CN1153476A - 寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了在灵长类动物中降低血压、刺激血管舒张、排除补体的方法，这些方法涉及将一种寡核苷酸施用灵长类动物，然后测定血压的降低或补体的活性的降低。所施用的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键。
Description
发明背景
本发明涉及合成寡核苷酸的体内补体灭活作用及其结果。更具体地说，本发明涉及使用合成寡核苷酸排除补体以降低血压和刺激血管舒张的方法。
补体系统是约20种不同血浆酶、酶前体、调节蛋白和下述蛋白质的级联系列，所述蛋白质能够裂解细胞并在对外源细胞的正常免疫系统反应和对个体自身细胞的异常免疫系统反应中起作用。所有这些蛋白质通常存在于血浆中和在血浆蛋白质中，沿毛细血管渗流到组织空间。酶前体通常是非活性的，但可以经两种不同的途径激活：采用补体组份C1、C4和C2的经典途径和通过因子D、C3和B的旁路。两种激活方式均引起组份C3的裂解和激活。从C3裂解的片段C3b是激活终末补体组份C5-C9所必需的。它们形成膜攻击复合物，当插入到细胞膜中时，所说复合物引起外源细胞的渗透裂解，在自体免疫状态下，引起感染生物体自身细胞的裂解。
补体级联的激活不仅引起细胞裂解，而且也引起巨嗜细胞和嗜中性白细胞对细菌的条理作用和吞噬作用、侵入生物体的凝集、某些病毒的中和、由C5a引起的嗜中性白细胞和巨嗜细胞的趋化性、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化和炎症反应(Guyton，Textbook ofMedical Physiology，W.B.Sauders Co.，Philadelphia(1991)pp.374-384)。嗜碱性粒细胞和肥大细胞活化和接下来的组胺释放由片段C3a、C4a和C5a(从C3、C4和C5酶促裂解掉)引发。在补体途径的迅速激活后，嗜中性白细胞着边、hemocentration和血管活性肽释放也有报道(Arnaout et al，(1985)N.Eng.J.Med.312：457-462)。
补体的裂解和其它活性也与大量病态有关，所述病态包括各种自体免疫紊乱，例如类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是一种慢性多系统疾病，其临床表现为，外周关节的持续炎症性滑膜炎，该炎症导致滑液细胞增生和接下来的血管翳形成、软骨损坏、骨糜烂，并且最终关节变形和丧失关节功能。约1％的美国和欧洲人，约0.2-0.4％的日本人患有这种疾病，女性患此病比男性要常见三倍。
治疗方法包括用水杨酸和其它非类固醇抗炎症药、简单的止痛药和低剂量的糖皮质激素控制发炎过程中的症状，但是这些药物都不能有效地阻止类风湿性关节炎的发展(Lipsky in Harrison′s Principles of Internal Medicine(11th ed.)(Braunwald etal.，eds.)McGraw-Hill Book Co.，New York，New York(1987)pp.142 3-1428)。大量不同的减轻疾病的药物(例如金化合物、D-青霉胺、糖皮质激素、细胞毒免疫抑药物和抗疟药)已单独和与非类固醇抗炎症药结合使用以提供止痛和抗炎作用(Lipsky，同上)。然而，使用的这些药物有些毒性，某一种不能持续地表现出优于另一种。而且，这些药物都不能表现出改变病程。因此，需要不仅能减轻类风湿性关节炎症状而且能阻止该疾病的治疗方法。
某些补体因子是潜在的血管舒张药，它们能影响血压和与血压有关的疾病，如高血压。
在许多发达国家，高血压是一个盛行的健康问题。许多患高血压的病人早逝，大多数常见的死因是心脏病、中风和肾衰竭。治疗方法一般包括非药物治疗性条理(包括消除紧张、规定饮食、减轻体重、规律的需氧锻炼)和服用抗高血压药(包括利尿药、抗类肾上腺素能剂、血管舒张药、钙通道阻断剂和血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂)(Gordon Williamsin Harrison′s Principles of Internal Medicine，13th Ed.(Isselbacher等编辑)(1994)McGraw-Hill，Inc.，NY)，1116-1131页)。
需要研究一种控制补体系统的方法，使系统组份能找到合成代谢用途，例如，用于治疗与补体敏感性自体免疫与血压相关的疾病。
各种动物模型已用于研究补体系统和由缺乏或过度表达各补体组份引起的疾病。这些动物模型已由施用眼镜蛇毒液(导致排除它们的补体)制成。然而，毒液包含不与补体系统相互作用的那些组份。因此，形成的动物反应可能不仅仅是由于存在补体相互作用组份。
因此，需要一种较好的补体缺失动物模型，其病态仅仅由与补体缺失因子的相互作用引起。
发明概述
已发现具有硫代磷酸酯(phosphorothioate)核苷酸间连接键的寡核苷酸的快速浓缩药团输注引起受治疗的灵长类动物(primate)补体缺失。已发现这一补体缺失降低受治疗的灵长类动物的血压，同时瞬时降低其中性白细胞和总白血细胞计数。这些惊人的发现已用来完成本发明，本发明包括在灵长类动物中排除补体、降低血压和刺激血管舒张的一些方法。
