CN115340605A - 一种抗pd-l1单域抗体及其衍生蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种抗人PD‑L1抗体及其应用。以人PD‑L1重组蛋白作为免疫原，分离PBMC构建单域抗体重链可变区噬菌体表面展示抗体库，以人PD‑L1重组蛋白进行固相筛选获得可结合人PD‑L1重组蛋白的噬菌体展示驼源单域抗体VHH‑B6。制备人‑驼嵌合抗体chB6，并对其进行人源化改造获得hzB6。在hzB6的基础上进行亲和力成熟，获得了27株人源化单域抗体的变体，筛选获得对人PD‑L1亲和力高、对人PD‑L1与其受体PD‑1结合阻断活性强、体内半衰期长、动物模型中肿瘤治疗效果好的人源化单域抗体变体。

Description

一种抗PD-L1单域抗体及其衍生蛋白
优先权信息
本申请请求2021年05月14日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202110529312.1的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及靶向人程序性死亡配体1(PD-L1)的单域抗体、其衍生蛋白及其用于制备药物的用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断PD-L1相关疾病例如肿瘤中的用途。
背景技术
PD-1及其配体PD-L1是肿瘤免疫的重要靶点。PD-1、PD-L1是一对免疫抑制分子，是免疫系统防止自身免疫过激的重要组成部分，其通路的激活具有抑制肿瘤免疫应答、诱导肿瘤特异性T细胞凋亡的作用,与肿瘤发展关系密切。
PD-L1全称是程序性死亡配体-1，可以结合T细胞表面的受体PD-1，发挥免疫抑制作用。PD-L1属于抑制型免疫检查点分子，表达于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤细胞表面。PD-L1与T细胞表面的免疫抑制性受体PD-1结合后，可诱导T细胞凋亡、失能、耗竭，进而抑制肿瘤抗原特异性T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能，实现肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1阻断型抗体可以解除PD-L1的免疫抑制作用，增强体内免疫细胞T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，从而达到杀灭肿瘤的作用。目前，全球范围内已上市多个靶向PD-1/PD-L1的抗体类药物，在临床上对黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌和尿路上皮癌等多种肿瘤显示出不错的治疗效果。目前PD-1/PD-L1治疗性抗体虽然取得了一定的临床效果，但临床上使用有效率偏低，对于绝大多数癌种来说，如果不加选择地单独使用，有效率平均只有10％-20％。因此需要开发更加有效的抗体类药物分子以满足临床需求。
目前对于PD-L1抗体的研发，主要研究方向包括，(1)进一步开发亲和力更高，活性更好的抗体分子；(2)基于该靶点的双特异抗体或类似物；(3)初步研究表明PD-L1阳性肿瘤患者对PD-L1抑制剂的应答率远高于PD-L1阴性肿瘤患者，因此需要有效的生物标志物来预测PD-L1阳性肿瘤患者或提前筛选患者，以降低治疗费用和可能的严重不良反应；(4)为了提高应答率，联合用药成为肿瘤免疫治疗的发展趋势，如与其他肿瘤免疫药物的联用，与靶向药物、化疗或放疗的联用。(5)抗PD-L1纳米抗体。其分子量是普通抗体的1/10，单域抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、靶向性强、人源化简单等，尤其是适合进行双/多特异治疗性抗体的开发和Car-T/M/NK等疗法的开发。
单域抗体(single domain antibody，sdAb)是一类特殊的，只包含一条抗体重链的抗体。和传统双链抗体类似，它可以选择性的与特定抗原结合。单域抗体最早在骆驼科动物中被发现，之后在护士鲨等软骨鱼纲动物中也被发现。单域抗体单个重链抗体可变区(VHH)是能完整结合抗原的单个功能域，只有12-15kDa。VHH结构简单，在与抗原结合时具有高特异性、高亲和力、免疫原性低、渗透性好以及在进行肿瘤治疗时具有接触到不能被常规抗体接触的较为隐蔽靶点的能力等优点。此外，因为单域抗体只有一条链，所以不会产生双链抗体融合时的错配问题。基于这些优点，利用单域抗体作为双特异性抗体的抗原结合序列具有很大的优势，逐渐成为研发热点(Serge Muyldermans(2013)，Annu.Rev.Biochem.82:775-797)。单可变域抗体是目前最小的抗体分子，也称为纳米抗体，最初由比利时科学家Hamers，R在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。单可变域抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、靶向性强、人源化简单等，尤其是适合进行双/多特异治疗性抗体的开发和Car-T/M/NK等疗法的开发。目前单可变域抗体和/或基于单可变域抗体的双/多特异性抗体开发已成为研发热点。
目前抗PD-L1抗体以完整的全抗体为主，纳米抗体的抗PD-L1纳米抗体目前仅有一个作为孤儿药资格获批的Envafolimab(KN035)。Envafolimab(KN035)是由康宁杰瑞开发的重组人源化PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，也是全球首个进入临床的PD-L1单域抗体(单域抗体)。KN035在安全性、便利性、依从性等方面和已上市的同类药物相比，具有显著的差异化优势，可切实改善病人生活品质。目前在中国、美国和日本针对多个肿瘤适应症同步开展临床试验，并在2020年1月18日被美国食品和药物管理局(FDA)授予KN035(Envafolimab)晚期胆道癌的孤儿药资格(Orphan Drug Designation，ODD)。尽管PD-L1抑制剂在临床上被成功用于多种肿瘤的治疗，但整体的临床响应率、疗效和使用量等方面仍有待提高。
发明内容
本公开提供一种靶向人程序性死亡配体1(PD-L1)的单域抗体及其衍生蛋白。以人PD-L1重组蛋白作为免疫原，分离PBMC构建单域抗体重链可变区噬菌体表面展示抗体库，以人PD-L1重组蛋白进行固相筛选获得可结合人PD-L1重组蛋白的噬菌体展示驼源单域抗体VHH-B6。制备人-驼嵌合抗体chB6，并对其进行人源化改造获得hzB6。在hzB6的基础上进行亲和力成熟，获得了27株人源化单域抗体的变体，在此基础上进一步筛选获得对人PD-L1亲和力高、对人PD-L1与其受体PD-1结合阻断活性强、体内半衰期长、动物模型中肿瘤治疗效果好的人源化单域抗体变体。在细胞实验和动物模型上证实，人源化抗人PD-L1单域抗体能够有效阻断PD-L1/PD-1信号通路，能够以剂量依赖的方式抑制PD-L1/PD-1相关肿瘤的生长，具有良好的应用前景。
具体而言：
第一方面，本发明提供了一种抗人PD-L1抗体。根据本发明的实施例，所述抗人PD-L1抗体包括至少一个单域抗体，所述单域抗体中的
CDR1具有EYIGDRYCAG(SEQ ID NO:33)或GFTFDRYCAG(SEQ ID NO:34)所示的氨基酸序列；
CDR2具有MIDRHGIVRYKDSVEG(SEQ ID NO:35)所示的氨基酸序列，CDR3具有X1X2X3X4TX5X6X7PCRX8X9YPDMDY，
其中
X1选自E、D，
X2选自R、E，
X3选自D、S，
X4选自P、R、S，
X5选自N、S、A、Q、D、T，
X6选自V、P，
X7选自T、I、L、A、Y、Q，
X8选自P、A，
X9选自E、T、S。
进一步，根据本发明的实施例，所述单域抗体为驼源单域抗体、嵌合单域抗体或人源化单域抗体。
进一步，根据本发明的实施例，所述抗人PD-L1单域抗体包括选自SEQ ID NO:1、4和6-32组成的任一氨基酸序列。
进一步，根据本发明的实施例所述抗人PD-L1抗体为同源多聚体或异源多聚体，且包括至少一个所述单域抗体。
进一步，根据本发明的实施例，所述多聚体为二聚体、三聚体和四聚体。
进一步，根据本发明的实施例，所述多聚体至少包括两个所述单域单体，并且所述至少包括两个所述单域单体的人PD-L1结合域相互作用使所述多聚体能够特异性结合人PD-L1。第二方面，本发明提供一种结合分子。根据本发明的实施例，该结合分子包括一个或多个人PD-L1结合域，所述人PD-L1结合域包括：
CDR1：EYIGDRYCAG(SEQ ID NO:33)或GFTFDRYCAG(SEQ ID NO:34)；
CDR2：MIDRHGIVRYKDSVEG(SEQ ID NO:35)；
CDR3：ERDPTNVTPCRPEYPDMDY(SEQ ID NO:36)，或在ERDPTNVTPCRPEYPDMDY的基础上进行一个或两个氨基酸的替换获得的多肽。
进一步，根据本发明的实施例，所述CDR3具有SEQ ID NO:36-56中任一所述氨基酸序列。
进一步，根据本发明的实施例，所述一个或多个人PD-L1结合域包括选自由SEQ IDNO:1、4、6-32组成的组中的任一氨基酸序列。
进一步，根据本发明的实施例，该结合分子还包括一个或多个非PD-L1结合功能组件，所述人PD-L1结合域与非PD-L1结合功能组件之间通过共价连接或非共价连接。
进一步，根据本发明的实施例，所述非PD-L1结合功能组件包括载体蛋白、活性肽、标签肽和伴侣蛋白；所述共价连接包括连接子连接、肽键连接和双功能基团连接，所述非共价连接包括亲和偶联。
