CN115335394A

CN115335394A - 纯化方法

Info

Publication number: CN115335394A
Application number: CN202180023220.4A
Authority: CN
Inventors: B·麦克尼尔·阿尔; R·P·V·萨拉斯沃蒂; M·J·彼特
Original assignee: Alkermes Inc
Current assignee: Alkermes Inc
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2022-11-11
Also published as: EP4093755A1; WO2021150674A1; IL294901A; EP4093755A4; MX2022009134A; KR20220143676A; TW202140512A; AU2021210905A1; BR112022014567A2; JP2023511946A; US20210253631A1; CA3165442A1

Abstract

本文提供了纯化多肽的方法，所述多肽包含与IL‑2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素‑2(IL‑2)。

Description

纯化方法

相关申请

本申请要求于2020年1月24日提交的美国临时申请第62/965,578号的权益，其全部公开内容通过引入并入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其通过引用以整体并入本文(于2021年1月20日创建的所述ASCII副本，命名为“ALW-028_ST25”，大小为3,713字节)。

技术领域

本公开涉及纯化包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2)的多肽的方法。

背景技术

包含与IL-2Rα链白介素-2(IL-2)白介素-2受体α(IL-2Rα)的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2)的多肽极有希望成为抗癌剂。这些多肽保留了通过在记忆CD8+T细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达的中等亲和力IL-2R复合体进行信号传导的全部能力，但是在空间上阻止了与在CD4+FOXP3+调节性T细胞(CD4+Treg)和内皮细胞上优先表达的高亲和力IL-2R复合体的结合。作为这种选择性IL-2R结合的结果，融合蛋白选择性激活CD8+T细胞和NK细胞，从而促进肿瘤细胞杀伤。不能激活内皮细胞上的高亲和力IL-2R还可能降低由于毛细血管渗漏综合征(一种已知的IL-2治疗方法的风险)引起的毒性风险。

为了用作治疗剂，上述多肽必须首先与制备过程中存在的其它生物分子污染物分离。因此，本领域需要纯化这些多肽的方法。

发明内容

本公开提供了纯化包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2的多肽的方法。

因此，在一个方面，本公开提供纯化包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2的多肽的方法，所述方法包括：a.在使得所述多肽结合第一基质的条件下，使包含所述多肽和宿主细胞蛋白(HCP)的澄清的细胞上清液与第一色谱基基质接触，并从所述基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；b.将来自步骤(a)的第一洗出液的pH调节至至少10.5且至多14.0(例如，约10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9或14.0)以产生经pH调节的洗出液；和c.使来自步骤(b)的经pH调节的洗出液与第二色谱基质接触，以使得所述多肽与所述基质结合，并从所述基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中，从而纯化所述多肽。

在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一色谱基质包含阴离子交换色谱(AEX)基质。

在某些实施方案中，在与AEX基质接触之前，澄清的细胞上清液被缓冲液交换到具有约1-2mS/cm的电导率且pH为约8.0-8.5的溶液中。

在某些实施方案中，AEX基质包含季胺基团。

在某些实施方案中，AEX基质包含与季胺基团官能化连接的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

在某些实施方案中，珠的平均直径为约75μm。在某些实施方案中，珠的平均孔径为约100nm。

在某些实施方案中，以相当于约15至约25mS/cm的电导率的盐浓度从AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，以相当于约20至约25mS/cm的电导率的盐浓度从AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，以相当于约15mS/cm、约16mS/cm、约17mS/cm、约18mS/cm、约19mS/cm、约20mS/cm、约21mS/cm、约22mS/cm、约23mS/cm、约24mS/cm、约25mS/cm的电导率的盐浓度从AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，在约pH 8.4-8.6下使用约0.20-0.25M氯化钠溶液从AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用碳酸钠和/或氢氧化钠调节(例如，增加)第一洗出液的pH。

在某些实施方案中，使用碳酸钠或氢氧化钠以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg第一洗出液的比例调节(例如，增加)第一洗出液的pH。

在某些实施方案中，经pH调节的洗出液的pH保持在10.5或高于10.5但低于12.0(例如，在10.7或高于10.7但低于11.0(例如，约10.7、10.8或10.9))至少30分钟(例如，至少1小时)。

在某些实施方案中，经pH调节的洗出液的pH保持在10.5或高于10.5但低于12.0(例如，在10.7或高于10.7但低于11.0(例如，约10.7、10.8或10.9)至少30分钟(例如，至少1小时)，其中pH在10.5或高于10.5但低于12.0(例如，在10.7或高于10.7但低于11.0(例如，约10.7、10.8或10.9)通过以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg第一洗出液的比例添加碳酸钠或氢氧化钠来实现。

在某些实施方案中，方法还包括通过添加柠檬酸降低经pH调节的洗出液的pH(例如，在使经pH调节的洗出液与第二色谱基质接触之前)。

在某些实施方案中，方法还包括将经pH调节的洗出液的pH降低至约pH 8.3-8.7(例如，在使经pH调节的洗出液与第二色谱基质接触之前)。

在某些实施方案中，在与第二色谱基质接触之前，经pH调节的洗出液的电导率被改变为约130至约160mS/cm，并且pH被改变为约8.5±0.2。

在某些实施方案中，在与第二色谱基质接触之前，经pH调节的洗出液的电导率被改变为约130mS/cm、约131mS/cm、约132mS/cm、约133mS/cm、约134mS/cm、约135mS/cm、约136mS/cm、约137mS/cm、约138mS/cm、约139mS/cm、约140mS/cm、约141mS/cm、约142mS/cm、约143mS/cm、约144mS/cm、约145mS/cm、约146mS/cm、约147mS/cm、约148mS/cm、约149mS/cm、约150mS/cm、约151mS/cm、约152mS/cm、约153mS/cm、约154mS/cm、约155mS/cm、约156mS/cm、约157mS/cm、约158mS/cm、约159mS/cm、约160mS/cm，并且pH被改变为约8.5±0.2。

在某些实施方案中，在与第二色谱基质接触之前，经pH调节的洗出液的电导率被改变为约134至约160mS/cm，并且pH被改变为约8.5±0.2。

在某些实施方案中，在与第二色谱基质接触之前，经pH调节的洗出液的电导率被改变为约155至约160mS/cm，并且pH被改变为约8.5±0.2。

在某些实施方案中，使用硫酸铵改变经pH调节的洗出液的电导率。

在某些实施方案中，第二色谱基质包含疏水作用色谱(HIC)基质。

在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，经pH调节的洗出液被改变为包含约1-1.2M硫酸铵。