各方法涉及施用一种寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioate)(一种PS-寡核苷酸)，该物质具有在至少一个非桥磷酸二酯核苷酸间连接键中的硫取代氧。在本发明的某些方面，所说的寡核苷酸仅具有硫代磷酸酯核苷酸间连接键。
如本文所采用的，术语″寡核苷酸″意含两个或多个核苷酸，其中一个核苷酸的5′末端与另一个核苷酸的3′末端经共价键连接。用于本发明的方法中的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，在某些实施方案中，长度为6-50和(更优选的)20-30个核苷酸的寡核苷酸非常有用。在本发明的其它实施方案中，所说的寡核苷酸具有至少一个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在另一实施方案中所说的寡核苷酸是嵌合的，即具有在分子中任一位置或序号上的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者的组合。
在本发明的某些实施方案中，所说的寡核苷酸是修饰过的，术语″修饰的寡核苷酸″本文用来指其中至少两个其核苷酸经合成连接键共价连接，所说的合成连接键是不同于在一个核苷酸的5′末端和另一个核苷酸的3′末端之间的磷酸二酯的连接键，其中，5′磷酸酯基已由任何数量的化学基团取代。优选的合成连接键除了硫代磷酸酯外，包括象烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、2-0-甲基和羧甲基酯之类的连接键。
这些连接键可以存在于寡核苷酸结构的任何地方，并且在单个寡核苷酸中可以存在多于一种类型的连接键(即，杂种寡核苷酸)。
术语″修饰的寡核苷酸″也包括具有修饰的碱基和/或糖基的寡核苷酸。例如，3′，5′-取代的寡核苷酸是具有糖基的寡核苷酸，所说糖基在3′和5′两者上连接到化学基团而不是羟基(在其3′位)和磷酸酯基(在其5′位)上。修饰的寡核苷酸也可以是加帽的种类。此外，在分子中每个核苷酸具有一个非桥氧上取代的未氧化的或特别是氧化的寡核苷酸也被认为是修饰的寡核苷酸。也被认为是修饰的寡核苷酸的是在其3′和/或5′末端具有赋予核酸酶耐受性的大取代基的寡核苷酸，无人工干预非体内发现的结构修饰物这里也认为是修饰的。
自身稳定化的寡核苷酸也被认为是在本发明的方法中有用的寡核苷酸(Tang et al.(1993)Nucleic Acids Res.21：2729-2735)。这些寡核苷酸包括两个区：靶杂交区和自身互补区(具有互补于自身稳定化的寡核苷酸中的核酸序列的寡核苷酸序列)。
在优选的实施方案中，所说的寡核苷酸按约每千克受治疗者每小时约30-120毫克寡核苷酸(mg/kg/hr)的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。在某些方法中，所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。在某些方法中，所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。在本发明的另外的方法中需要在10分钟期限内施用约5-20mg/kg寡核苷酸。而在另外的方法中需要在120分钟期限内施用约80mg/kg寡核苷酸。
在降低血压和引起血管舒张的方法中，在施用所说的寡核苷酸后测定受治疗的灵长类动物的血压。在优选实施方案中，施用后15-35分钟测定血压。
在排除补体的方法中，在施用所说的寡核苷酸后测定取自受治疗的灵长类动物的血样中的补体活性。在优选的实施方案中，施用后10-60分钟测定补体活性。
附图简要说明
参照附图，从下面的描述可以更充分地理解本发明的上述和其它目的、其各种特征以及发明本身。
图1是从时间0开始在10分钟时间期限内静脉内施用PS-寡核苷酸后的平均动脉血压轮廓图。
图2是从时间0开始在120分钟时间期限内静脉内施用PS-寡核苷酸后的平均动脉血压轮廓图。
图3A是显示10分钟期限内施用单剂量的盐水后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3B是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物0.5毫克施用单剂量的PS-寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3C是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物1毫克施用单剂量的PS-寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3D是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物2毫克施用单剂量的PS-寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3E是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物5毫克施用单剂量的GG寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3F是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物10毫克施用单剂量的PS-寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图3G是显示10分钟期限内按每千克哺乳动物20毫克施用单剂量的PS-寡核苷酸后猴子的心率(■)和平均动脉压(◆)的图。
