CN115337404A - 细胞微颗粒在治疗呼吸道病毒性肺炎上的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及细胞微颗粒在治疗呼吸道病毒性肺炎上的应用。具体而言，涉及一种肿瘤细胞来源的微颗粒(MPs)，其包含凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，所述细胞囊泡在其表面表达刺突蛋白结合受体。MPs具有较高的生物安全性，研究发现微颗粒表面的受体具有吸附病毒的能力，并且巨噬细胞能高效地摄取MPs，可用于治疗病毒性肺炎。
Description
技术领域
本申请涉及生物、医学、临床领域。具体而言，涉及细胞微颗粒在治疗新型冠状病毒肺炎感染中的用途。
背景技术
病毒性肺炎可爆发，也可散发流行。病毒性肺炎可在一年中的任何时候发生，但多见于冬春季节。最初，病毒性肺炎以上呼吸道病毒感染为主，随着病毒向下蔓延至肺部引起肺炎。
病毒性肺炎可通过飞沫传染。临床表现一般较轻，以头痛、乏力、发热、咳嗽等呼吸道疾病相似症状为主。呼吸道感染是全球最主要的死亡原因之一，尤其是重症肺炎患者出现高死亡率和严重的后遗症。目前，流感病毒、冠状病毒等病毒是导致区域爆发性重症肺炎的主要病原体，具有强传染性和高病死率。
新型冠状病毒肺炎COVID-19是由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病。
2019新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，主要的传播途径还是呼吸道飞沫传播和接触传播。新型冠状病毒肺炎主要表现为发热、干咳、乏力，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症患者多在一周左右出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，最终导致患者死亡。新型冠状病毒具有强传染性和高病死率。
新型冠状病毒感染的肺炎疫情暴发后，尽管各国在药物开发方面做出了很大努力，但到目前为止，仍然没有有效治疗SARS-CoV-2感染的药物。对于新型冠状病毒肺炎的防治，疫苗研发取得了很大的进展，中国已经附条件上市的新冠疫苗已经达到4个，其中三个灭活疫苗，一个腺病毒载体疫苗。虽然疫苗可以极大地防止病毒传播，但是对于已经感染病毒的患者仍然需要探索更为有效的治疗方案。目前针对新型冠状病毒肺炎的药物研发主要是筛选针对病毒复制和包装的小分子化合物，然而许多小分子化合物面临着不确定性和安全性的挑战。尽管许多药物在体外展现出了良好的抗冠状病毒活性，但往往不具有人体内应用的价值。有一些药物已经用于临床抗病毒治疗，但是这些药物对于新型冠状病毒都没有特异性，其副作用也不容忽视。
因此，有必要探索新型冠状病毒肺炎患者的非常规治疗策略。
发明内容
本申请提供了一种肿瘤细胞来源的微颗粒，以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，其上表达刺突蛋白结合受体而作为靶向剂，更利于达到肺炎治疗部位。
技术人员知晓，细胞是由细胞膜包裹细胞的内容物构成，而细胞膜是由磷脂双分子层中间镶嵌蛋白质分子所组成，细胞的球状结构通过称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的牵拉力得以维持。当细胞受到外来信号(例如：化疗药、紫外线、辐射等)刺激而发生凋亡时，蛋白纤维丝断裂或失去附着，牵拉力消失，使得局部细胞膜结构向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放，囊泡的大小约为100至1000纳米，本申请所述的“细胞囊泡”。
采用了上述细胞囊泡作为载体，在其上表达靶向剂，更利于靶向治疗靶点。这种囊泡不能进入正常组织(其通透性约为5至10nm)，对正常组织不会产生损伤，也就避免了使用纳米材料等外源载体对机体的副作用。