进一步，根据本发明的实施例，所述载体蛋白包括BSA、OVA、HSA、KLH和Fc等；所述活性肽包括线性肽和环形肽，具有酶活性、细胞毒活性、抗原结合活性等；所述标签肽包括纯化标签肽和示踪标签肽；所述伴侣蛋白包括HSP60、HSP70和HSP90。
进一步，根据本发明的实施例，所述结合分子为单域抗体、重链抗体、驼源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多特异性抗体(包括双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)、单价抗体和多价抗体(包括二价抗体、三价抗体、四价抗体等)。
进一步，根据本发明的实施例，所述多特异性抗体还具有一个或多个针对PD-L1其它表位或片段的特异性、和/或一个或多个针对其它抗原的特异性。
进一步，根据本发明的实施例，所述其它抗原选自CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM3、CD47、4-1BB、CD73、ROR1、HER2、HER3、EGFR和OX40中的至少一种。
第三方面，本发明提供了一种结合分子。根据本发明的实施例，所述结合分子为同源多聚体或异源多聚体，且包括至少一个前述的结合分子。
根据本发明的实施例，所述多聚体包括二聚体、三聚体、四聚体。
进一步，根据本发明的实施例，所述多聚体的至少两个单体分别包含前述的人PD-L1结合域，并且所述至少两个单体中的人PD-L1结合域相互作用使所述多聚体能够特异性结合人PD-L1。
第四方面，本发明提供了一种抗人PD-L1单域抗体的可变区。根据本发明的实施例，该抗人PD-L1单域抗体的可变区包括选自SEQ ID NO:1、4和6-32中的任一氨基酸序列。
第五方面，本发明提供了一种人源化抗人PD-L1重链抗体。根据本发明的实施例，该重链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的且具有人PD-L1结合能力的突变体。
进一步，根据本发明的实施例，所述突变体的突变是选自以下位点的组合：A23、G44、L45、D72、N73、K75、Q81、E26、Y27、I28、G29、N103、T105、A74、L78、D100、P101、E98、R99、E110、P109和V104。
进一步，根据本发明的实施例，所述突变体的突变是选自由以下突变位点的氨基酸替换组成的组：A23I、G44E、L45R、D72N、N73H、K75G、Q81E、E26G、Y27F、I28T、G29F、N103S、N103A、T105I、T105L、T105A、T105Y、A74S、L78V、D100S、P101R、P101S、E98D、R99E、E110T、E110S、P109A、V104P、T105Q、N103Q、N103D和N103T。
进一步，根据本发明的实施例，所述突变体的突变选自：
A23I，
G44E+L45R，
D72N+N73H+K75G，
Q81E，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G，
E26G+Y27F+I28T+G29F+G44E+L45R+D72N+N73H+K75G，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+N103S，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+N103A，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+T105I，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+T105L，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+T105A，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+T105Y，
G44E+L45R+A74S+L78V，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+D100S，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+P101R，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+P101S，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+E98D，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+R99E，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+E110T，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+E110S，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+P109A，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+V104P，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+T105Q，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+E98D+T105I，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+N103Q，
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+N103D，或
G44E+L45R+D72N+N73H+K75G+N103T。
第六方面，本发明提供一种免疫偶联物。根据本发明的实施例，该免疫偶联物包括：
(1)前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、或本发明前述的人源化抗人PD-L1重链抗体；
以及
(2)偶联部分。
进一步，根据本发明的实施例，所述偶联部分包括可检测标记、细胞毒性分子或生物活性分子。
进一步，根据本发明的实施例，可检测标记包括化学发光标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点和纳米颗粒。
进一步，根据本发明的实施例，细胞毒性分子包括白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和蓖麻毒素等。
进一步，根据本发明的实施例，生物活性分子包括细胞因子、酶、化疗剂、脂质体和病毒颗粒。
第七方面，本发明提供了一种组合物。根据本发明的实施例，该组合物包含前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、前述的人源化抗人PD-L1重链抗体或前述的免疫偶联物。
进一步，根据本发明的实施例，所述组合物还包含生物治疗剂、化学治疗剂和天然活性成分等。
进一步，根据本发明的实施例，所述组合物还包含药学上可接受的载体，并作为药物组合物使用。
根据本发明的实施例，所述药物组合物为水剂、针剂、粉针剂。
第八方面，本发明提供一种多核苷酸。根据本发明的实施例，该多核苷酸编码前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、或前述人源化抗人PD-L1重链抗体。
第九方面，本发明提供了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，该核酸构建体包含前述的多核苷酸。
第十方面，本发明提供了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，该宿主细胞包含前述的多核苷酸或前述的核酸构建体。
第十一方面，本发明提供一种制备前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、或前述的人源化抗人PD-L1重链抗体的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达重组外源蛋白的条件下培养权利要求26所述宿主细胞；
(2)可选的，从细胞培养物中分离纯化结合分子、抗人PD-L1单域抗体、抗人PD-L1单域抗体的可变区、或人源化抗人PD-L1重链抗体。
进一步，根据本发明的实施例，所述宿主细胞为大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
第十二方面，本发明提供了一种制备前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、前述的人源化抗人PD-L1重链抗体或前述的免疫偶联物。根据本发明的实施例，采用重组表达法、化学合成法或重组表达和化学合成联合法制备得到的。
进一步，根据本发明的实施例，所述化学合成法为固相合成法、液相合成法或固相-液相合成法。
进一步，根据本发明的实施例，所述化学合成法采用N端至C端合成法、C端至N端合成法或分段合成法。
第十三方面，本发明提供前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、或前述的人源化抗人PD-L1重链抗体、前述的免疫偶联物、或前述组合物在制备治疗PD-1/PD-L1信号通路阻断剂中的用途。