图4是显示10分钟期限内静脉内施用多种剂量的PS-寡核苷酸后动物中补体(CH50)活性水平的图。
图5是显示10分钟期限内静脉内施用多种剂量的PS-寡核苷酸后动物中补体(C5a)水平的图。
图6A是显示施用各种浓度的PS-寡核苷酸后人血清中补体(CH50)活性水平的图。
图6B是显示施用各种浓度的PS-寡核苷酸后动物血清中补体(CH50)活性水平的图。
优选实施方案的详细描述
下列描述意在进一步说明本发明的某些优选的实施方案，无意于限制本发明的范围。本文提及的专利和科技文献构成了本领域技术人员可获得的知识。授权的美国专利和提出的申请以及参考文献一并在此作为参考资料。
本发明提供了排除灵长类动物补体的方法，该方法在例如产生缺乏补体的动物模型中是有用的。所说动物模型在考查各种类型的免疫反应和其它反应中补体的作用上十分有价值。排除补体的方法在减缓抑制炎症中和降低各种自体免疫疾(如类风湿性关节炎)的裂解作用上也有用。本发明也提供了在灵长类动物中降低血压和引起血管舒张的方法。这些方法在治疗急性高血压(发达国家中的一种常见病)上有用。
在本发明中，通过施用一种寡核苷酸硫代磷酸酯(PS-寡核苷酸)，所述寡核苷酸具有在至少一个非桥磷酸二酯核苷酸间连接键中的硫取代氧，排除了补体，降低了血压，并诱导了血管舒张。
PS-寡核苷酸显示出对酶降解的抗性，并且在开发基于寡核苷酸的反义治疗法中已被广泛的研究(参见，例如Zamecnik，Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy ofCancer and AIDS，Wickstron，E.，Ed.，Wiley-Liss，Inc.，New York，New York，Vol.1，1991)。例如，PS-寡核苷酸已在各种体外模型系统中用作抗病毒剂(参见，例如Agrawal(1992)Trends Biotch.10：152-158)、抗癌剂(参见，例如，Ratajcqak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：11823-11827；Bayever(1993)Antisense Res.Dev.3：383)和抗寄生虫剂(参见，例如Rappaport et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：8577-8580)。此外，PS-寡核苷酸已用于调节大量细胞基因靶的表达(参见，例如Sternet a1.(1993)Science 261：1004)。
用于本发明的方法中的PS-寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或二者的组合，一个核苷酸的5′末端与另一个核苷酸的3′末端共价连接。这些寡核苷酸长度至少为6个核苷酸，但优选的长度为10-50个核苷酸，20-30聚体是最常见的。某些有用的PS-寡核苷酸在分子中具有位于相邻两个核苷酸间的一个硫代磷酸酯连接键。其它PS-寡核苷酸具有核苷酸间的分散到整个分子的或相邻的一个以上的硫代磷酸酯连接键。其它的还仅具有硫代磷酸酯连接键。
用于本发明的方法中的寡核苷酸也可以以多种方式修饰而不损害其在本发明的方法中起作用的能力。例如，除了至少一个硫代磷酸酯连接键外，寡核苷酸可以包含一个核苷酸的5′末端和另一个核苷酸3′末端之间的核苷酸间连接键而不是硫代磷酸酯核苷酸间连接键。在这种连接键中，5′核苷酸硫(在硫代磷酸酯的情况下)由任何数量的化学基团取代。这种化学基团的例子包括烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯、碳酸酯和磷酸三酯。
其它修饰包括在寡核苷酸分子内部的或在其末端的那些修饰，并包括核苷酸间磷酸酯连接键添加到分子中，例如在氨基和末端核糖、脱氧核糖间具有不同数量碳残基的胆甾型化合物或二胺化合物，和裂解或交联到相对的链或相关的酶或其它蛋白质的磷酸酯修饰物。这种修饰的寡核苷酸的例子包括具有修饰的碱基和/或糖基的寡核苷酸，例如，阿拉伯糖替代核糖的寡核苷酸或具有糖基的3′，5′-取代的寡核苷酸，所说的糖基在3′和5′两者上连接到不是羟基(在其3′位)和磷酸酯基(在其5′位)的化学基团上。其它修饰的寡核苷酸是在其3′和/或5′末端用赋予核酸酶耐受性的大取代基加帽的，和每个核苷酸具有一个非桥氧上的取代基。这种修饰可以在某些或全部核苷酸间连接键上，以及在寡核苷酸的一个或两个末端上和/或在分子内部。
其它有用的寡核苷酸包括自身稳定化的那些，如Tang等(Nucleic Acids Res.(1993)21：2729-27 35)所述的。这些寡核苷酸具有靶杂交区和自身互补区(该区具有互补于自身稳定化的寡核苷酸内的核酸序列的寡核苷酸序列)。