在一些实施方案中，所述细胞囊泡源自肿瘤细胞，尤其是源自与所要治疗的部位同种类型的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞囊泡可以很容易地与患者体内的待治疗部位的细胞膜接触。在一些具体的实施方案中，患者的待治疗部位是肺。在一些实施方案中，肿瘤细胞是肺癌细胞；因而细胞囊泡源自肺癌细胞。
在另一些实施方案中，制备细胞囊泡所用的肿瘤细胞类型和细胞囊泡待施用部位的细胞类型，可以是不同的。作为一个示例，本申请的细胞囊泡制备自结肠癌细胞，然而所述细胞囊泡允许施用至肺。
在具体的实施方案中，制备细胞囊泡所用的肿瘤细胞，其自身包含氧化型胆固醇，例如包含羟基化修饰的胆固醇。作为一个示例，制备细胞囊泡所用的肿瘤细胞包含25-羟基化胆固醇。
本领域中公知且可获得的人肿瘤细胞系众多，所含氧化型胆固醇的含量存在差异。在一些实施方案中，允许选择富含氧化型胆固醇(如羟基化胆固醇)的肿瘤细胞系作为制备细胞囊泡的来源。
在一些实施方案中，肿瘤细胞是肺癌细胞，例如但不限于：NCI-H196、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299、NCI-H1650、H1792、NCI-H3255、A427、A549、0225-02Sp、2F7、95-D、SPCA-1、LLC、Calu-1、Calu-3、L1022、PC9R、MSTO-211H、TKB-1。在一个具体的实施方案中，肿瘤细胞是富含氧化型胆固醇的Calu-3。在一个具体的实施方案中，肿瘤细胞是富含氧化型胆固醇的A549。
在一些实施方案中，肿瘤细胞是结肠癌细胞系。所述结肠癌细胞选自：HCT116、HCT116/FU、HCT-8/FU、LoVo、LoVo ADR、SW480、SW620、CaCo-2、RKO-E6、RKO-AS45-1、FET、HT55、HT115、HT-29、COLO 205、KM12、CL-40、KM12-SM、COLO320DM、NCI-H508、SW1417、COLO394、WiDr。在一个具体的实施方案中，肿瘤细胞是富含氧化型胆固醇的Caco-2。
在一些实施方案中，所述靶向剂是在囊泡表面表达的刺突蛋白结合受体。
在一些实施方案中，细胞囊泡上表达的刺突蛋白结合受体，可以是天然表达的，也可以是重组表达的。
在一些实施方案中，刺突蛋白是肺炎病毒刺突蛋白(S；Spike)。
在一些实施方案中，所述肺炎病毒选自：SARS-CoV、SARS-CoV-2、或其变体。
在一些具体的实施方案中，所述刺突蛋白结合受体是血管紧张素转换酶2或其结合片段。
在一些具体的实施方案中，ACE2是人ACE2。该术语涵盖天然存在的人ACE2或其天然存在的变体，也包括人为表达的人ACE2或其变体，如重组体外表达的人ACE2或其变体。
本申请所述“血管紧张素转换酶2的结合片段”是指血管紧张素转换酶2的片段，只要其仍保留特异性结合刺突蛋白的能力，均属于本申请的范畴。本申请中的血管紧张素转换酶2或其结合片段可以是天然表达的、也可以是重组表达的、或者经基因改造的。
在一些实施方案中，所述肿瘤细胞选自：肺癌细胞、结肠癌细胞。
本申请提供了一种制备肿瘤细胞来源的微颗粒的方法，通过任何可行的方法使肿瘤细胞凋亡而得到细胞囊泡。
在一些具体的实施方案中，提供了一种制备肿瘤细胞来源的微颗粒的方法，包括步骤：
1)提供表达刺突蛋白结合受体的肿瘤细胞；
2)使步骤1)的所述肿瘤细胞凋亡；
3)收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡。
在一些具体的实施方案中，通过本领域任何公知的方法使细胞凋亡。作为非限制性示例，包括紫外线照射、X射线照射、或化疗药物(如地塞米松)。在本申请的方法中，可以采用不向肿瘤细胞引入外源物质的凋亡方法，因而优选辐射的方式(例如，紫外线照射、X射线照射)。在一些具体的实施方案中，辐射的时间长短和辐射强度，是技术人员根据常规操作能够确定的。