第十四方面，本发明提供了前述的结合分子、前述的抗人PD-L1单域抗体、前述抗人PD-L1单域抗体的可变区、或前述的人源化抗人PD-L1重链抗体、前述的免疫偶联物、或前述组合物在制备用于诊断、预防、治疗、或评估PD-1/PD-L1信号通路过表达相关疾病的产品中的用途。
进一步，根据本发明的实施例，所述PD-1/PD-L1信号通路过表达相关疾病包括异常增生性疾病或免疫相关疾病。
进一步，根据本发明的实施例，异常增殖性疾病选自肿瘤、囊肿和增生；所述免疫相关疾病选自炎症、免疫缺陷、免疫耐受和过敏。
进一步，根据本发明的实施例，所述肿瘤选自：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、神经内分泌肿瘤、恶性间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤、Merkel细胞癌以及所有微卫星高度不稳定(MSI-H)的实体瘤。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
除非另外指出，无论在本文中用于指代重链抗体或指代常规4-链抗体，术语“免疫球蛋白序列”均用作通用术语，包括全尺寸抗体，其单独的链，以及其所有部分、结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，如在本文中所使用的术语“序列”(例如在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”的术语中)通常应被理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列二者，除非上下文需要更有限制性的解释。
可以使用免疫球蛋白单可变结构域作为用于制备含有可以充当结合单元(即，针对相同靶标的相同或不同表位和/或针对一个或多个不同靶标)的一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域的多肽的“结合单元”、“结合结构域”或“构建单元”(这些术语可互换使用)。
可与“单可变结构域”(“SVD”)互换使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”(“ISVD”)定义了其中抗原结合位点存在于单一免疫球蛋白结构域上并且由单一免疫球蛋白结构域形成的分子。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或它们的片段不同，其中两个免疫球蛋白结构域可变结构域，尤其是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况中，VH和VL二者的互补决定区(CDR)将会有利于抗原结合位点，即在抗原结合位点形成中将会涉及总计6个CDR。相比之下，免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单一VH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不多于三个CDR形成。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”和“单可变结构域”因此不包括需要至少两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点的常规免疫球蛋白或它们的片段。然而，这些术语包括其中通过单可变结构域形成抗原结合位点的常规免疫球蛋白的片段。
通常，单可变结构域将会是基本上由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列。这样的单可变结构域和片段是最优选的，从而它们包含免疫球蛋白折叠或者能够在适合条件下形成免疫球蛋白折叠。因此，单可变结构域可以例如包含轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其适合的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其适合的片段；只要其能够形成单一抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，以使得单一抗原结合单元不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元，例如对于在例如常规抗体和scFv片段中存在的、需要例如通过VH/VL相互作用而与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合结构域的可变结构域来说是这样的情况)。
在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或重链可变结构域序列(例如，VH序列)；更具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，单可变结构域或免疫球蛋白单可变结构域(或适合用作免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸)可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如在本文中定义的，并且包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或它们中任一种的任何适合的片段。
对于(单)结构域抗体的概括描述，还参考在本文中引用的现有技术以及参考EP0368684。用于术语“dAb”，例如参考Ward等人，1989(Nature341:544-546)，参考Holt等人，2003(Trends Biotechnol.21:484-490)；以及参考例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO06/003388、WO 06/059108、WO 07/049017、WO 07/085815和Domantis Ltd.的其他公布的专利申请。还应当指出，尽管因为它们不是哺乳动物来源的而在本发明上下文中较不优选，单可变结构域可以来源于鲨鱼的某些种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
尤其是，免疫球蛋白单可变结构域可以是
Figure BDA0003643406030000112
(如在本文中定义的)或其适合的片段。[注释：
Figure BDA0003643406030000111
是埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标]对于纳米抗体的概括描述参考以下的进一步描述，以及参考在本文中引用的现有技术，如，例如，在WO 08/020079(第16页)中描述的。
对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans 2001(分子生物技术中的综述(Reviews in Molecular Biotechnology)74:277-302)的综述文章，以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请：VrijeUniversiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams InstituutvoorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司的WO 03/050531；加拿大国立研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825和埃博灵克斯股份有限公司的另外的公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的另外的现有技术，并且尤其参考在国际申请WO 06/040153的第41-43页提及的参考文献清单，该清单和参考文献通过引用结合在本文中。如在这些参考文献中描述的，纳米抗体(尤其是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)的特征可以尤其在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。可以例如在WO 08/101985和WO 08/142164中找到纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体半衰期的不同修饰和它们的制备。
因此，在本发明的意义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源、优选骆驼科动物、优选骆驼科动物重链抗体的多肽。如之前描述的，它们可以是人源化的。此外，该术语包括来源于非骆驼科动物来源例如小鼠或人的已经“骆驼源化”的多肽，例如在Davies和Riechmann 1994(FEBS 339:285-290)、1995(Biotechnol.13:475-479)、1996(Prot.Eng.9:531-537)和Riechmann和Muyldermans 1999(J.Immunol.Methods 231:25-38)中描述的。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物免疫球蛋白序列。其还包括完全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白序列。例如，它包括骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化骆驼科动物免疫球蛋白序列，或骆驼源化免疫球蛋白单可变结构域，例如由Ward等人，1989描述的骆驼源化dAb(参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann 1994、1995和1996)和骆驼源化VH。