在某些实施方案中，HIC基质包含聚丙二醇基团。

在某些实施方案中，HIC基质包含与聚丙二醇基团连接的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

在某些实施方案中，珠的平均直径为约40至约90μm。

在某些实施方案中，珠的平均孔径为约75nm。

在某些实施方案中，使用相当于约100至约140mS/cm的电导率的盐浓度从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用相当于约125至约140mS/cm的电导率的盐浓度从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用降低盐浓度的连续多步梯度从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，在pH 8.5±0.2下使用包含约0.85至约0.95M硫酸铵的缓冲液从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，通过0.2μm过滤器过滤经pH调节的洗出液。

在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，对经pH调节的洗出液进行病毒灭活。

在某些实施方案中，病毒灭活通过经pH调节的洗出液与磷酸三正丁酯和聚山梨酯20的混合实现。

在某些实施方案中，使用混合模式色谱(MMC)从第二洗出液中进一步纯化多肽。

在某些实施方案中，使用MMC然后使用AEX从第二洗出液中进一步纯化多肽。

在某些实施方案中，澄清的细胞上清液来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。

在某些实施方案中，第二洗出液中多肽是至少90％的纯度。在某些实施方案中，多肽的纯度通过反相(RP)HPLC测定。

在另一个方面，本公开提供了用于降低含有多肽的澄清细胞上清液中宿主细胞蛋白(HCP)含量的方法，所述多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，所述方法包括在使多肽与AEX基质结合的条件下使部分纯化的多肽与AEX基质接触，并在梯度洗脱条件下从所述AEX基质选择性洗脱所述多肽，从而降低所述多肽中HCP含量。

在某些实施方案中，多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在某些实施方案中，方法还包括使包含多肽和HCP的澄清的细胞上清液与一种或多种色谱树脂接触以获得部分纯化的多肽。

在某些实施方案中，在使部分纯化的多肽与AEX基质接触之前，HCP含量为≥约300ppm。在某些实施方案中，在使部分纯化的多肽与AEX基质接触之前，HCP含量为≥约150ppm。

在某些实施方案中，在梯度洗脱条件下，在从AEX基质洗脱多肽后，HCP含量为≤约100ppm。在某些实施方案中，在梯度洗脱条件下，在从AEX基质洗脱多肽后，HCP含量为≤约50ppm。在某些实施方案中，在梯度洗脱条件下，在从AEX基质洗脱多肽后，HCP含量为≤约25ppm。

在某些实施方案中，梯度洗脱条件包括以下的一项或多项：随时间增加洗脱缓冲液的电导率；随时间增加洗脱缓冲液的盐浓度；或随时间降低洗脱缓冲液的pH。

在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率从约≤5mS/cm增加至约≥15mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥15mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥20mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率增加至约15mS/cm至约100mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率增加至约20mS/cm至约50mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液具有约20mS/cm至约50mS/cm的最终电导率。在某些实施方案中，洗脱缓冲液最初包含约≤5mS/cm的电导率。在某些实施方案中，洗脱缓冲液最初包含约≤2mS/cm的电导率。

在某些实施方案中，洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约1.5M盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约1.0M盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约0.5M盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含约0.2M盐至约1.0M盐的最终盐浓度。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含约0.2M盐的最终盐浓度。在某些实施方案中，盐包括氯化钠。

在某些实施方案中，洗脱缓冲液还具有约7.0至约9.0的pH。在某些实施方案中，洗脱缓冲液还具有约8.0的pH。

在某些实施方案中，获得部分纯化的多肽的一种或多种色谱树脂选自由AEX、HIC和MMC组成的组。

在某些实施方案中，获得部分纯化的多肽包含以下步骤：a1)在使得所述多肽结合第一AEX基质的条件下，使包含多肽和HCP的澄清的细胞上清液与第一AEX基质接触，并且从所述AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；a2)使来自步骤(a1)的第一洗出液与HIC基质接触，以使得所述多肽与所述HIC基质结合，并从所述HIC基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中；和a3)将步骤(a2)的第二洗出液与MMC基质接触，使得多肽与MMC基质结合，并从所述MMC基质选择性洗脱所述多肽到第三洗出液中，从而获得所述部分纯化的多肽。

在某些实施方案中，在与第一AEX基质接触之前，澄清的细胞上清液被缓冲液交换到具有约1-2mS/cm的电导率且pH为约8.0-8.5的溶液中。

在某些实施方案中，第一AEX基质包含季胺基团。在某些实施方案中，第一AEX基质包含用季胺基团官能化的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。在某些实施方案中，珠的平均直径为约75μm。在某些实施方案中，珠的平均孔径为约100nm。

在某些实施方案中，使用盐浓度相当于电导率约15至约25mS/cm的溶液从第一AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用盐浓度相当于电导率约20至约25mS/cm的溶液从第一AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，在约pH 8.4-8.6下使用约0.20-0.25M氯化钠水溶液从第一AEX基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用碳酸钠和/或氢氧化钠调节(例如，增加)第一洗出液的pH以产生经pH调节的第一洗出液。

在某些实施方案中，经pH调节的洗出液的pH保持在10.5或高于10.5但低于12.0(例如，在10.7或高于10.7但低于11.0(例如，约10.7、10.8或10.9)至少30分钟(例如，至少1小时)，其中在10.5或高于10.5但低于12.0(例如，在10.7或高于10.7但低于11.0(例如，约10.7、10.8或10.9)的pH通过以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg第一洗出液的比例添加碳酸钠或氢氧化钠来实现。

在某些实施方案中，方法进一步包括通过添加柠檬酸降低经pH调节的第一洗出液的pH。在某些实施方案中，方法还包括将经pH调节的第一洗出液的pH降低至约pH 8.3-8.7。

在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，经pH调节的第一洗出液的电导率被改变为约155mS/cm至约160mS/cm，并且pH被改变为约8.5±0.2。

在某些实施方案中，使用硫酸铵改变经pH调节的第一洗出液的电导率。在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，经pH调节的第一洗出液被改变为包含约1-1.2M硫酸铵。

在某些实施方案中，HIC基质包含聚丙二醇基团。在某些实施方案中，HIC基质包含与聚丙二醇基团连接的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。在某些实施方案中，珠的平均直径为约40至约90μm。在某些实施方案中，珠的平均孔径为约75nm。