本申请的具体实施方案中，优选使用紫外线或化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡，对于细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下(或室温)条件下进行分离。优选的，通过离心机在低温条件下(如4℃左右)，以100至100000g的离心力，收集细胞囊泡。
在一些具体的实施方案中，通过离心收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，所述细胞囊泡的平均粒径为200nm至800nm，优选300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm±10％。
在一些具体的实施方案中，提供了一种制备肿瘤细胞来源的微颗粒的方法，包括步骤：
1)提供表达人ACE2或其结合片段的人肿瘤细胞，所述人肿瘤细胞是肺癌细胞或结肠癌细胞；
2)使步骤1)的所述肿瘤细胞发生凋亡；
3)通过以下方式收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，包括步骤：
在2至8℃，以800至1000g对步骤2)所得凋亡的肿瘤细胞离心5至15分钟，以去除完整细胞，得到第一产物；
在2至8℃，以12000至15000g对第一产物离心1至3分钟，以去除细胞碎片，得到第二产物；
在2至8℃，以12000至15000g对第二产物离心40至80分钟，以收集释放的细胞囊泡。
在一些具体的实施方案中，通过以下方式收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，包括步骤：
在2至8℃，以1000g对所得凋亡的肿瘤细胞离心10分钟，以去除完整细胞，得到第一产物；
在2至8℃，以14000g对第一产物离心2分钟，以去除细胞碎片，得到第二产物；
在2至8℃，以14000g对第二产物离心60分钟，以收集释放的细胞囊泡；按此步骤收集的细胞囊泡使其平均粒径落入100nm至1000nm的范畴，尤其是200至800nm。
本申请提供了一种通过前述方法制备的肿瘤细胞来源的微颗粒。
本申请提供了一种药物组合物，其包含根据本申请的肿瘤细胞来源的微颗粒。
根据本申请药物组合物的优选方案，该药物组合物包含所述细胞囊泡、或肿瘤细胞来源的微颗粒。
对于所收集到的微颗粒，可以按照常规方法制成药物组合物，尤其是雾化制剂或者喷剂制剂。
作为本申请的优选方案，由所述肿瘤细胞来源的微颗粒所形成的药物组合物的平均粒径为100至1000纳米，可以提及的非限制性示例是100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000±10％nm。
本申请提供的药物组合物可以按照常规临床治疗方法给药，例如对于肺炎，可以直接滴鼻、喷雾、或灌注至肺部而给药；给药剂量可按照医疗工作者确定的剂量进行使用。
在具体的实施方案中，本申请提供的微颗粒、细胞囊泡、药物组合物制备成肺部施用的剂型。
作为一个示例，用于肺部施用可吸入的粉末可以通过常规的技术生产，如喷射制粉(jet milling)、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体浓缩(supercritical fluidcondensation)等。用干粉吸入器(dry powder inhalers，DPI)如基于NektarTM、Vectura(GyrohalerTM)和GSK(DiscusTM)或Astra(TurbohalerTM)等生产的计量吸入器(metereddose inhalers)，在合适的载体中(如甘露醇、蔗糖或乳糖)包含本申请的微颗粒、细胞囊泡或药物组合物，输送到末端肺泡表面。