同样地，这样的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何适合的方式来源于任何适合的来源，并且例如可以是自然存在的VHH序列(即，来自适合的骆驼科动物物种)或合成或半合成氨基酸序列，包括但不限于部分或完全“人源化”的VHH、“骆驼源化”的免疫球蛋白序列(并且尤其是骆驼源化VH)，以及通过以下技术获得的纳米抗体和/或VHH：如亲和力成熟(例如，从合成的、随机的或自然存在的免疫球蛋白序列如VHH序列开始)、CDR移植、镶盖术(veneering)、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR装配、和技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术；或前述中任一项的任何适合的组合。
免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列和结构可以被认为——然而不限于——由四个构架区或“FR”组成，其在本领域中和在本文中分别被称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；以及“构架区4”或“FR4”；所述构架区被三个互补决定区或“CDR”隔开，其在本领域中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。
在免疫球蛋白单可变结构域中的氨基酸残基的总数量可以在110-120的范围内，优选为112-115，并且最优选113。
如在WO 08/020079(通过引用结合在本文中)的第58和59页的q)段中进一步描述的，根据由Kabat等人给出的针对VH结构域的通用编号(“Kabat编号”)(“免疫学目标蛋白序列(Sequence of proteins ofimmunological interest)”,美国公众健康服务中心(USPublic HealthServices),NIH Bethesda,MD,公布号91)对免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基进行编号，如在Riechmann和Muyldermans 2000(J.Immunol.Methods 240:185-195；参见例如该出版物的图2)的文章中应用于骆驼科动物的VHH结构域的，并且相应地，免疫球蛋白单可变结构域的FR1包含在1-30位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR1包含在31-35位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含在36-49位的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的CDR2包含在50-65位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含在66-94位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR3包含在95-102位的氨基酸残基，并且免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含在103-113位的氨基酸残基。
基于在本文中以及在WO 08/020079中、在WO 06/040153中和在另外的关于免疫球蛋白单可变结构域的在其中引用的参考文献中给出的免疫球蛋白单可变结构域序列的实例，将会清楚的是，氨基酸残基的精确数量还将会取决于在免疫球蛋白单可变结构域中存在的特定CDR的长度。就CDR而言，如在本领域中公知的，存在多种定义并且描述VH或VHH片段的CDR的习惯，如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(其基于结构环区域的位置)。例如，参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/。对于本说明书和权利要求的目的来说，即使也可以提及根据Kabat的CDR，最优选基于Abm定义(其基于OxfordMolecular的AbM抗体建模软件)来定义CDR，因为认为这是在Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷。再次参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVSS，即109、110、111、112和113位中的每一个。本发明还包括在109、110、111或112位终止的ISVD。在本发明的一个方面中，FR4以C端氨基酸序列VTVS(109-112位)终止，FR4以C端氨基酸序列VTV(109-111位)终止，FR4以C端氨基酸序列VT(109-110位)终止，或者FR4以C端氨基酸V(109位)终止。C端延伸可以存在于最后一个(位于最C端)的ISVD的FR4的最后一个氨基酸残基例如V109、T110、V111、S112或S113的C端，其中本发明的半胱氨酸部分优选存在于或者位于C端延伸的C末端。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVSS并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVSSC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVS并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVSC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTV并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VT并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸V并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VC终止)。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD选自由下列各项组成的组：单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列、纳米抗体、VHH、人源化VHH、和骆驼源化VH。优选地，ISVD包含100至140个之间的氨基酸，如110-130个之间的氨基酸。
术语“噬菌体展示文库”是指外源性肽或蛋白质在其表面上表达的噬菌体的“文库”。外来肽或多肽被展示在噬菌体衣壳外表面上。外来肽可展示为作为噬菌体外壳蛋白的一部分并入的重组融合蛋白；通常不是噬菌体外壳蛋白，但能够变得并入衣壳外表面中的重组融合蛋白；或变得共价或非共价连接于所述蛋白质的蛋白质或肽。这是通过将外源性核酸序列插入可被包装至噬菌体粒子中的核酸中来达成。所述外源性核酸序列可例如被插入噬菌体外壳蛋白基因的编码序列中。如果外来序列是框内克隆，那么它编码的蛋白质将表达为外壳蛋白的一部分。因此，核酸序列的文库，如由编码一个或多个个体的整个B细胞谱系的基因区段制得的抗体谱系的文库，可被如此插入噬菌体中以产生“噬菌体文库”。当代表由核酸文库编码的肽和蛋白质的那些肽和蛋白质由噬菌体展示时，产生“肽展示文库”。尽管多种噬菌体用于所述文库构建中，但通常使用丝状噬菌体(Dunn(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7:547-553)。参见例如以下对噬菌体展示文库的描述。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison SL等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984)。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