在某些实施方案中，使用具有盐浓度相当于电导率约100至约140mS/cm的溶液从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，使用具有盐浓度相当于电导率约125至约140mS/cm的溶液从HIC基质洗脱多肽。

在某些实施方案中，在与HIC基质接触之前，对经pH调节的第一洗出液进行病毒灭活。

在一个方面，本公开提供了用于降低含有多肽的澄清的细胞上清液中宿主细胞蛋白(HCP)含量的方法，所述多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2的多肽，所述方法包括以下步骤：在使得所述多肽结合第一AEX基质的条件下，使包含所述多肽和HCP的澄清的细胞上清液与第一AEX基质接触，并从所述第一AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；使所述第一洗出液与HIC基质接触，以使所述多肽与所述HIC基质结合，并从所述HIC基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中；使所述第二洗出液与MMC基质接触，使得所述多肽与所述MMC基质结合，并从所述MMC基质选择性洗脱所述多肽到第三洗出液中；以及使所述第三洗出液与所述第二AEX基质在使得所述多肽与所述第二AEX基质结合的条件下接触，并在梯度洗脱条件下从所述第二AEX基质选择性洗脱所述多肽，从而降低所述多肽中HCP含量，其中在步骤(d)之后所述HCP含量为≤约50ppm。

在某些实施方案中，不使用亲和纯化步骤。

在一个方面，本公开提供了包含多肽的组合物，所述多肽含有与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，其中所述组合物的HCP含量包含≤约100ppm。

在某些实施方案中，组合物的HCP含量包括≤约50ppm。

在某些实施方案中，组合物通过上述方法制备。

在一个方面，本公开提供了提高包含多种多肽的组合物的血清半衰期的方法，所述多种多肽中的每种多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，所述方法包括以下步骤：在使得所述多肽结合第一AEX基质的条件下，使包含所述多肽的澄清的细胞上清液与第一AEX基质接触，并从所述第一AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；使所述第一洗出液与HIC基质接触，使得所述多肽与所述HIC基质结合，并从所述HIC基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中；使所述第二洗出液与MMC基质接触，使得所述多肽与所述MMC基质结合，并从所述MMC基质选择性洗脱所述多肽到第三洗出液中；以及在使得所述多肽与所述第二AEX基质结合的条件下，使所述第三洗出液与第二AEX基质接触，并从所述第二AEX选择性洗脱所述多肽，从而改善所述组合物的血清半衰期。

在某些实施方案中，方法还包括在步骤(b)的使第一洗出液与HIC基质接触之前，将来自步骤(a)的第一洗出液的pH调节至至少10.5且至多11.5。

在一个方面，本公开提供了一种包含多种多肽的组合物，所述多种多肽中的每种多肽包含连接至一种或多种多糖种类的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述一种或多种多糖种类在SEQ ID NO:1N187、N206和T212中的一个或多个的氨基酸位置连接至所述多肽。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类选自由以下组成的组：Hex5HexNAc4FucNeuAc2；Hex6HexNAc5FucNeuAc2；Hex5HexNAc4FucNeuAc；Hex6HexNAc5FucNeuAc3；Hex4HexNAc4FucNeuAc；Hex5HexNAc5NeuAc2；Hex5HexNAc4Fuc；Hex3HexNAc4Fuc；Hex4HexNAc4Fuc；Hex6HexNAc5Fuc；和Hex5HexNAc5Fuc；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类选自由以下组成的组：Hex6HexNAc5FucNeuAc3；Hex5HexNAc4FucNeuAc2；Hex6HexNAc5FucNeuAc2；Hex7HexNAc6FucNeuAc3；Hex6HexNAc5FucNeuAc；Hex5HexNAc4FucNeuAc；Hex5HexNAc4Fuc；和Hex4HexNAc4Fuc；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类选自由以下组成的组：HexHexNAc；HexHexNAcNeuAc；和HexHexNAcNeuAc2；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类的总百分比包括：约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；和约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类的总百分比包括：约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；约0.5％至约1.5％的Hex4HexNAc4FucNeuAc；约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2；约0％至约0.5％的Hex5HexNAc4Fuc；约0％至约0.5％的Hex3HexNAc4Fuc；约0％至约0.5％的Hex4HexNAc4Fuc；约0％至约0.5％的Hex6HexNAc5Fuc；和约0％至约0.5％的Hex5HexNAc5Fuc；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类的总百分比包括：约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc；并且其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类的总百分比包含：约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；约0.5％至约1.5％的Hex7HexNAc6FucNeuAc3；约0％至约1％的Hex6HexNAc5FucNeuAc；约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc；和约0.5％至约2％的Hex4HexNAc4Fuc；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类的总百分比包括：约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc；和约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类的总百分比包括：约0％至约1％的HexHexNAc；约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc；和约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2；其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在一个方面，本公开提供了一种包含多种多肽的组合物，所述多种多肽中的每种多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，其中所述组合物包含如图15所示的毛细管等电聚焦(cIEF)曲线。

在某些实施方案中，组合物在约pI 5.73、约pI 5.93、约pI 6.09、约pI 6.28、约pI6.38、约pI 6.48、约pI 6.53、约pI 6.66、约pI 6.82和约pI 7.02中的一个或多个处包含cIEF曲线峰。

在某些实施方案中，组合物包含以下的峰面积百分比：在pI 5.93处约8％至约12％；在pI 6.09处约18％至约26％；在pI 6.38处约22％至约26％；以及在pI 6.66处约18％至约28％。

在某些实施方案中，组合物包含以下的峰面积百分比：在pI 5.73处约1.5％至约2.5％；在pI 5.93处约8％至约12％；在pI 6.09处约18％至约26％；在pI 6.28处约3.5％至约4.5％；在pI 6.38处约22％至约26％；在pI 6.48处约3％至约5％；在pI 6.53处约4％至约6％；在pI 6.66处约18％至约28％；在pI 6.82处约2％至约6％；以及在pI 7.02处约0％至约3％。

在某些实施方案中，在约pI 5.73处的峰包括在约pI 5.70和约pI 5.76处的峰的组合。在某些实施方案中，在约pI 5.93处的峰包括在约pI 5.89和约pI 5.97处的峰的组合。