也可以使用超声波喷雾器，将有脂质体(或没有脂质体)的溶液制剂递送至肺部。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种A549细胞来源的微颗粒，其可用作新型冠状病毒肺炎感染者的治疗手段。微颗粒表面存在的血管紧张素转换酶2(ACE2)是一种能与SARS-CoV-2表面蛋白结合并介导病毒进入的受体。因此MPs能吸附SARS-CoV-2病毒，限制病毒在体内传播。携带病毒的微颗粒会被巨噬细胞高效地摄取并输送至溶酶体，进行降解，从而实现对新型冠状病毒肺炎的有效治疗。
在本申请中，术语“微颗粒”(Microparticle，MP)是指真核细胞在活化或凋亡时从细胞膜表面剥落下来的囊泡状结构，平均粒径在100至1000nm。微颗粒被认为是一种生物信息载体，介导了生物信息物质在不同类型细胞间的传递和交换。由于生物相容性高、免疫原性低、靶向性等特点可用做药物的载体，肿瘤细胞来源微颗粒负载抗肿瘤药物，具有良好的抗肿瘤效果，并已应用于临床。
在一些实施方案中，所述微颗粒制剂动物实验剂量为5×106/50μl，每日一次，给药5天。技术人员可以根据动物实验，确定人受试者的单位剂量。
附图说明
图1显示了ACE2在A549细胞来源的微颗粒MPs中表达，Western印记分析证明了ACE2在MPs中表达。
图2A和图2B显示了SARS-CoV-2能够被MPs吸附。在SARS-CoV-2和AMPs孵育后，溶液经过0.1Mp型过滤器过滤，实时PCR分析表明，孵育MPs中可以检测到病毒RNA，未孵育MPs检测不到病毒RNA(图2A)。免疫荧光染色进一步证实，表明病毒S蛋白与MPs上的ACE2结合(图2B)。
图3显示了MPs吸附病毒粒子并输送到肺泡巨噬细胞。肺泡巨噬细胞与吸附病毒的MPs的体外孵育表明，巨噬细胞能在10分钟内摄取含病毒的MPs，而分离的原代II型肺泡上皮细胞很难摄取MPs。
图4显示了MPs吸附的SARS-CoV-2病毒在肺泡巨噬细胞中被灭活。在SARS-CoV-2、SARS-CoV-2/MPs与肺泡巨噬细胞孵育0.5、1和4小时后，SARS-CoV-2可以在肺泡巨噬细胞中复制，与MPs结合的SARS-CoV-2在肺泡巨噬细胞中载量降低，探针1针对病毒正向序列以评估病毒分布(绿色)，探针2针对病毒负向序列以指示病毒复制(红色)(根据常规设计原则，技术人员能够自行设计探针)。
图5A显示共聚焦显微镜图像，标尺5μm。
图5B至图5D显示辐照后的A549-ACE2-OE细胞胆固醇25羟化酶明显上调，提取的微颗粒25羟基胆固醇含量明显升高。注：293T表示人肾上皮293细胞系(一种羟基化胆固醇含量低的细胞系)；293T-UV表示紫外照射1h后的293T细胞；A549-OE表示A549 ACE2过表达细胞；A549-OE-UV表示紫外照射1h后的A549 ACE2过表达细胞；293-MPs表示293T细胞来源的微颗粒；AO-MPs表示A549-ACE2过表达细胞来源的微颗粒。
图5E显示敲除胆固醇-25-羟化酶(简称为CH25H)，微颗粒上调内小体pH的作用消失。Ctrl表示仅PBS的组；SGCtrl表示加A549来源的对照微颗粒组；SG1表示加A549-CH25H敲除细胞来源的微颗粒组；SG2表示加A549-CH25H敲除细胞来源的微颗粒组。
图6A和图6B显示了MPs通过降低溶酶体的pH增强对SARS-CoV-2病毒降解。肺泡巨噬细胞经MPs处理后导致溶酶体pH降低(图6A)，MPs处理的巨噬细胞分离的溶酶体比从对照巨噬细胞分离的溶酶体更有效地灭活病毒(图6B)。
图7A至图7B显示了MPs体内治疗SARS-CoV-2病毒感染的效果。SARS-CoV-2感染小鼠5天后鼻腔注射MPs，连续5天，H&E染色显示治疗组小鼠支气管周围和血管周围炎性细胞浸润减少，肺组织病理损害减轻(图7A)。与形态学的改善相一致，RNA Scope显示肺中的病毒载量减少(图7B)。Ctrl：对照；Mock：PBS处理组。