术语“多特异性抗体”，本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可对目标多肽的不同表位具特异性或可以含有对超过一种目标多肽具特异性的抗原结合域。参见例如Tutt等人，1991，《免疫学杂志》147：60-69；Kufer等人，2004，《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》22：238-244。本发明的抗体可以键联到另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)或与其共同表达。举例来说，抗体或其片段可以功能上键联(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或以其它方式)到一个或多个其它分子实体，如另一抗体或抗体片段，以制备具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。举例来说，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对溶血素A的N端区或其片段具特异性，而免疫球蛋白的另一条臂对溶血素A的C端区或第二治疗剂靶标具特异性，或结合于治疗剂部分。可以用于本发明的背景中的示例性双特异性抗体格式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，且其中至少一个氨基酸差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比有所减少。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号是H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU是Y436F)。第二CH3内可发现的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU是N384S、K392N和V422I)；和在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。关于上文所描述的双特异性抗体格式的变化涵盖于本发明范围内。可以用于本发明的背景中的其它示例性双特异性格式包括但不限于例如基于scFv或双功能抗体双特异性格式、IgG-scFv融合物、双重可变域(DVD)-Ig、四体杂交瘤(Quadroma)、杵入臼结构、常见轻链(例如具有杵入臼结构的常见轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、白氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(关于前述格式的综述参见例如Klein等人2012，mAbs 4：6，1-11和其中所引用的参考文献)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸结合来构筑，例如其中具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于产生位点特异性抗体-寡核苷酸结合物，其然后自组装成具有所规定的组成、价数和几何形状的多聚复合物。(参见例如Kazane等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》[电子出版：2012年12月4日)。
术语“单域抗体”用基因工程方法获得，主要有3类，第一类是从骆驼科动物HCAb获得的重链可变区，为单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼IgNAR获得的重链可变区，用VNAR表示。第三类是从人源或鼠源单抗获得的重链或轻链可变区，保留了抗原结合活性，但亲和性和可溶性大为下降。
术语“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2(IgG2A，IgG2B)，IgG3和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，参见Malmqvist M,1993,Nature,361:186-187。Kd/Ka的比率等于解离常数KD，参见Davies DR等,1990,Annual Rev Biochem.,59:439-473。可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
术语“抗体药物偶联物”、“免疫偶联物”，由抗体、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品极少不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。
本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性地表达在一种或多种癌症细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言,这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。
术语“缀合”、“连接”、“偶联”是指两个或更多个分子的缔合。连接也可以是遗传的(即重组融合)。在具体上下文中，所述术语包括提及连接配体(例如抗体部分)与效应分子。所述连接这种连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，例如可通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，使所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
术语“细胞毒剂”用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90、Re186)、化学治疗剂、和毒素(诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素)，或其片段。
术语“细胞因子”一般指由一种细胞群体释放的，作为细胞间介质对另一细胞起作用或者对生成该蛋白质的细胞具有自分泌影响的蛋白质。此类细胞因子的例子包括淋巴因子，单核因子；白介素(“IL”)，例如IL-2，IL-6，IL-17A-F；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，例如白血病抑制因子(“LIF”)。
术语“载体”、“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。
术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
术语“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，对链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，例如但不限于糖基化，磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。
术语“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其他方式促成发病的免疫相关疾病，还包括刺激或干预免疫应答对该疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。
术语“癌症”和“肿瘤”是指或描述哺乳动物的其中细胞群体的特征在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、良性或恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、脑癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌、I型或II型神经纤维瘤病。所述癌症的其它实例包括具有疗法抗性、难治性或转移性的那些。
本发明取得了以下有益的技术效果：
第一、目前抗PD-L1抗体以完整的全抗体为主，纳米抗体的抗PD-L1纳米抗体目前仅有一个作为孤儿药资格获批的Envafolimab(KN035)。本发明开发了具有良好生物学活性和成药性的抗PD-L1纳米抗体，为临床开发具有更好疗效的抗PD-L1单抗和多特异抗体药物提供了更多选择。
第二、本发明基于现有技术中从鼠源抗体出发进行人源化、骆驼化改造导致亲和力不高、可溶性差的缺陷，采用噬菌体表面展示技术构建免疫骆驼VHH抗体文库，通过文库筛选、人源化获得了高亲和力特异结合人PD-L1蛋白的人源化抗PD-L1单域抗体，其亲和力(KD)为2.26nM，与对照抗体KN035相当。亲和力高特异性好的基本特性为hzB6对PD-1/PD-L1信号通路的抑制作用提供了理论依据和广阔的应用前景。
第三、单域抗体由于单价、分子量小，因此通常生物活性不高、代谢动力学效果不理想，截止目前临床上的应用仍较为少见。本发明实施例制备的人源化抗PD-L1单域抗体hzB6及其衍生物具有良好的生物学活性，可以有效的结合细胞表面重组表达的人PD-L1，与重组表达了人PD-L1的CHO细胞(CHO-PD-L1)结合的EC50为0.87nM；可以有效阻断重组人PD-L1与其受体PD-1的结合作用，IC50为7.99nM；通过使用Jurkat-PD1-NFAT细胞和CHO-PD-L1-CD3L细胞报告基因方法检测hzB6对PD-1/PD-L1信号通路的阻断，结果活性EC50为1.99nM；hzB6具有良好的体内稳定性，并且在hPD-1/hPD-L1/hLAG-3转基因小鼠MC38-hPD-L1肿瘤模型中可以有效抑制肿瘤生长。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：FACS分析chB6与细胞表面抗原的结合活性。
图2：ELISA分析chB6与重组PD-L1结合特异性。
图3：chB6对细胞表面PD-L1结合特异性分析。
图4：hzB6对人PD-L1与其受体PD-1结合的抑制作用分析结果图。
图5：报告基因系统评估hzB6m24的体外阻断活性。
图6：hzB6m24在Balb/C小鼠体内单次给药药-时曲线。
图7：hzB6m24对人hPD-1/hPD-L1/hLAG-3转基因小鼠皮下同种移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤模型的抗肿瘤药效实验结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：噬菌体展示骆驼单域抗体制备