这些未修饰的和修饰的寡核苷酸的制备方法是本领域熟知的(综述见Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10：152-158)。例如，可以用文献记载过的技术共价连接核苷酸，所述的技术如氨基磷酸酯化学法、H-膦酸酯化学法或甲基氨基磷酸酯化学法(参见，例如，Uhlmann et al.(1990)Chem.Rev.90：543-584；Agrawal et al.(1987)Tetrahedron.Let t.28：(31)：3539-3542)；Caruthers et al.(1987)Meth.Enzymol.154：287-313；美国专利5,149,798)。可以用本领域熟知的方法制备寡聚硫代磷酸酯类似物，所述的方法例如甲氧基亚磷酰胺化学法(参见，例如Agrawal et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7079-708 3)或H-膦酸酯化学法(参见，例如Froehler(1986)Tetrahedron lett.27：5575-5578)。也可以使用Bergot等(J.Chromatog.(1992)559：35-42)描述的合成方法。
在这一研究中有用的寡核苷酸的例子包括以下表1所列出的和序列表SEQ ID NO：1-6所示的那些。
表1寡核苷酸 序列 SEQ ID NO：GG(25聚体) CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 120聚体 CTCTCGCACCCATCTCTCTC 220聚体 CUCUCGCACCCAUCUCUCUC 327聚体 ATCGAATATTTCAGAGATATCTTCCAT 427聚体 AUCGAATATTTCAGAGATA2CTUCCAT 533聚体 CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGAG 6
然而，其它有用的寡核苷酸可以具有任何核苷酸序列，只要由施用这些寡核苷酸产生的效果不是序列特异性的。
″GG″寡核苷酸(SEQ ID NO：1)互补于HIV-1起始密码子(Agrawal and Tang(1992)Antisense Res.Dev.2：261)。其它5种寡核苷酸是长度为20-33个核苷酸的硫代磷酸酯。试验的25聚体是42425聚体随机序列(25聚体随机)的混合物。所述的25聚体是在合成期间用A、C、G和T的混合物进行各步连接合成的。
在本发明的方法中所述的寡核苷酸经静脉内注射施用到受治疗者，注射的是包含至少一种以上所述的PS-寡核苷酸和药学上可接受的载体的治疗配方形式。
如本文所使用的，″药学上可接受的载体″包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。这些介质和药剂对药学活性物质的作用是本领域公知的。只要任何常规介质或药剂不是与活性成分不相容的，预期就可以用于治疗组合物中。辅助性活性组份也可以掺合进组合物中。
适于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。各种形式都必须是无菌的，在制造和贮藏条件下必须稳定，并且可以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质。可以由各种抗细菌和抗真菌剂产生对微生物的抵抗作用。可以经采用药剂延缓吸收组合物产生注射治疗剂的延长吸收。
将治疗配方以一种浓缩药团进行静脉内注射，需要时可以以各种时间间隔重复施用。注射的剂量取决于待施用的寡核苷酸的量，每小时接受者每千克体重30-120毫克在可接受的范围内。例如，在10分钟期间施用5-20mg/kg，在120分钟期间施用80mg/kg浓缩药团导致血压降低、血管舒张和补体排除。
在本发明的某些方法中，在用所述的寡核苷酸处理后，测定灵长类动物的血压并确定血压的降低。这可以由测定血压的任何已知方法完成。例如，可以通过将导管置于股动脉或者通过用血压表体外监测来测定血压。血压最大的降低见于对灵长类动物施用所说寡核苷酸后15-35分钟，这一时间内进行这种测定最好。
在本发明的其它方法中，在用所述的寡核苷酸处理后，测定灵长类动物血或血清中补体活性确定补体活性的降低。这可以由测定补体组份活性的任何已知方法完成。例如，可以如Kabat等(Expt.Immunochem.(1961)Charles C.Thomas，New York)所述用绵羊红血细胞的补体依赖性裂解测定补体CH50，经放射免疫测定法测定C5a。最多的补体排除见于对灵长类动物施用所说寡核苷酸后10-60分钟，这一时间内进行这种测定最好。
已发现小鼠和大鼠对PS寡核苷酸具有良好的耐受性(Agrawal，Prospects forAntisense Nucleic Acid for Cancer and AIDS，W.Liss，New York，(1993)P.143)，而在猴子中在某些情况下观察到血液动力学毒性。最近有将PS寡核苷酸浓缩药团直接施用到主动脉后Rhesus猴发生高血压并死亡的报道(Cornish(1993)Pharm.Comm.3：239-247)。本发明说明向灵长类动物施用不同长度的PS-寡核苷酸的效果。
在一个研究中，当在10分钟期限内以剂量0(盐水)或1.25mg/kg向灵长类动物施用GG-寡核苷酸(SEQ ID NO：1)时，对平均动脉血压(图1)或心率没有可检测的作用。另一方面，10分钟输注5mg/kg，到输注末期产生平均血压的短暂增加(图1)，接着是更长的压力降低。在10分钟期限内输注20mg/kg剂量，产生类似的短暂的血压增加，接着是更显著的和更长的血压过低。