图8A显示体外巨噬细胞摄取携带SARS-CoV-2的MPs与单纯摄取SARS-CoV-2相比，TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的水平。
图8B显示经MPs治疗的小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平。注：Ctrl：对照；Mock：PBS处理组。
具体实施方式
实施例中使用的各种细胞系、药物及实验动物：
小鼠巨噬细胞系Raw264.7、A549人肺腺癌细胞系购自中国典型物保藏中心CCTCC；
雌性ICR，hACE2转基因小鼠，6至8周龄，购自中国医学科学院医学实验动物中心(北京)，没有病毒感染的小鼠研究得到了中国医学科学院动物保护与利用委员会的批准。
实施例1.A549细胞来源的微颗粒MPs中表达ACE2
1.实验步骤
将人ACE2编码序列扩增并插入质粒pLV-EF1α-IRES-Puro中，在293T细胞中瞬时表达，获得含人ACE2基因的病毒。将含人ACE2的慢病毒转导到A549细胞中，然后用1μg/ml嘌呤霉素筛选得到高表达ACE2克隆的细胞，即A549-ACE2-OE。
为构建稳定敲除ACE2细胞系，针对数据库中公知的人ACE2基因序列，设计敲除用RNA。将RNA克隆到pSpCas9(BB)-2A-GFP载体质粒并转染细胞。48小时后，使用BDBiosciences FACSAria III进行流式细胞术对GFP阳性细胞进行分类。候选敲除细胞通过Western印记或免疫荧光验证，获得A549-ACE2-SG(敲除ACE2的A549细胞)。
A549、A549-ACE2-OE、A549-ACE2-SG各自使用300J/m2的紫外线照射1.5小时，18h小时后收集上清液。将上清液以1000×g离心10min去除细胞，然后以14000×g离心2min去除碎屑。然后，取上清液，以14000×g离心60min，4℃，制得各MPs颗粒。将MPs洗涤3次，悬浮于培养基中，进行后续实验。
A549细胞及各MPs分别在裂解缓冲液中裂解，超声处理。蛋白质浓度由BCA试剂盒测定。然后，在SDS-PAGE凝胶上运行该蛋白，并将其转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用5％牛血清白蛋白封闭，并用抗体检测过夜，检测MPs中ACE2的表达，A549细胞作为阳性对照。
2.实验结果
Western印记分析显示了MPs中ACE2表达，使用此方法获得的A549来源的微颗粒中存在ACE2(图1)。
实施例2.SARSCoV-2病毒能够被MPs所吸附
1.实验步骤
获自A549-ACE2-OE的MPs与SARSCoV-2病毒在37℃条件下孵育30min后，用0.1μm滤膜过滤。该过滤器可以选择性地允许病毒颗粒通过，但会阻止MPs通过。未孵育MPs的SARSCoV-2病毒作为对照组，同样经过滤膜过滤，用实时荧光定量PCR检测不同组滤膜上的病毒载量。
MPs(5×105)与重组SARS-CoV-2刺突蛋白(0.1μg)孵育，固定后用抗ACE2蛋白(红)和抗刺突蛋白(绿)抗体染色。用超高分辨率结构照明显微镜测定荧光，标尺2μm。
2.实验结果
在SARS-CoV-2和AMPs孵育后，Q-PCR分析表明，孵育MPs中可以检测到病毒RNA，未孵育MPs几乎检测不到病毒RNA(图2A)。免疫荧光染色结果证实，病毒S蛋白与MPs上的ACE2结合(图2B)。
实施例3.MPs吸附病毒粒子并输送到肺泡巨噬细胞
1.实验步骤：
从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离出原代肺泡巨噬细胞。小鼠在灌洗前立即麻醉，并解剖气管。用1ml PBS对肺进行5次灌洗，灌洗液在4℃下600×g离心5min，收集的细胞在RPMI1640完全培养基中悬浮，在培养板上培养2h，然后用PBS温和洗涤去除未贴壁细胞。
