疫诱导结合高碘水喂养造模的方法，成功建立了卵巢储备功能低下动物模型。本发明的建模方法不会引起肝脏损伤等副作用，本发明建立的动物模型不仅可以用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下的药物的疗效和/或安全性，还能用于评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎药物的疗效和/或安全性。本发明的建模方法简单便捷，容易操作，应用前景广阔。

Claims (10)

1.一种建立卵巢储备功能低下动物模型或卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎动物模型的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：对动物注射甲状腺球蛋白抗原11周以上，同时给予高碘喂养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述注射甲状腺球蛋白抗原的剂量为0.05-0.20mg/次，1-3次/周；

优选地，所述注射甲状腺球蛋白抗原的剂量为0.1mg/次，2次/周。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述注射甲状腺球蛋白抗原的方式为：第1-2周注射初次免疫乳化剂，第3周以后注射强化免疫乳化剂；其中，初次免疫乳化剂是由甲状腺球蛋白抗原的水性溶液与弗氏完全佐剂制备而成的乳化剂，强化免疫乳化剂是由甲状腺球蛋白抗原的水性溶液与弗氏不完全佐剂制备而成的乳化剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述初次免疫乳化剂中，甲状腺球蛋白抗原的浓度为0.3-0.7mg·ml^-1，优选为0.5mg·ml^-1；

所述强化免疫乳化剂中，甲状腺球蛋白抗原的浓度为0.3-0.7mg·ml^-1，优选为0.5mg·ml^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甲状腺球蛋白抗原为猪甲状腺球蛋白抗原；

和/或，所述注射的方式为皮下注射。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述高碘喂养的方式为：将碘化试剂加入水中配制成高碘水进行喂养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述高碘水中，碘化试剂的浓度为0.30-1.00g·L^-1，优选为0.64g·L^-1；

和/或，所述碘化试剂为碘化钠。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述注射甲状腺球蛋白抗原的时间为11-15周。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述动物为哺乳动物，优选为小鼠。

10.权利要求1-9任一项方法建立的动物模型在评价预防和/或治疗卵巢储备功能低下或卵巢储备功能低下伴随自身免疫性甲状腺炎的药物的疗效和/或安全性中的用途。

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