与在10分钟期间内用这些剂量的寡核苷酸输注所观察到的作用不同，在120分钟内输注5或20mg/kg都不能以任何临床上有意义的方式影响血压(图2)。仅在120分钟内输注80mg/kg时观察到对血压的影响。观察到轻微的血压短暂增加接着是血压降低，具有与在10分钟期限内输注5mk/kg所观察到的类似的变化。
一般来说，心率的变化相应于血压上观察到的变化。对说明血压改变的动物的心电图的仔细地一个一个跳动的分析没有显示出指示所说寡核苷酸的直接的心脏作用的明显的心电描记改变。而且，对亡猴的心脏组织的肉眼和显微学观察没有给出心脏毒性的任何证据。
10分钟的较短期限输注施用0.5、1和2mg/kg寡核苷酸无临床上对血压或心率的明显的作用(图3A-3C)。相反，输注5、10和20mk/kg时，观察到血压增加，接着血压更长和更多的降低(图3D-3F)。血压的改变伴随着相应的心率的改变。
在2mg/kg或更低GG剂量时，血液学参数在整个输注期间和其后保持相对恒定(表2A-2C)。
表2A
从开始输注的时间(分钟)时间 -10 2 5 10 20 40 60 24小时盐水对照
(10分钟输注)血小板计数 489.0 475.0 444.0 484.0 452.0 432.0 442.0 389.0(Thsd/mm3)血细胞比容(％) 34.2 34.5 35.6 33.2 33.4 33.7 32.7 34.7WBC(Thsd/mm3) 8.4 7.9 8.0 7.6 7.8 8.0 8.7 16.1嗜中性白细胞(％) 57.0 51.0 49.0 56.0 51.0 57.0 63.0 730剂量0.5mg/kg
(10分钟输注)血小板计数 382.0 382.0 382.0 373.0 371.0 363.0 332.0 407.0(Thsd/mm3)血细胞比容(％) 34.3 34.7 34.3 33.6 33.5 34.1 33.4 34.8WBC(Thsd/mm3) 7.0 6.9 6.5 6.5 6.4 7.5 6.9 8.8嗜中性白细胞(％) 53.0 50.0 52.0 51.0 49.0 49.0 50.0 38.0剂量1mg/kg
(10分钟输注)血小板计数 419.0 444.0 425.0 395.0 433.0 432.0 438.0 393.0(Thsd/mm3)
表2B
输注后的时间(分钟)试验 -10 2 5 10 20 40 60 24小时
血细胞比容(％) 38.5 35.3 35.7 36.9 36.9 37.0 35.8 37.7WBC(Thsd/mm3) 8.2 8.2 8.0 8.0 7.9 8.4 9.2 10.9嗜中性白细胞(％) 40.0 41.0 40.0 36.0 36.0 34.0 33.0 33.0剂量2mg/kg
(10分钟输注)血小板计数 379.0 365.0 377.0 364.0 339.0 322.0 243.0 263.0(Thsd/mm3)
血细胞比容(％) 40.2 41.4 40.6 40.5 38.9 38.1 37.9 43.0WBC(Thsd/mm3) 7.7 8.6 8.0 7.8 7.7 7.9 7.9 9.3嗜中性白细胞(％) 31.0 29.0 29.0 30.0 30.0 35.0 28.0 42.0剂量5mg/kg
(10分钟输注)血小板计数 445.0 429.0 363.0 242.0 338.0 32 9.0 326.0 440.0(Thsd/mm3)血细胞比容(％) 43.1 42.1 42.4 41.8 46.0 47.6 47.7 40.8WBC(Thsd/mm3) 5.8 5.8 6.1 2.1 2.0 9.6 16.0 13.7嗜中性白细胞(％) 63.0 61.0 40.0 3.0 8.0 65.0 74.0 79.0
表2C
开始输注后的时间(分钟)
-10 2 5 10 20 40 60 24试验 小时剂量10mg/kg
(10分钟输注)血小板计数 391.0 397.0 267.0 192.0 226.0 270.0 282.0 353.0(Thsd/mm3)血细胞比容(％)39.6 39.0 37.7 36.4 38.6 43.2 40.4 33.1WBC(Thsd/mm3) 10.1 10.0 9.7 3.7 2.5 11.9 16.3 8.7嗜中性白细胞 40.0 34.0 38.0 3.0 6.0 51.0 47.0 76.0剂量20mg/kg(10分钟输注)血小板计数 346.0 33.0 165.0 179.0 175.0 225.0 245.0 331.0(Thsd/mm3)血细胞比容(％) 40.5 39.0 39.4 37.6 46.0 48.1 47.8 41.2WBC(Thsd/mm3) 10.8 10.0 8.4 4.0 5.0 26.0 33.7 28.7嗜中性白细胞 37.0 40.0 34.0 2.0 2.0 46.0 51.0 88.0
单独的变化涉及血细胞比容轻微的逐渐的降低，可归因于频繁的制备血样。在5mg/kg或更大剂量时，观察到血液学值的大量一致的改变。例如，在输注结束前总白血细胞(WBCs)明显开始增加，到40分钟时反跳到基线上的值。嗜中性白细胞计数表现出伴随性明显降低至几乎为0，此后反跳性增加，而血小板计数几乎没有改变。
