CN115341020A - 一种利用lamp技术的急性心梗和心衰外显子测序方法 - Google Patents

一种利用lamp技术的急性心梗和心衰外显子测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，涉及外显子测序技术领域。该利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，包括以下操作步骤：首先获取目的基因，然后针对对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物，靶DNA变性后，内外引物在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，之后进入循环扩增阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。本发明中LAMP技术对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，仅要求引物设计正确，并且完善各种反应条件，特别适合在基层医疗机构中应用。

Description

一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法
技术领域
本发明涉及外显子测序技术领域，具体为一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法。
背景技术
在我国心血管疾病是人民群众生命和健康的“第一杀手”，全国患心血管疾病的人群约有3.3亿人口，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺源性心脏病500万，心力衰竭890万，这些急症如急性心肌梗死如果能早期识别，及时给予治疗，就可能改善预后。心血管疾病的一个关键要素就是快速诊断，早期发现疾病。目前做心血管疾病早期诊断的主要方法有检测心血管疾病相关的标记标志物，比如说肌红蛋白，肌钙蛋白，乳酸脱氢酶等等，这些蛋白的检测是以免疫荧光或者以来撒方法来检测的，需要的时间比较长在最快也要半个小时。
心梗三项”是目前公认的心肌损伤标志物，对于诊断心肌梗死、评价溶栓治疗的效果、评价再梗死或梗死范围以及危险程度都具有重要的意义。目前的技术方法对急性心肌梗死疾病的检测时间较长，通常需要2小时左右，不仅会延误不少病情，而且会错过早期诊断的时机而错失最佳治疗的窗口。
发明内容
解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，解决了目前的技术方法对急性心肌梗死疾病的检测时间较长，通常需要2小时左右，不仅会延误不少病情，而且会错过早期诊断的时机而错失最佳治疗的窗口的问题。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，包括以下操作步骤：
S1：获取目的基因：选择心血管疾病患者和身体健康的对照组人群，采用试剂盒及标准DNA提取方法提取目标基因；
S2：设计引物：针对对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物；
S3：哑铃状模板合成:靶DNA变性后，内外引物在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA；
S4：循环扩增:进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物；
S5：上机测序：用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S1)中获取目的基因时采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，具体血液要求为心血管疾病患者和身体健康的对照组人群的主动脉血液DNA，其中心血管疾病患者包括脑卒中患者、冠心病患者、肺源性心脏病患者、心力衰竭患者。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S3)中进行哑铃状模板合成前，吸取100ul血样加入15ul蛋白K溶液混匀；加入100ul缓冲液GB，充分震荡15s，55-65℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠，再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，获得变性后的靶DNA。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S3)中靶序列长度在300bp以内。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S4)中扩增结束后，利用浊度仪检测沉淀浊度，判断扩增效果是否达到检测标准。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S5)中采用lumina测序仪进行测序操作。
本发明还提供一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序后的判断方法，包括以下步骤：
S1：数据分析：对单核苷酸多态性数据库、千人基因数据库进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性、对比率分析；
S2：筛选：将所得数据与数据库进行比对，鉴定出2p24.1、4q32.1、6p21.32和12q21.33共4个染色体区域，其遗传变异可显著影响冠心病、心肌梗死的发病风险；
S3：结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，筛选出了潜在的分子诊断基因标记物，同时证实了6p24.1、6q23.2、9p21.3和12q24.13共4个区域与冠心病、心肌梗死患者发病风险相关。
有益效果
本发明具有以下有益效果：本发明中LAMP技术对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，仅要求引物设计正确，并且完善各种反应条件，特别适合在基层医疗机构中应用，其具有如下几个方面的优点：(1)LAMP有较高的特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；(2)LAMP的反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段依然不敏感；(3)LAMP的敏感性较高，扩增快速、高效；(4)LAMP结果的鉴别很简便，用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明LAMP技术原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，包括以下操作步骤：
S1：获取目的基因：选择心血管疾病患者和身体健康的对照组人群，采用试剂盒及标准DNA提取方法提取目标基因；
S2：设计引物：针对对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物；