从hACE2小鼠中分离出原代肺泡上皮细胞，小鼠经右心室灌注10毫升冷PBS。用2ml消旋酶和低凝胶温度琼脂糖凝胶填充肺组织，然后将肺组织与2ml消旋酶在37℃下孵育20min。然后研磨肺组织，并用70和40μm尼龙网过滤浆液。细胞悬液用生物素标记的抗体及磁珠排除白细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞、内皮细胞和红系细胞。
分离ICR小鼠的原代肺泡巨噬细胞和原代肺泡上皮细胞，用PKH67标记的A-OE-MPs处理10min、30min及2h后，在共聚焦显微镜下获取图像，比例尺5μm。
2.实验结果：
肺泡巨噬细胞与吸附病毒的MPs的体外孵育表明，巨噬细胞能在10分钟内摄取含病毒的MPs，而分离的原代II型肺泡上皮细胞2小时也很难摄取MPs(图3)。
实施例4.MPs吸附的SARS-CoV-2病毒在肺泡巨噬细胞中被灭活
1.实验步骤：
MPs(5×105)与SARS-CoV-2(5×104TCID50)在37℃孵育30min，然后加入肺泡巨噬细胞处理30min，1h及4h。以SARS-CoV-2未孵育MPs作为对照组。细胞固定在4％多聚甲醛中，用过氧化氢在室温下孵育10min，使用RNAScope试剂盒进行RNA原位分析。探针1针对病毒正向序列以评估病毒分布(绿色)，探针2针对病毒负向序列以指示病毒复制(红色)，比例尺5μm(根据常规设计原则，技术人员能够自行设计探针1和探针2)。
2.实验结果：
在SARS-CoV-2、SARS-CoV-2/MPs与肺泡巨噬细胞孵育0.5、1和4小时后，单独SARS-CoV-2可以在肺泡巨噬细胞中复制，与MPs结合的SARS-CoV-2在肺泡巨噬细胞中载量降低(图4)。
实施例5.MPs通过增加内体pH阻止病毒逃匿
微颗粒提前处理巨噬细胞30min，然后加入pHrodoTM Red dextran标记10min，用共聚焦显微镜拍照。标尺5μm。
A549-ACE2-OE细胞铺于六孔板中(5x105)在经300J/m2的紫外线照射1小时，18h后收集RNA，进行qPCR检测CH25H的含量。同时利用该种方法提取微颗粒，利用质谱实验检测MPs中25-羟基胆固醇(25HC)的含量。利用CRISPR-Cas9系统将A549细胞CH25H敲除，再提取MPs，处理巨噬细胞30min，然后加入pHrodoTM Red dextran标记10min，用共聚焦显微镜拍照(图5A)。
结果显示：微颗粒可以使内小体的pH值升高阻碍病毒逃逸到胞质复制。在经微颗粒处理后，巨噬细胞内小体pH值升高。微颗粒携带的氧化型胆固醇影响内小体的pH。图5B、图5C、图5D显示辐照后的A549-ACE2-OE细胞胆固醇25羟化酶明显上调，且提取的微颗粒25羟基胆固醇含量也明显升高。图5E显示敲除CH25H，微颗粒上调内小体pH的作用消失。
实施例6.MPs通过降低溶酶体的pH增强对SARS-CoV-2病毒降解
1.实验步骤
肺泡巨噬细胞用获自A549-ACE2-OE的MPs预处理30min，以未用MPs处理的肺泡巨噬细胞作为对照组，用LysoSensorTM黄/蓝DND-160型染色，用微量平板阅读器检测pH值，溶酶体pH测量仪LysoSensorTM黄/蓝DND-160用于测定巨噬细胞溶酶体的pH，结果显示活细胞的pH依赖于双激发光谱。
溶酶体分离纯化，贴壁细胞经胰酶消化后用冰PBS洗涤。将细胞沉淀物重新悬浮，放入浆机中破碎。细胞匀浆以1000×g离心10min，上清液以20000×g离心20min，制成溶酶体颗粒和其他细胞器。通过建立密度梯度，并在SW50.1转子中以150，000×g的速度离心4h，最高(最低密度)的条带被移除并在PBS中稀释。溶酶体洗涤后，以20000×g离心20min分离纯化。