在大多数动物中，到40-60分钟基线上的血细胞比容的增加也明显。在大于或等于10mg/kg剂量时，血清补体CH50浓度(总补体活性的一般量度)降低，在处理开始5分钟内开始(图4)。图4中，用药前10分钟和用药后2、5、10、20、40、60分钟和25小时取血样，分析CH50补体水平。补体的C5a裂解产物明显减少，在大于或等于5mg/kg时从输注的2分钟内开始；在较高剂量时，较早出现增加的C5a(图5)。在低于或等于2mg/kg时观察不到变化。
当用PS-寡核苷酸处理人和猴血清，然后测定补体活性时观察到类似的结果(图6A和6B)。而且，人血清(图6A)以与猴血清(图6B)相同的方式作出反应，说明，灵长类动物中的补体系统类似，并且以类似的方式对PS-寡核苷酸的施用作出反应。
总之，由静脉内寡核苷酸诱导的血压过低是明显剂量和输注速率依赖性的。因此，通过降低寡核苷酸输注速率可以使剂量反应曲线明显右移。在10分钟内的80mg/kg(或30mg/kg/hr)剂量产生与10分钟内的5mg/kg(或30mg/kg/hr)剂量类似的反应。寡核苷酸在血液动力学上的作用表现出受外周血管影响，因为没有直接作用在心脏的证据。
血压的变化伴随或跟随着补体失活，总补体活性降低，C5a裂解产物出现。此外，外周总WBC和嗜中性白细胞计数以及血浓度降低，遵循补体快速失活途径的这种情况已有描述(Arnaout et al.(1985)N.Engl.J.Med.312：457)。因此，对补体激活和内源性作用于血管的物质的释放的作用产生静脉内施用寡核苷酸所观察到的血液动力学的变化。
这些血液动力学作用并不限于施用具有特定大小的核苷酸序列的寡核苷酸，10分钟输注其它PS-寡核苷酸(20-聚体(SEQ ID NO.2)、27-聚体(SEQ ID NO.4)、33-聚体(SEQ IDNO.5)和25-聚体随机序列)后已获得血压的类似的降低。
下列实施例说明实施本发明的优选的方式，但无意于限制本发明的范围，因为可以用替换的方法获得类似的结果。
实施例
1.寡核苷酸合成
经自动装配合成法(Padmapriya et al.(1994)Antisense Res.&Dev.(in press))用9-氰乙基亚磷酰胺化学合成1mmol GG和其它寡核苷酸。经反向液相色谱，接着脱三苯甲基和沉淀进行粗寡核苷酸的纯化。将沉淀的寡核苷酸再悬浮于水中，使其通过装在5cmID×30cm柱中的Dowes-5 OTM(Na+形式：Dowex-50×2-200离子交换树脂(Aldrich，Milwaukee，WI))，最后用SephadexTM G-15(Sigma Chemical Co.，St.Loui s，MO)脱盐。将纯化的GG(Na@形式)通过0.02μ无菌滤器并冻干。全长PS-寡核苷酸的百分比大于或等于87(被毛细管凝胶电泳和离子交换HPLC证实)，并且此外是99％DNA(基于A260/质量比)。31P NMR分析证实产物中硫代磷酸酯大于99％。制备具有SEQ ID NO：1、3、5、和6所示序列的寡核苷酸以及424序列(2 5-聚体随机)的25-聚体混合物。通过在合成期间各步连接中用A、C、G和T的混合物合成25-聚体随机(Lisziewiect et al.(1993 Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：3860)。
2.体内研究
A.动物
研究前，使46只Rhesus猴(Macaca mulatta)(26只雄性，20只雌性)适应实验室环境至少7天。在研究时，研究A中体重范围为2.20-3.76kg，研究B中为4.06-8.88kg。
B.心血管监测
在研究的当天，给动物服用少量的镇静剂氯胺酮HCl(10mg/kg)和安定(0.5mg/kg)。诱导出外科水平的麻醉，并通过在整个心血管记录过程中连续的氯胺酮滴加保持。将一导管置于大腿动脉，记录中心动脉(血)压力，并将动物装备上仪器进行连续心电图记录。
C.施用PS-寡核苷酸
将GG(SEQ ID NO：1)或其它PS-寡核苷酸溶解进普通盐水中，用可控输注泵经头部血管导管静脉内输注。在所有情况下，FF的浓度是使其以0.42ml/min的速率被输送的浓度。
在研究A中，在10分钟输注期限内对4只猴各施用0(仅盐水)、1.25、5和20mg/kg剂量的GG，在120分钟期限内对4只猴各施用0、5、20和80mg/kg剂量的GG。
在研究B中，在10分钟输注期限内对2只动物各施用0、0.5、1、2、5、10和20mg/kg剂量的GG。
收集输注前10分钟和开始10分钟输注后2、5、10、20、40和60分钟以及24(+/-4)小时后的动脉血样。由Sierra Nevada Laboratories(Reno，Nevada)测定血液学值。血清用于产生补体CH50和C5a。如Kabat等(Expt.Immunochem.(1961)Charles C.Thomas，New York)所述用绵羊红血细胞的补体依赖性裂解测定补体CH50，经放射免疫测定法测定C5a(Amersham PLC，U.K.)。
3.体外研究
在37℃下，将50ml人和猴血清与等体积的盐水或包含1tig/ml，10pg/ml，100pg/ml，1mg/ml或10mg/ml PS-寡核苷酸的盐水一起温育。如Kabat等(Expt.Immunochem.(1961)Charles C.Thomas，New York)所述用绵羊红血细胞的补体依赖性裂解测定补体(CH50)活性。结果示于图6A和6B。
等价物