在某些实施方案中，组合物通过上述方法制备。

附图说明

图1描绘了多肽A的工艺流程图。

图2描绘了特定天数时从生物反应器中取出的样品在还原和非还原条件下的SDS-PAGE凝胶。

图3A-图3C描绘了AEX I纯化步骤后多肽A的稳定性和活性。在5或25℃下将AEX I池样品孵育1、7或10天后，通过SDS-PAGE(图3A)和尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)(图3B)测量稳定性。通过细胞水平测定和pSTAT5 ELISA以剂量响应曲线测量活性(图3C)。

图4描绘了本文公开的升高的pH保持步骤和在升高的pH保持之前和之后样品的反相(RP)HPLC描记图。

图5描绘了本文测试的4种HIC树脂的疏水作用色谱(HIC)洗脱曲线。所测试的树脂是丁基-650M、苯基-650M、己基-650C和PPG-600M。

图6A-图6C描绘了HIC纯化步骤后多肽A的稳定性和活性。在5或25℃下将HIC池样品孵育1、7或10天后，通过SDS-PAGE(图6A)和SE-HPLC(图6B)测量稳定性。通过细胞水平测定和pSTAT5ELISA以剂量响应曲线测量活性(图6C)。

图7A-图7C描绘了MMC纯化步骤后多肽A的稳定性和活性。在5或25℃下将HIC池样品孵育1、6或11天后，通过SDS-PAGE测量稳定性(图7A)。在2-8℃下4个月后又通过SE-HPLC测量稳定性(图7B)。通过细胞水平测定和pSTAT5 ELISA以剂量响应曲线测量活性(图7C)。

图8描绘了在-80℃、2-8℃和环境温度下保持的AEX II池样品在还原和非还原条件下的SDS-PAGE凝胶。

图9描绘了两种纯化方案，其中在AEX I步骤之前和AEX I步骤之后采用升高的pH保持。

图10描绘了在收获材料经受升高的pH保持之后，AEX I样品的反相-HPLC(RP-HPLC)描记图。

图11描绘了在收获材料经受升高的pH保持之后，HIC样品的RP-HPLC描记图。

图12描绘了在升高的pH保持之后AEX I样品的RP-HPLC描记图。

图13描绘了在AEX I池样品的升高的pH保持之后HIC样品的RP-HPLC描记图。

图14描绘了小鼠体内多肽A随时间(小时)的血清浓度(nM)。比较了三个不同批次的纯化多肽A的药代动力学。三个批次中的一个用唾液酸酶处理(三角形)，而另外两个批次不用唾液酸酶处理(圆形和正方形)。

图15描绘了三个不同批次的纯化多肽A的毛细管等电聚焦(cIEF)曲线。

具体实施方式

本文提供了纯化多肽的方法，所述多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2)。

选定定义

除非本文另有定义，本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，“或”的使用是指“和/或”。术语“包括”以及如“包含”和“含有”等其它形式的使用是非限制性的。

如本文所用，术语“环状排列(circular permutation)”和“环状排列的”是指获取线性蛋白质或其同源核酸序列并融合天然N-和C-末端(直接或通过接头，使用蛋白质或重组DNA方法)以形成环状分子，然后在不同位置切割(打开)环状分子以形成具有与原始分子末端不同的末端的新线性蛋白质或同源核酸分子的过程。由此，环状排列保留了蛋白质的序列、结构和功能，同时在不同位置产生新的C-和N-末端，与原始分子相比，这导致融合所需多肽融合配偶体的取向改善。

如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在其使用的上下文中将在一定程度上变化。如本文所用，当提及可测量的值，例如数量、持续时间等，术语“约”旨在涵盖与指定值相差±20％或±10％(包括±5％、±1％和±0.1％)的变化，此类变化同样适合于实施所公开的方法。

纯化方法

在一个方面，本公开提供了纯化包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2)的多肽的方法。相对于高亲和力IL-2R复合体(包括IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ)，此类多肽表现出与包含IL-2Rβ和共同γ链(IL-2Rγ)的中间亲和力IL-2R复合体的优先结合，并且表现为中间亲和力IL-2R复合体的选择性激动剂。在美国专利号9,359,415中描述了这种类型的示例性多肽的设计和生成，上述专利通过引用以整体并入本文。

示例性的多肽如以下SEQ ID NO:1所示：

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE

FLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN

GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPL

EEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTM

LNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSA

TRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHC

REPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPA

ESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG(SEQ ID NO:1)

因此，在某些实施方案中，多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

本领域技术人员将理解SEQ ID NO:1的氨基酸序列变体也可用于本文公开的组合物中。例如，在某些实施方案中，多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98或99％)同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成。

本领域技术人员还将理解，本文公开的组合物中应用的多肽的氨基酸序列可以是衍生的或修饰的，例如，聚乙二醇化的、酰胺化的等。

在某些实施方案中，本文所述的纯化方法去除或减少杂质的量。在某些实施方案中，杂质是宿主细胞蛋白。如本文所用，术语“宿主细胞蛋白”(HCP)是指来源于宿主细胞(例如，用于产生多肽的宿主细胞)的非多肽蛋白质杂质。在某些实施方案中，HCP可以是衍生自CHO细胞的HCP。在某些实施方案中，多肽(包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2))的组合物的HCP含量可大于或等于约150ppm、约200ppm、约250ppm、约300ppm、约350ppm、约400ppm、约450ppm、约500ppm、约1000ppm、约1500ppm、约2000ppm、约2500ppm或约3000ppm。HCP含量也可以用ng/mL为单位描述。在某些实施方案中，“部分纯化的”多肽是作为包含大于或等于约150ppm的HCP含量的组合物的一部分的多肽，其已经预先经受过一种或多种纯化技术。部分纯化的多肽可经受进一步的纯化技术以进一步降低HCP含量。在某些实施方案中，HCP含量被降低至小于或等于约100ppm、约75ppm、约50ppm或约25ppm。

在某些实施方案中，杂质是宿主细胞核酸。如本文所用，术语“宿主细胞核酸”是指来源于宿主细胞的核酸，例如用于产生本文公开的多肽的宿主细胞。

在特定的实施方案中，杂质是产物相关物质。如本文所用，术语“产物相关物质”是指在多肽的制备和/或储存期间形成的本文公开的多肽的变体。产物相关物质的具体示例包括多肽的降解物、多肽的截短形式、高分子量种类、低分子量种类、多肽的片段、多肽的修饰形式(包括脱酰胺化、异构化、错配的二硫化物连接的、氧化的或改变的缀合物形式(例如，糖基化、磷酸化))、聚集体(包括多肽的二聚体和多聚体)和电荷变体。在特定的实施方案中，杂质是多肽的聚集体。如本文所用，术语“聚集体”是指多肽的两个或更多个单个分子的团聚或寡聚以形成例如二聚体、三聚体、四聚体、寡聚体和其它高分子量种类。聚集体可以是可溶的或不可溶的。在特定的实施方案中，聚集体是本文公开的多肽的多聚体。在特定的实施方案中，聚集体是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多聚体。