将MPs处理的巨噬细胞分离的溶酶体和对照巨噬细胞分离的溶酶体分别与SARS-CoV-2在37℃孵育30min后加入病毒E6感染48h。用抗NP抗体对细胞进行染色。比例尺5μm。
2.实验结果
肺泡巨噬细胞经MPs处理后导致溶酶体pH降低(图6A)，MPs处理的巨噬细胞分离的溶酶体比从对照巨噬细胞分离的溶酶体的病毒量更低(图6B)。
实施例7.MPs体内治疗SARS-CoV-2病毒感染的效果
1.实验步骤
用SARS-CoV-2(1×105TCID50)气管内感染hACE2小鼠，然后用对照组(PBS)或MPs(5×106)治疗。每日1次，连续5d(n＝5只/组)。治疗5d后处死小鼠，取肺组织固定进行HE染色。
肺组织固定后使用RNAScope试剂盒进行RNA原位分析，探针1针对病毒正向序列以评估病毒分布(绿色)，探针2针对病毒负向序列以指示病毒复制(红色)，比例尺5μm。
2.实验结果
H&E染色显示治疗组小鼠支气管周围和血管周围炎性细胞浸润减少，肺组织病理损害减轻(图7A)。与形态学的改善相一致，RNAScope显示肺中的病毒载量减少(图7B)。
实施例8.巨噬细胞在消灭MPs吸附的SARS-CoV-2时不引起炎症反应
巨噬细胞(1x105)加入SARS-CoV-2(1x105 TCID50)24h，用TRIZOL法提取RNA，qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。
气管内用SARS-CoV-2(1×105TCID50)感染hACE2小鼠，分为对照组(PBS)或MPs(5×106)治疗。每日1次，连续5天(n＝5只/组)。治疗5天后处死小鼠，TRIZOL法提取肺组织RNA，qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。
图8A显示体外巨噬细胞摄取携带SARS-CoV-2的MPs与单纯摄取SARS-CoV-2相比，TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平明显下降。图8B显示经MPs治疗的小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平明显下调。
综上，本申请的方案具有以下效果：
1.本申请提供的A549细胞来源的微颗粒(MPs)用于治疗新型冠状病毒感染，利用其吸附SARS-CoV-2病毒的特性，并增强肺泡巨噬细胞对新冠病毒的清除能力，是一种新型的非常规治疗策略。
2.病毒感染后，使用气管内注射MPs，微颗粒表面存在的ACE2可以与SARS-CoV-2表面S蛋白结合并吸附病毒颗粒，限制了病毒在体内进一步传播。携带病毒的微颗粒会被巨噬细胞高效地摄取并输送至溶酶体，MPs通过调节巨噬细胞溶酶体PH值增强清除SARS-CoV-2的能力，从而实现对新型冠状病毒肺炎的临床治疗，能够有效降低新冠患者的死亡率，有很好的临床应用前景。
3.本申请的微颗粒来源于细胞，具备生物相容性高、免疫原性低、靶向性等特点，因此安全性高、无毒副作用。
Claims (9)
1.一种肿瘤细胞来源的微颗粒，其包含凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，所述细胞囊泡在其表面表达刺突蛋白结合受体；
优选地，所述刺突蛋白是肺炎病毒刺突蛋白；
更优选地，所述肺炎病毒选自：SARS-CoV、SARS-CoV-2、或其变体；
最优选地，所述刺突蛋白结合受体是血管紧张素转换酶2(ACE2)或其结合片段；
所述肿瘤细胞是肺癌细胞或结肠癌细胞。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞来源的微颗粒，其中：
优选地，所述肺癌细胞选自：NCI-H196、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299、NCI-H1650、H1792、NCI-H3255、A427、A549、0225-02Sp、2F7、95-D、SPCA-1、LLC、Calu-1、Calu-3、L1022、PC9R、MSTO-211H、TKB-1；更优选，Calu-3、A549；