只需常规实验本领域技术人员便可以识别或者可以确定本文所述的特定物质和方法的等价物。这些等价物被认为在本发明的范围内，并且由所附权利要求覆盖。 序列表(1)一般信息：(i)申请人：韦恩·M·加尔布雷斯，苏迪尔·阿格雷瓦尔(ii)发明名称：排除补体的方法(iii)序列数：6(iv)通讯地址：(A)收信人：Lappin&Kusmer(B)街道：200 State Street(C)城市：波士顿(D)州：马萨诸塞州(E)国家：美国(F)邮区码：02109(v)计算机可读形式：(A)媒介类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.25(vi)本申请数据：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类：(viii)律师/代理人信息(A)姓名：Kerner，Ann-Louise(B)注册号：33，523(C)案号/文档号：HYZ-021PCT(ix)电讯信息：(A)电话：617-330-1 300(B)传真：617-330-1311(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：2CTCTCGCACC CATCTCTCTC 20(2)SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：RNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：3CUCUCGCACC CAUCUCUCUC 20(2)SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：4ATCGAATATT TCAGAGATAT CTTCCAT 27(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA/RNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：5AUCGAATATT TCAGAGATAT CTUCCAT 27(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征：(A)长度：33个碱基对(B)类型：核酸 (C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：6CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTGGAGA GAG 33
Claims (39)
1、一种降低灵长类动物血压的方法，该方法包括：
(a)将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和
(b)测定灵长类动物血压的降低。
2、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸按约30-120mg/kg/hr的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。
3、权利要求2的方法，其中所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。
4、权利要求2的方法，其中所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。
5、权利要求1的方法，其中在10分钟期限内按每千克灵长类动物5-20毫克寡核苷酸施用。
6、权利要求1的方法，其中在120分钟期限内按每千克灵长类动物80毫克寡核苷酸施用。
7、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为6-50个核苷酸。
8、权利要求7的方法，其中所说的寡核苷酸长度为20-33个核苷酸。
9、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。
10、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
11、权利要求9的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
12、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸是修饰过的。
13、权利要求1的方法，其中至少50％的降低被测得。
14、一种刺激灵长类动物血管舒张的方法，该方法包括：
(a)将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和
(b)测定灵长类动物中至少50％的血压降低。
15、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸按约30-120mg/kg/hr的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。
16、权利要求15的方法，其中所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。
17、权利要求15的方法，其中所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。