利用人PD-L1重组蛋白抗原免疫骆驼，分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板扩增单域抗体重链可变区(variable domain of theheavy-chain of heavychain antibody,VHH)并连入噬菌体展示载体，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建骆驼免疫库。随后利用PD-L1重组蛋白通过固相筛选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示单域抗体。最终通过筛选获得了可结合人PD-L1重组蛋白的噬菌体展示的驼源单域抗体B6(VHH-B6)。测序确定VHH-B6的可变区序列见SEQID NO.1(其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:33、35、36所示)。
SEQ ID NO.1：骆驼来源单域抗体VHH-B6可变区氨基酸序列QVQLQESGGDSVQAGGSLRLSCIASEYIGDRYCAGWFRQAPGKEREGVAMIDRHGIVRYKDSVEGRFTISRNHAGNTLFLEMNSLKAEDTAMYYCAAERDPTNVTPCRPEYPDMDYWGKGTQVTVSS
实施例2：抗人PD-L1嵌合单域抗体融合蛋白及对照抗体的制备
设计特异性引物，以阳性克隆噬粒为模板，PCR获得驼源抗体VHH-B6的可变区基因，通过酶切连接，将可变区基因克隆入含有人Fc(IgG1，hFc)编码基因的真核表达载体上。获得序列正确的表达质粒后，转染293F细胞进行瞬时表达，通过Protein A纯化，最终获得人-骆驼嵌合单域抗体融合蛋白(VHH-B6-human-Fc chimeric antibody，简称chB6)。人Fc(IgG1，hFc)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
参照WHO公布的Envafolimab抗体序列(International Nonproprietary Namesfor Pharmaceutical Substances,Recommended INN:List 82,Pre-publication copy,Page30-31)，全合成了KN035的可变区基因，KN035可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用上述相同的策略构建chB6相同形式的KN035-hFc融合蛋白，简称KN035。
SEQ ID NO.2：人IgG1 Fc区氨基酸序列
ASEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO.3：KN035可变区氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTSGSTYLADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTLVTVSS
实施例3：抗人PD-L1嵌合单域抗体结合活性分析
3.1BLI测定结合活性
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定chB6结合重组抗原的能力。测定时将chB6用PBS缓冲液稀释至4μg/mL，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。人PD-L1重组蛋白作为流动相，与捕获在芯片表面的抗体作用。PD-L1重组蛋白浓度为60nM。每个抗原的结合时间为300s，最后的解离时间为300s。结果如表1所示。在上述实验条件下，chB6对PD-L1重组蛋白具有较高亲和力，与对照抗体KN035亲和力相近。
表1.chB6和KN035与人PD-L1重组蛋白亲和力测定结果
Figure BDA0003643406030000231
3.2FACS分析结合活性
离心收集细胞(CHO-PD-L1-CD3L细胞)，将细胞分为5×105cells/样品/100μL，加入梯度稀释的单域抗体，加入的抗体终浓度为：最高浓度66nM，3倍连续稀释10个梯度。冰上孵育2h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍；加入FITC标记的抗人Fc二抗(Cat.:F9512，Sigma)，冰上孵育1h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍，重悬于200μL流式缓冲液中，流式细胞仪(型号B49007AD，SNAW31211，BECKMAN COULTER)检测细胞的平均荧光强度(MFI)。检测结果如图1所示，chB6和KN035与表达在细胞表面的PD-L1结合活性相当，其半数有效结合浓度(EC50)值分别为0.87nM、1.27nM。
实施例4：抗人PD-L1嵌合单域抗体特异性分析
4.1ELISA鉴定嵌合抗体与重组抗原的特异性
将人重组蛋白(PD-L1、PD-1、B7H3、B7H4、CTLA4、CD28、ICOS等)用PBS稀释至1μg/mL，100μL/孔包被酶联板，4℃包被过夜；5％BSA封闭液37℃恒温培养箱封闭60min，PBST洗板3次；加入稀释至1μg/mL的chB6，37℃反应60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-Anti-human IgG反应45min，PBST洗板4次；最后加入TMB底物显色，37℃恒温培养箱反应15min，2M HCl终止反应，以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。结果如图2所示，chB6和PD-L1特异性结合，与其他重组蛋白不结合。
4.2BLI鉴定种属特异性
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定chB6是否可以结合重组猴、鼠PD-L1。测定时将chB6用PBS缓冲液稀释至4μg/mL，流经AHC探针(PALL，Cat:18-0015)表面，时间为120s。猴PD-L1重组蛋白、鼠PD-L1重组蛋白作为流动相，与捕获在芯片表面的抗体作用。PD-L1重组蛋白浓度为60nM。每个抗原的结合时间为300s，最后的解离时间为300s。结果如表2所示，chB6和KN035均与猴PD-L1重组蛋白结合，且亲和力相当；而不与鼠PD-L1重组蛋白结合。
表2.chB6和KN035与猴、鼠PD-L1重组蛋白结合活性分析
Figure BDA0003643406030000241
4.3FACS鉴定嵌合抗体特异性
离心收集细胞，培养基重悬，分为3×105cells/样品/100μL，加入20μg/ml的单域抗体。冰上孵育2h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍；加入FITC标记的抗人Fc二抗(sigma,F9512)，冰上孵育1h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍，重悬于200μL流式缓冲液中，流式细胞仪检测。检测结果如图3所示，chB6对各肿瘤细胞的反应性与对照抗体KN035完全相同，均特异性结合表达人PD-L1的细胞株，而不结合非表达细胞株。
实施例5：chB6人源化改造
选择可变区与骆驼抗体VHH-B6可变区同源性最高的人重链可变区框架，通过CDR移植，并保留部分支撑结构氨基酸，对VHH-B6的可变区进行人源化改造，设计人源化单域抗体融合蛋白(VHH-B6-human-Fc humanized antibody，简写为hzB6)可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。合成hzB6可变区核苷酸序列，并构建hzB6的重组表达载体，利用构建的全长hzB6表达载体进行真核表达后，用BLI法测定亲和力，并进行相关分析。
对抗体株hzB6进行进一步突变，获得从大量突变体抗体，突变序列CDR区氨基酸序列突变位点及突变方案如下表3所示，hzB6突变体可变区氨基酸序列如表4所示(SEQ IDNO.6～SEQ ID NO.32)，hzB6突变体与人PD-L1的结合和解离常数如表5所示。
SEQ ID NO.4:hzB6可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYIGDRYCAGWFRQAPGKGLEGVAMIDRHGIVRYKDSVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAERDPTNVTPCRPEYPDMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.5:hzB6全长氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYIGDRYCAGWFRQAPGKGLEGVAMIDRHGIVRYKDSVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAERDPTNVTPCRPEYPDMDYWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
表3.hzB6突变体CDR区氨基酸序列突变位点及突变方案