优选地，所述结肠癌细胞选自：HCT116、HCT116/FU、HCT-8/FU、LoVo、LoVo ADR、SW480、SW620、CaCo-2、RKO-E6、RKO-AS45-1、FET、HT55、HT115、HT-29、COLO 205、KM12、CL-40、KM12-SM、COLO320DM、NCI-H508、SW1417、COLO394、WiDr；更优选，Caco-2。
3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞来源的微颗粒，所述细胞囊泡的平均粒径为200nm至800nm，优选300nm、400nm、500nm、600nm、700nm。
4.一种制备肿瘤细胞来源的微颗粒的方法，包括步骤：
1)提供表达刺突蛋白结合受体的肿瘤细胞；
2)使步骤1)的所述肿瘤细胞凋亡；
优选地，通过选自以下任一项的方式使步骤1)的所述肿瘤细胞凋亡：紫外线照射、X射线照射、化疗药物；
3)收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡；优选地，通过离心收集凋亡的肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，所述细胞囊泡的平均粒径为200nm至800nm，优选300nm、400nm、500nm、600nm、700nm。
5.根据权利要求4所述的方法，其中：
所述刺突蛋白是肺炎病毒刺突蛋白；
所述肺炎病毒选自：SARS-CoV、SARS-CoV-2、或其变体；
优选地，所述刺突蛋白结合受体是ACE2或其结合片段；
所述肿瘤细胞选自：肺癌细胞、结肠癌细胞；
所述肺癌细胞选自：NCI-H196、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299、NCI-H1650、H1792、NCI-H3255、A427、A549、0225-02Sp、2F7、95-D、SPCA-1、LLC、Calu-1、Calu-3、L1022、PC9R、MSTO-211H、TKB-1；更优选，Calu-3、A549；
优选地，所述结肠癌细胞选自：HCT116、HCT116/FU、HCT-8/FU、LoVo、LoVo ADR、SW480、SW620、CaCo-2、RKO-E6、RKO-AS45-1、FET、HT55、HT115、HT-29、COLO 205、KM12、CL-40、KM12-SM、COLO320DM、NCI-H508、SW1417、COLO394、WiDr；更优选，Caco-2。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤3)中，通过以下方式收集细胞囊泡，包括步骤：
在2至8C°，以800至1000g对步骤2)所得凋亡的肿瘤细胞离心5至15分钟，以去除完整细胞，得到第一产物；
在2至8C°，以12000至15000g对第一产物离心1至3分钟，以去除细胞碎片，得到第二产物；
在2至8C°，以12000至15000g对第二产物离心40至80分钟，以收集释放的细胞囊泡。
7.一种肿瘤细胞来源的微颗粒，其是通过权利要求4至6中任一项所述的方法制备所得。
8.权利要求1-3和7中任一项所述肿瘤细胞来源的微颗粒在制备药物中的用途，所述药物用于治疗病毒性肺炎；
所述病毒选自：SARS-CoV、SARS-CoV-2、或其变体。
9.一种药物组合物，其包含：
可药用载体；和
权利要求1-3和7中任一项所述肿瘤细胞来源的微颗粒；
所述药物组合物制备成肺施用的剂型。
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