在某些实施方案中，包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的白介素-2(IL-2)的多肽的组合物可以被纯化为具有大于或等于约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的纯度。在某些实施方案中，通过反相(RP)HPLC测定纯度。

离子交换色谱(IEX)

在某些实施方案中，通过离子交换色谱(IEX)纯化包含本文公开的多肽的样品。另外地或可选地，可以对通过本公开的方法产生的洗涤和/或流通级分进行离子交换色谱以进一步纯化多肽。在某些实施方案中，进行一个或多个离子交换色谱步骤以纯化多肽。在某些实施方案中，在疏水作用色谱(HIC)纯化步骤之前进行一个或多个离子交换色谱步骤。在某些实施方案中，在HIC纯化步骤之后进行一个或多个离子交换色谱步骤。

如本文所用，离子交换分离包括两种物质基于它们各自的离子电荷的差异而被分离的任何方法，无论是在多肽和/或色谱材料整体上或是在多肽和/或色谱材料的特定区域上局部分离，并由此可以使用阳离子交换(CEX)材料或阴离子交换(AEX)材料。

阳离子交换材料或者阴离子交换材料的使用是基于给定溶液中多肽的局部电荷。因此，采用阴离子交换步骤或阳离子交换步骤在本公开的范围内。此外，在任何其它色谱步骤(例如，HIC步骤或MMC步骤)之前或之后仅使用阳离子交换步骤、仅使用阴离子交换步骤或两者的任何连续组合也在本公开的范围内。

在进行分离时，含有本文公开的多肽(例如，与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2)的样品可通过使用多种技术中的任何一种(例如，使用分批纯化技术或色谱技术)与离子交换材料接触。此外，含有多肽的样品可以结合-洗脱模式与离子交换材料接触，其中所述多肽与离子交换树脂结合，允许杂质流过树脂或比多肽更弱地结合树脂。可以进行洗涤步骤以去除或减少与离子交换树脂弱结合的杂质。可以进行随后的洗脱步骤以从离子交换树脂中去除多肽(作为洗出液或池的一部分)。洗出液或池可以由多个级分组成或来自一个大洗出液。或者，可以使含有多肽的样品与离子交换材料以流通模式接触，其中所述多肽不结合或弱结合离子交换树脂，以允许杂质结合树脂或比多肽更强地结合树脂。洗涤或洗脱步骤可以不以流通模式进行。

离子交换色谱是基于目标多肽的局部电荷与色谱材料的局部电荷之间的差异来分离分子的。填充的离子交换色谱柱或离子交换膜装置可以结合-洗脱模式、流通或混合模式操作。在用平衡缓冲液或具有不同pH和/或电导率的另一种缓冲液洗涤柱或膜装置之后，通过增加洗脱缓冲液的离子强度(即，电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现产物回收。改变pH并由此改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。然后在下一次使用之前再生该柱。

在某些实施方案中，梯度洗脱条件包括以下的一个或多个：随时间增加洗脱缓冲液的电导率；随时间增加洗脱缓冲液的盐浓度；或随时间降低洗脱缓冲液的pH。在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有小于或等于约5mS/cm的初始电导率。在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有约5mS/cm、约4mS/cm、约3mS/cm、约2mS/cm、约1mS/cm或约0mS/cm的初始电导率。在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有大于或等于约15mS/cm的最终电导率。在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有约15mS/cm、约16mS/cm、约17mS/cm、约18mS/cm、约19mS/cm、约20mS/cm、约30mS/cm、约40mS/cm、约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm、约90mS/cm或约100mS/cm的最终电导率。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥15mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥20mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率增加至约15mS/cm至约100mS/cm。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率增加至约20mS/cm至约50mS/cm。

在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有约0M盐、约0.01M盐、约0.02M盐、约0.03M盐、约0.04M盐或约0.05M盐的初始盐浓度。在某些实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有约0.15M盐、约0.20M盐、约0.25M盐、约0.30M盐、约0.35M盐、约0.40M盐、约0.45M盐或约0.50M盐的最终盐浓度。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约1.0M盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约0.5M盐。

在某些实施方案中，盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙。在某些实施方案中，盐包含氯化钠。

阴离子或阳离子取代基可连接至基质上，以形成用于色谱的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代基的非限制性示例包括二乙氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)和磺酸根(S)。纤维素离子交换介质例如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可获取自WhatmanLtd.Maidstone,Kent,U.K。基于SEPHADEX和-locross-linked的离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX和DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSE以及SEPHAROSE、FastFlow和Capto S均可获取自GE Healthcare。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物(例如，TOYOPEARL、DEAE-650S或M和TOYOPEARL CM-650S或M)可获取自Toso Haas Co.,Philadelphia,Pa.或来自BioRad,Hercules,Calif的Nuvia S和UNOSphere S、来自EMDMillipore,Billerica,Calif的Eshmuno S。此外，TOYOPEARL GigaCap Q-650M可获取自Tosoh Biosciences。

高pH重折叠

在某些实施方案中，本文所述的方法包括升高的pH保持步骤，例如，在初始IEX(例如，AEX或CEX)纯化步骤之后且在另外的纯化步骤(例如，HIC纯化步骤)之前。不受任何理论的束缚，据信，在某些实施方案中，该升高的pH保持步骤促进多肽的重折叠并降低产物相关物质杂质的水平。在某些实施方案中，通过将含有多肽的样品的pH调节至约10.0至约12.0来进行升高的pH保持步骤。在某些实施方案中，将pH调节至约10.0、约10.1、约10.2、约10.3、约10.4、约10.5、约10.6、约10.7、约10.8、约10.9、约11.0、约11.1、约11.2、约11.3、约11.4、约11.5、约11.6、约11.7、约11.8、约11.9或约12.0。在某些实施方案中，将pH调节至≥10.7。在某些实施方案中，将pH调节至约10.8。