Figure BDA0003643406030000251
Figure BDA0003643406030000261
表4.hzB6突变体可变区氨基酸序列
Figure BDA0003643406030000262
Figure BDA0003643406030000271
Figure BDA0003643406030000281
Figure BDA0003643406030000291
表5.hzB6突变体与人PD-L1重组蛋白亲和力测定结果
Figure BDA0003643406030000292
Figure BDA0003643406030000301
实施例6：ELISA检测hzB6及其突变体对人PD-L1/PD-1结合的抑制作用
将人PD-1-hFc(PD-1序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)用PBS稀释至0.5μg/mL，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。梯度稀释hzB6和对照抗体KN035，以及同型对照NC-hIgG1(起始工作浓度为50nM，1.5倍稀释10个浓度梯度)，加入工作浓度为0.5μg/mL的PD-L1-mFc(PD-L1序列号：NP_054862.1，19aa-238aa)共孵育，37℃恒温培养箱反应60min。PBST洗板4次；然后加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse Fc(Cat:115-035-071，Jackson Immuno Research)，反应45min，加入TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl终止后读板。以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm-630nm。结果如图4所示，hzB6可以有效阻断重组人PD-L1与其受体PD-1的结合作用。其半数有效抑制浓度(IC50)为7.99nM。用同样的方法测定hzB6突变体的活性，结果大部分突变体保持了和hzB6相当的半数有效抑制浓度(IC50，表6)。
表6.hzB6及其突变体对人PD-L1/PD-1结合的抑制作用
Figure BDA0003643406030000311
Figure BDA0003643406030000321
实施例7：PD-1、PD-L1报告基因法评价细胞阻断活性
使用Jurkat-PD1-NFAT细胞和CHO-PD-L1-CD3L细胞报告基因方法(Reporter GeneAssay，RGA)检测hzB6对PD-1和PD-L1通路的阻断作用。具体如下：对数生长期的CHO-PD-L1-CD3L细胞将细胞密度调整至5×105个/ml，以100μl/孔铺板培养过夜。抗体样品用培养基品分步预稀释至20μg/ml，再进行2倍梯度稀释，共10个点，将稀释后样品加入到过夜培养的细胞中，50μl/孔。同时加入2×106个/ml浓度的Jurkat-PD1-NFAT细胞，50μl/孔。置于细胞培养箱孵育6h。提前1～2h取出适量分装Bio-GloTMLuciferase底物并融化，室温避光放置。从培养箱取出细胞板，平衡至室温后(约10～15min)，向细胞板100μl/孔加入Bio-GloTMLuciferase底物，将细胞板置于微孔板恒温振荡器中，800rpm避光孵育20min。设置多功能酶标仪为Luminescence模式，Intergration选择500(仪器默认值)，读取RLU。利用SoftMax软件分析数据，以样品浓度为X轴，RLU平均检测值为Y轴，选择四参数方程绘制标准曲线。根据参比品和供试品曲线拟合结果的EC50值，计算得到供试品的相对生物学活性。hzB6及其大部分突变体的阻断活性与KN035基本相当，其中hzB6m24的EC50为1.99nM，而对照KN035的EC50为3.31nM。用同样的方法测定hzB6其他突变体的阻断活性，结果大部分突变体保持了和hzB6相当的活性水平(EC50，表7)；hzB6m24对PD-1和PD-L1结合阻断活性结果如图5所示。
表7.chB6、hzB6及其突变体对PD-1和PD-L1结合的体外阻断活性
Figure BDA0003643406030000322
Figure BDA0003643406030000331
Figure BDA0003643406030000341
实施例8：hzB6及其突变体在小鼠体内的半衰期测定
将健康雌性5周龄裸小鼠，3只一组，经尾静脉将抗体注射进小鼠体内，给药剂量为单次单剂量15mg/kg，分别于给药后2h、4h、8h、24h、48h、96h、144h、196h尾静脉采血，收集血样并离心分离血清，-20℃保存待用，考察其药代动力学特性。采血全部完成后，包被PD-L1-His(序列号：NP_054862.1，19aa-238aa)于96孔酶联板，0.5ug/ml，100ul/孔，4℃过夜，PBS洗板3次后，加入5％BSA PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入待检测血清样本(10000，20000倍稀释)，设置hzB6(或其突变体)标准曲线孔(起始浓度为0.05μg/mL，2倍连续稀释，12个梯度)，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-羊抗人IgG(Fcr)(Cat:109-035-098，Jackson Immuno Research)，37℃孵育40min，PBST洗板4次；加入TMB底物(Cat：ME142，北京泰天河生物技术有限公司)显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。以标准抗体的浓度为Y轴，OD值为X轴，绘制时间——抗体浓度曲线图，进行线性拟合，并根据公式T1/2＝|0.693/k|，计算药物半衰期T1/2。
结果如图6所示，在上述条件下，hzB6的突变体m24在小鼠体内半衰期为85小时，提示hzB6m24具有良好的体内半衰期和稳定性。同样的方法测定其他大部分突变体小鼠体内半衰期，均在70-100小时左右。
实施例9：hzB6m24对人PD-1/PD-L1/LAG-3转基因小鼠皮下移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤模型的抗肿瘤药效检测
高表达人PD-L1的鼠结肠癌肿瘤细胞MC38-hPDL1接种于雌性hPD-1/hPD-L1/hLAG-3转基因小鼠(C57来源的PD-1/PD-L1/LAG-3人源化小鼠，购自百奥赛图，Cat.130572)右侧前胁肋部皮下，在肿瘤生长至100mm3左右时分组给予hzB6m24和同型对照IgG，给药剂量分别为6mg/kg、3mg/kg，每周2次，共给药3次。每次给药的同时测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。结果如图7所示，图7表明受试药物hzB6m24有效地抑制了PD-L1阳性肿瘤的生长。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京科诺信诚科技有限公司
<120> 一种抗PD-L1单域抗体及其衍生蛋白
<150> 202110529312.1
<151> 2021-05-14
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Ala Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
100 105 110
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
195 200 205
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser
100 105 110
Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Ser Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Ala Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Ile Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 15
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Leu Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Ala Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Tyr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Ser Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Arg Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 21
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Ser Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 23