S3：哑铃状模板合成:靶DNA变性后，内外引物在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA；
S4：循环扩增:进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物；
S5：上机测序：用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S1)中获取目的基因时采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，具体血液要求为心血管疾病患者和身体健康的对照组人群的主动脉血液DNA，其中心血管疾病患者包括脑卒中患者、冠心病患者、肺源性心脏病患者、心力衰竭患者。
进一步的，所述S3)中进行哑铃状模板合成前，吸取100ul血样加入15ul蛋白K溶液混匀；加入100ul缓冲液GB，充分震荡15s，55-65℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠，再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，获得变性后的靶DNA。
进一步的，所述S3)中靶序列长度在300bp以内。
进一步的，所述S4)中扩增结束后，利用浊度仪检测沉淀浊度，判断扩增效果是否达到检测标准。
进一步的，所述S5)中采用lumina测序仪进行测序操作。
本发明还提供一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序后的判断方法，包括以下步骤：
S1：数据分析：对单核苷酸多态性数据库、千人基因数据库进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性、对比率分析；
S2：筛选：将所得数据与数据库进行比对，鉴定出2p24.1、4q32.1、6p21.32和12q21.33共4个染色体区域，其遗传变异可显著影响冠心病、心肌梗死的发病风险；
S3：结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，筛选出了潜在的分子诊断基因标记物，同时证实了6p24.1、6q23.2、9p21.3和12q24.13共4个区域与冠心病、心肌梗死患者发病风险相关
使用时(工作时)，选择心血管疾病患者和身体健康的对照组人群，QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，具体血液要求为心血管疾病患者和身体健康的对照组人群的主动脉血液DNA；
针对对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物；
吸取100ul血样加入15ul蛋白K溶液混匀；加入100ul缓冲液GB，充分震荡15s，55-65℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠，再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，获得变性后的靶DNA，靶DNA变性后，靶序列长度在300bp以内，内外引物在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA；
进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，利用浊度仪检测沉淀浊度，判断扩增效果是否达到检测标准；
采用lumina测序仪进行测序操作，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1：获取目的基因：选择心血管疾病患者和身体健康的对照组人群，采用试剂盒及标准DNA提取方法提取目标基因；
S2：设计引物：针对对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，包括2条内引物和2条外引物；
S3：哑铃状模板合成:靶DNA变性后，内外引物在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA；
S4：循环扩增:进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物；
S5：上机测序：用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
2.根据权利要求1所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：所述S1)中获取目的基因时采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，具体血液要求为心血管疾病患者和身体健康的对照组人群的主动脉血液DNA，其中心血管疾病患者包括脑卒中患者、冠心病患者、肺源性心脏病患者、心力衰竭患者。
3.根据权利要求1所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：所述S3)中进行哑铃状模板合成前，吸取100ul血样加入15ul蛋白K溶液混匀；加入100ul缓冲液GB，充分震荡15s，55-65℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠，再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，获得变性后的靶DNA。
4.根据权利要求1所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：所述S3)中靶序列长度在300bp以内。
5.根据权利要求1所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：所述S4)中扩增结束后，利用浊度仪检测沉淀浊度，判断扩增效果是否达到检测标准。
6.根据权利要求1所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序方法，其特征在于：所述S5)中采用lumina测序仪进行测序操作。
7.根据权利要求1-6所述的一种利用LAMP技术的急性心梗和心衰外显子测序后的判断方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：数据分析：对单核苷酸多态性数据库、千人基因数据库进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性、对比率分析；
S2：筛选：将所得数据与数据库进行比对，鉴定出2p24.1、4q32.1、6p21.32和12q21.33共4个染色体区域，其遗传变异可显著影响冠心病、心肌梗死的发病风险；
S3：结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，筛选出了潜在的分子诊断基因标记物，同时证实了6p24.1、6q23.2、9p21.3和12q24.13共4个区域与冠心病、心肌梗死患者发病风险相关。
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