在某些实施方案中，通过添加碱或碱性缓冲液(例如碳酸钠和/或氢氧化钠)调节pH。技术人员将容易地理解调节pH的适当方式。

在某些实施方案中，包含本文公开的多肽的样品保持在升高的pH(例如，约10.8的pH)，持续一个孵育期。孵育期可以是例如约30分钟至约3小时。孵育期可为约30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、135分钟、150分钟、165分钟或180分钟。在某些实施方案中，孵育时间可以是约或至少60分钟。在某些实施方案中，包含本文公开的多肽的样品保持在升高的pH(例如，约10.8的pH)，持续一个孵育期，同时混合样品。

在升高的pH下将样品孵育合适的时间后，可以通过添加酸(包括但不限于柠檬酸)降低样品的pH。在某些实施方案中，样品的pH被降低至约8.0至约9.0的pH。在某些实施方案中，样品的pH被降低至约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的pH。在某些实施方案中，样品的pH被降低至约8.5。本领域技术人员将容易地理解调节样品的pH以降低pH的适当方式。

疏水作用色谱(HIC)

在某些实施方案中，对包含本文公开的多肽的样品进行疏水作用色谱(HIC)以纯化多肽。另外地或可选地，可以对通过本公开的方法产生的洗涤和/或流通级分进行HIC以进一步纯化多肽。在某些实施方案中，进行一个或多个HIC步骤以纯化多肽。在某些实施方案中，在HIC纯化步骤之前进行一个或多个离子交换色谱步骤。在某些实施方案中，在HIC纯化步骤之后进行一个或多个离子交换色谱步骤。

多肽的HIC纯化包括多肽的可逆结合和一种或多种杂质通过与附着于固体基质支持物(例如，琼脂糖)的疏水部分的疏水相互作用的结合。分子之间的疏水相互作用是由极性环境排除非极性(即，疏水性)分子的倾向导致的。HIC依赖于这一分子疏水性原理(即，给定蛋白质吸附结合至疏水性吸附剂主体上的疏水性位点的倾向)，基于生物分子与疏水部分的相互作用的相对强度来分离生物分子(参见，例如，美国专利第4,000,098号和美国专利第3,917,527号)。这种分离技术的优点是它的非变性特性以及加载、洗涤和/或洗脱期间使用的盐溶液的稳定化效果。

疏水作用色谱利用分子(例如，蛋白质、多肽、脂质)的疏水特性来实现甚至密切相关的分子的分离。分子上的疏水基团与介质或膜的疏水基团相互作用。在某些实施方案中，分子疏水性越强，其与柱或膜的相互作用越强。因此，HIC步骤(例如，本文所述的那些)可用于去除多种杂质，例如，工艺相关杂质(例如，DNA)以及产物相关物质(例如，高分子量和低分子量产物相关物质，例如蛋白质聚集体和片段)。

在某些实施方案中，HIC吸附剂材料由具有侧接疏水相互作用配体的色谱骨架构成。例如但不限于，HIC介质可以由具有侧接疏水相互作用配体的对流膜介质、具有侧接疏水相互作用配体的对流整体介质和/或具有包含侧接疏水相互作用配体的嵌入介质的对流过滤介质构成。

在某些实施方案中，HIC吸附材料可包含碱性基质(例如纤维素的衍生物、聚苯乙烯、合成聚氨基酸、合成聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、交联琼脂糖、合成共聚物材料或甚至玻璃表面)，所述碱性基质使用双官能连接基团(例如--NH--，--S--，--COO--等)偶联或共价附接至疏水配体(例如，烷基、芳基及其组合)。疏水配体可以氢终止，但也可以官能团(例如，NH₂、SO₃H、PO₄H₂、SH、咪唑、酚基或非离子基团如OH和CONH₂)终止。在某些实施方案中，HIC介质包含至少一种疏水配体。在另一个实施方案中，疏水配体选自由丁基、己基、苯基、辛基或聚丙二醇配体组成的组。

合适的HIC介质的一个非限制性示例包括琼脂糖介质或用苯基官能化的膜(例如，来自GE Healthcare的苯基琼脂糖凝胶或来自Sartorius的苯基膜)。许多HIC介质是可商购的。示例包括但不限于Tosoh Hexyl、CaptoPhenyl、具有低或高取代的Phenyl Sepharose6Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Octyl Sepharose High Performance(GE Healthcare)；Fractogel EMD Propyl或Fractogel EMD Phenyl(E.Merck,Germany)；Macro-Prep Methyl或Macro-Prep t-Butyl columns(Bio-Rad,California)；WP HI-Propyl(C3)(J.T.Baker,New Jersey)；Toyopearl醚、苯基或丁基(TosoHaas,PA)；ToyoScreen PPG、Toyopearl PPG-600M、ToyoScreen Phenyl、ToyoScreen Butyl和ToyoScreen Hexyl是刚性甲基丙烯酸聚合物珠。GE HiScreen Butyl FF和HiScreen OctylFF是高通量琼脂糖珠。

混合模式色谱(MMC)

在某些实施方案中，对包含本文公开的多肽的样品进行混合模式色谱(MMC)以纯化多肽。另外地或可选地，可以对通过本发明的方法产生的洗涤和/或流通级分进行混合模式色谱以进一步纯化多肽。在某些实施方案中，可以在HIC纯化步骤之后使用一个或多个混合模式色谱步骤。在某些实施方案中，可以在HIC纯化步骤之前使用一个或多个混合模式色谱步骤。在某些实施方案中，可以在离子交换纯化步骤之后使用一个或多个混合模式色谱步骤。在某些实施方案中，可以在离子交换纯化步骤之前使用一个或多个混合模式色谱步骤。

混合模式色谱是利用混合模式介质的色谱，包括但不限于可获取自GEHealthcare的CaptoAdhere或Capto MMC ImpRes。这样的介质包含混合模式色谱配体。在某些实施方案中，这样的配体是指能够提供与待结合物质相互作用的至少两个不同但协同的位点的配体。这些位点中的一个在配体和多肽之间提供吸引型电荷-电荷相互作用。另一个位点通常提供电子受体-供体相互作用和/或疏水和/或亲水相互作用。电子供体-受体相互作用包括例如氢键、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等相互作用。与传统阴离子交换剂相比，混合模式官能度可给出不同的选择性。混合模式色谱配体也称为“多峰”色谱配体。Capto Adhere包含用N-苄基-N-甲基乙醇胺配体官能化的刚性、高流动性琼脂糖基质。Capto MMC包含用苯甲酰同型半胱氨酸配体官能化的刚性、高流动性琼脂糖基质。