18、权利要求14的方法，其中在10分钟期限内按每千克灵长类动物5-20毫克寡核苷酸施用。
19、权利要求14的方法，其中在120分钟期限内按每千克灵长类动物80毫克寡核苷酸施用。
20、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为6-50个核苷酸。
21、权利要求20的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为20-33个核苷酸。
22、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。
23、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
24、权利要求22的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
25、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸是修饰过的。
26、权利要求1的方法，其中至少50％的降低被测定。
27、一种排除灵长类动物补体的方法，该方法包括：
(a)将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和
(b)测定血样中补体活性的降低。
28、权利要求27的方法，其中所说的寡核苷酸按约30-120mg/kg/hr的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。
29、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。
30、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。
31、权利要求28的方法，其中在10分钟期限内按每千克灵长类动物5-20毫克寡核苷酸施用。
32、权利要求28的方法，其中在120分钟期限内按每千克灵长类动物80毫克寡核苷酸施用。
33、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为6-50个核苷酸。
34、权利要求33的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为20-33个核苷酸。
35、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。
36、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
37、权利要求35的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。
38、权利要求28的方法，其中所说的寡核苷酸是修饰过的。
39、权利要求28的方法，其中至少50％的降低被测定。
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|---|---|---|---|
| CN 95194229 CN1153476A (zh) | 1994-05-27 | 1995-05-19 | 寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用 |
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|---|---|---|---|
| US08/250,853 | 1994-05-27 | ||
| CN 95194229 CN1153476A (zh) | 1994-05-27 | 1995-05-19 | 寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1153476A true CN1153476A (zh) | 1997-07-02 |
Family
ID=5082630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 95194229 Pending CN1153476A (zh) | 1994-05-27 | 1995-05-19 | 寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1153476A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1309361C (zh) * | 2001-02-28 | 2007-04-11 | 荷兰联合利华有限公司 | 制备具有适度增湿作用的包含大油滴的液体的方法 |
-
1995
- 1995-05-19 CN CN 95194229 patent/CN1153476A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1309361C (zh) * | 2001-02-28 | 2007-04-11 | 荷兰联合利华有限公司 | 制备具有适度增湿作用的包含大油滴的液体的方法 |
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