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Glu Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Thr Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asn Pro Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Gln Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 31
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Asp Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 32
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn His Ala Gly Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Arg Asp Pro Thr Thr Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro
100 105 110
Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr Cys Ala Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Asp Arg Tyr Cys Ala Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu Gly
1 5 10 15
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Arg Asp Pro Thr Ser Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Arg Asp Pro Thr Ala Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Ile Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Leu Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Ala Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Tyr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Arg Ser Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Arg Asp Arg Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Arg Asp Ser Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Asp Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Glu Glu Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Thr Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Pro Ser Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Thr Pro Cys Arg Ala Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Pro Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Glu Arg Asp Pro Thr Asn Val Gln Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Asp Arg Asp Pro Thr Asn Val Ile Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 54
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Glu Arg Asp Pro Thr Gln Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Glu Arg Asp Pro Thr Asp Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Glu Arg Asp Pro Thr Thr Val Thr Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Tyr

Claims (20)

1.一种抗人PD-L1抗体，其特征在于，包括至少一个单域抗体，所述单域抗体中的
CDR1具有EYIGDRYCAG(SEQ ID NO:33)或GFTFDRYCAG(SEQ ID NO:34)所示的氨基酸序列；
CDR2具有MIDRHGIVRYKDSVEG(SEQ ID NO:35)所示的氨基酸序列，
CDR3具有X1X2X3X4TX5X6X7PCRX8X9YPDMDY，
其中
X1选自E、D，
X2选自R、E，
X3选自D、S，
X4选自P、R、S，
X5选自N、S、A、Q、D、T，
X6选自V、P，
X7选自T、I、L、A、Y、Q，
X8选自P、A，
X9选自E、T、S。
2.如权利要求1所述抗体，其特征在于，所述单域抗体为驼源单域抗体、嵌合单域抗体或人源化单域抗体。
3.如权利要求2所述抗体，其特征在于，其包括选自SEQ ID NO:1、4和6-32中的任一氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述抗体，其特征在于，所述抗人PD-L1抗体为同源多聚体或异源多聚体，且包括至少一个所述单域抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述多聚体为二聚体、三聚体和四聚体。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述多聚体至少包括两个所述单域单体，并且所述至少包括两个所述单域单体的人PD-L1结合域相互作用使所述多聚体能够特异性结合人PD-L1。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，包括：
(1)权利要求1-6中任一项所述的抗人PD-L1抗体；
以及
(2)偶联部分。
8.如权利要求7所述的免疫偶联物，其特征在于，所述偶联部分为可检测标记物、细胞毒性分子或生物活性分子。
9.如权利要求8所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记包括化学发光标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点和纳米颗粒。
任选地，所述细胞毒性分子包括白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和蓖麻毒素。
任选地，所述生物活性分子包括细胞因子、酶、化疗剂、脂质体和病毒颗粒。
10.一种组合物，其包含1-6中任一项所述的抗人PD-L1抗体或权利要求7-9中任一项所述免疫偶联物。
11.如权利要求10所述组合物，其特征在于，还包含生物治疗剂、化学治疗剂和天然活性成分。
12.如权利要求10所述组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体，并作为药物组合物使用。
13.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-6中任一项所述的抗人PD-L1抗体。
14.核酸构建体，其特征在于，包含权利要求13所述的多核苷酸。
15.宿主细胞，其特征在于，包含权利要求13所述的多核苷酸或权利要求14所述的核酸构建体。
16.权利要求1-6中任一项所述的抗人PD-L1抗体、权利要求23-27中任一项所述免疫偶联物、或权利要求10-12中任一项所述组合物在制备治疗PD-1/PD-L1信号通路阻断剂中的用途。
17.权利要求1-11中任一项所述的结合分子、权利要求7-9任一项所述的免疫偶联物、或权利要求10-12中任一项所述组合物在制备用于诊断、预防、治疗、或评估PD-1/PD-L1信号通路过表达相关疾病的产品中的用途。
18.如权利要求17所述用途，其特征在于，所述PD-1/PD-L1信号通路过表达相关疾病包括异常增生性疾病或免疫相关疾病。
19.根据权利要求18所述用途，其特征在于，所述异常增殖性疾病选自肿瘤、囊肿和增生；所述免疫相关疾病选自炎症、免疫缺陷、免疫耐受和过敏。
20.根据权利要求19所述用途，其特征在于，所述肿瘤选自：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、神经内分泌肿瘤、恶性间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤、Merkel细胞癌以及所有微卫星高度不稳定(MSI-H)的实体瘤。
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