在某些实施方案中，混合模式色谱介质由直接或经由间隔区偶联至有机或无机支持物(有时是指碱性基质)的混合模式配体组成。在某些实施方案中，混合模式配体可以是多峰弱阳离子交换剂。支持物可以是颗粒的形式，例如基本上球形颗粒、整料、过滤器、膜、表面、毛细管等。在某些实施方案中，支持物由天然聚合物制备，例如交联的糖类材料，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋胶、角叉菜胶、结冷胶、藻酸盐等。为了获得高吸附能力，支持物可以是多孔的，然后将配体偶联到外表面以及孔表面。这样的天然聚合物支持物可以根据标准方法制备，例如反相悬浮凝胶化(S Hjerten:Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964))。或者，支持物可以由合成聚合物制备，例如交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯酯、乙烯基酰胺等。这种合成聚合物可以根据标准方法生产，参见，例如，“Styrene based polymersupports developed by suspension polymerization”(R Arshady:Chimica e L’Industria 70(9),70-75(1988)。多孔天然或合成聚合物支持物也可从商业来源获取，例如，Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden。

病毒过滤

在某些实施方案中，对包含本文公开的多肽的样品进行病毒过滤以进一步纯化所述多肽。另外地或可选地，可以对通过本发明的方法产生的洗涤和/或流通级分进行病毒过滤以进一步纯化多肽。

病毒过滤是整个纯化工艺中专门的病毒减少步骤。在某些实施方案中，该步骤作为后色谱精制步骤进行。病毒减少可以通过使用合适的过滤器实现，所述过滤器包括但不限于来自Asahi Kasei Pharma的Planova 20N、50N或BioEx，来自EMD Millipore的Viresolve过滤器，来自Sartorius的ViroSart CPV，或来自Pall Corporation的UltiporDV20或DV50过滤器。选择合适的过滤器以获得所需的过滤性能对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

超滤/渗滤

在某些实施方案中，纯化本文所述多肽的方法可包括一个或多个超滤(UF)和/或渗滤(DF)步骤以浓缩多肽和交换多肽的缓冲液。在某些实施方案中，超滤步骤可将多肽浓缩约2X倍至约100X倍。

在某些实施方案中，超滤步骤可将多肽浓缩约2X、约5X、约10X、约20X、约30X、约40X、约50X、约60X、约70X、约80X、约90X或约100X倍。在某些实施方案中，超滤步骤可以将多肽浓缩约10X倍。

超滤被详细描述于例如，Microfiltration and Ultrafiltration:Principlesand Applications,L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1996)中；和Ultrafiltration Handbook,Munir Cheryan(Technomic Publishing,1986；ISBNNo.87762-456-9)中。一种过滤方法是正切流过滤(Tangential Flow Filtration)，例如，如标题为“Pharmaceutical Process Filtration Catalogue”pp.177-202(Bedford,Mass.,1995/96)的Millipore目录中所述。超滤器包括但不限于Sartorius Hydrosart超滤器。在某些实施方案中，超滤包括使用孔径小于0.1μm的过滤器过滤。通过应用具有这种小孔径的过滤器，样品的体积可以经由过滤器通过样品缓冲液的渗透而减少，而目标多肽被保留在过滤器后。超滤器可以由截留分子量(MWCO)值定义，例如2kD、5kD、10kD、30kD或100kD的MWCO。在某些实施方案中，超滤器可以具有10kD的MWCO。

渗滤是使用超滤器去除和交换盐、糖和非水溶剂，以分离游离的结合物质、以去除低分子量物质和/或引起离子和/或pH环境快速变化的方法。通过以约等于超滤速率的速率向被超滤的溶液中添加溶剂可最有效地去除微溶质。这以恒定体积从溶液中洗涤微小物质(microspecies)，有效地纯化保留的目标多肽。在本文公开的方法的某些实施方案中，任选地在进一步的色谱或其它纯化步骤以及从多肽制备物中去除杂质之前，使用渗滤步骤交换所使用的多种缓冲液。

互补的纯化技术

在某些实施方案中，离子交换色谱、混合模式色谱和疏水作用色谱方法的组合可被用于制备具有降低的杂质水平的多肽的制剂，包括其中一种技术以与另一种技术互补/补充的方式使用的某些实施方案。在某些实施方案中，这样的组合包括使用另外的干预色谱、过滤、pH调节、UF/DF(超滤/渗滤)步骤以实现期望的产物质量、离子浓度和/或病毒减少。

在某些实施方案中，本文公开的多肽可以通过遵循特定的纯化方法或方案从宿主细胞培养物中纯化。在某些实施方案中，多肽(例如，与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2)可按照以下连续色谱步骤纯化：1)第一阴离子交换色谱(AEX)步骤，2)疏水作用色谱(HIC)步骤，3)混合模式色谱(MMC)步骤，和4)第二AEX步骤。一个或多个过滤步骤可以在上述色谱步骤中的任何点使用。在某些实施方案中，多肽可按照以下连续纯化步骤纯化：1)第一超滤/渗滤步骤，2)第一阴离子交换色谱(AEX)步骤，3)高pH孵育步骤(例如，在约10.8的pH孵育至少60分钟)，4)病毒灭活步骤，5)疏水作用色谱(HIC)步骤，6)第二超滤/渗滤步骤，7)混合模式色谱(MMC)步骤，8)第三超滤/渗滤步骤，9)第二AEX步骤，10)病毒过滤步骤，和11)第四超滤/渗滤步骤。

具有特定多糖谱的多肽组合物和改善血清半衰期的方法

在某些实施方案中，本文所述的纯化方法可用于改善多肽组合物的血清半衰期。纯化的组合物包含多种多肽，多种多肽中的每种多肽包含连接至一种或多种多糖种类的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述一种或多种多糖种类在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187、N206和T212中的一个或多个处连接至所述多肽。组合物多肽上的多糖种类的数量和类型可影响向患者施用后组合物的血清半衰期。组合物的多糖谱是组合的所有多肽中SEQID NO:1的氨基酸位置N187、N206和T212处每种多糖种类的百分比。组合物多糖谱的改变可以增高或降低组合物的血清半衰期。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类选自由以下组成的组：

-Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

-Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

-Hex5HexNAc4FucNeuAc；

-Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

-Hex4HexNAc4FucNeuAc；

-Hex5HexNAc5NeuAc2；

-Hex5HexNAc4Fuc；

-Hex3HexNAc4Fuc；

-Hex4HexNAc4Fuc；

-Hex6HexNAc5Fuc；以及

-Hex5HexNAc5Fuc；

其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，Fuc代表岩藻糖，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类选自由以下组成的组：

-Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

-Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

-Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

-Hex7HexNAc6FucNeuAc3；

-Hex6HexNAc5FucNeuAc；

-Hex5HexNAc4FucNeuAc；

-Hex5HexNAc4Fuc；以及

-Hex4HexNAc4Fuc；

在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类选自由以下组成的组：

-HexHexNAc；

-HexHexNAcNeuAc；以及

-HexHexNAcNeuAc2；

其中Hex代表己糖，HexNAc代表N-乙酰己糖胺，NeuAc代表N-乙酰神经氨酸，并且数字代表每种多糖结构的数量。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类的总百分比包括：

-约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2，例如约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、或约70％；

-约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2，例如约4％、约5％、或约6％；

-约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc，例如约7％、约8％、约9％、或约10％；

-约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3，例如约15％、约16％、或约17％；以及

-约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2。

-约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

-约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

-约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

-约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

-约0.5％至约1.5％的Hex4HexNAc4FucNeuAc；

-约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2；

-约0％至约0.5％的Hex5HexNAc4Fuc；

-约0％至约0.5％的Hex3HexNAc4Fuc；

-约0％至约0.5％的Hex4HexNAc4Fuc；

-约0％至约0.5％的Hex6HexNAc5Fuc；以及

-约0％至约0.5％的Hex5HexNAc5Fuc。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类的总百分比包括：

-约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3，例如约3％、约4％、或约5％；

-约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2，例如约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、或约85％；

-约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2，例如约2％、约3％、或约4％；

-约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc，例如约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、或约12％；以及

-约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc，例如约1％、约2％、或约3％。

-约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

-约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

-约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

-约0.5％至约1.5％的Hex7HexNAc6FucNeuAc3；

-约0％至约1％的Hex6HexNAc5FucNeuAc；

-约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

-约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc；以及

-约0.5％至约2％的Hex4HexNAc4Fuc。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类的总百分比包括：

-约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc，例如约14％、约15％、约16％、约17％、或约18％；以及

-约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2，例如约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、或约13％。

-约0％至约1％的HexHexNAc；

-约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc；以及

-约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2。

在某些实施方案中，组合物中多种多肽的SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的未糖基化氨基酸的总百分比包括约65％至约80％。

在某些实施方案中，本文所述的纯化方法可用于提供包含多种多肽的组合物，所述多种多肽中的每种多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，其中所述组合物包含特异性毛细管等电聚焦(cIEF)曲线，例如图15中所描绘的cIEF曲线。cIEF曲线是多种多肽的组合物的电荷异质性的指纹。

在某些实施方案中，组合物包含以下的峰面积百分比：

-在pI 5.93处约8％至约12％；

-在pI 6.09处约18％至约26％；

-在pI 6.38处约22％至约26％；以及

-在pI 6.66处约18％至约28％。

在某些实施方案中，组合物包含以下的峰面积百分比：

-在pI 5.73处约1.5％至约2.5％；

-在pI 5.93处约8％至约12％；

-在pI 6.09处约18％至约26％；

-在pI 6.28处约3.5％至约4.5％；

-在pI 6.38处约22％至约26％；

-在pI 6.48处约3％至约5％；

-在pI 6.53处约4％至约6％；

-在pI 6.66处约18％至约28％；

-在pI 6.82处约2％至约6％；以及

-在pI 7.02处约0％至约3％。

在某些实施方案中，在约pI 5.73处的峰包括在约pI 5.70和约pI5.76处的峰的组合。在某些实施方案中，在约pI 5.93的处峰包括在约pI 5.89和约pI 5.97处的峰的组合。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等同物对本文描述的方法进行其它合适的改变和适应。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施方案，这些实施例仅用于说明目的而被包括，并不旨在进行限制。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为进一步的限制。除非另有说明，本发明的实践将应用本技术领域范围内的有机合成、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学和免疫学的常规技术。

实施例1—上游多肽A产生

多肽A由被转染以表达多肽A的CHOK1SV细胞系的单细胞克隆产生。用于多肽A产生的上游种子培养过程是从低温储存的细胞库(约1×10⁷个活细胞)到约5×10¹⁰个活细胞的最小临界质量(>95％存活力)，以约3×10⁵个活细胞/mL(最小种子密度)接种200L生物反应器至70％工作体积(140L)产生培养基。为了达到该最终临界质量，通过以3-4天的间隔逐渐增加无菌摇瓶和摇床袋的尺寸来扩增细胞。在进行下游细胞培养物收获和纯化之前，在约10-14天内进行按比例扩大和多肽A产生。在第8、10、12、13和14天进行SDS-PAGE以测定多肽A的相对纯度和丰度(图2)。

实施例2—下游多肽A产生/纯化

收获和澄清

使用EMD POD深度过滤器进行细胞培养物收获和澄清，随后通过Durapore10”0.2μm滤芯式过滤器进行最终澄清。

超滤(UF)/渗滤(DF)I

UF和DF处理步骤分别用于产物浓缩和缓冲液交换。在制造过程中，为了防止UF/DF单元操作之间的任何潜在残留，所有UF/DF盒匣(cassette)仅使用一次。基于多肽A的大小(～40kD)，三个UF/DF步骤中全部使用Sartorious Hydrosart 10kD截留分子量(MWCO)膜包(membrane cassette)。前两个UF/DF步骤主要用于浓缩稀释的产物溶液并进行缓冲液交换，使其适合于通过柱色谱步骤进一步处理，而最后的UF/DF步骤用于将纯化的蛋白质放置于制剂和缓冲液中，并在药物产品制造前使其达到最终浓度。

第一UF步骤用于将产物浓缩约10倍或更高。用WFI和PBS冲洗膜包以去除储存溶液。澄清的收获物以600-700L/H的流速供应；进料入口压力维持在15-29psi之间，保留物压力维持在10-14psi之间，并且跨膜压力(TMP)维持在12.5-21.5psi之间。浓缩后，将过程流(process stream)渗滤至5DV具有1-2mS电导率的20m M Tris，pH 8.5±0.5缓冲液中。分别通过SE-HPLC和RP-HPLC测试最终回收产物溶液的纯度和浓度。该步骤的总产率通常>90％并且在2-8℃下储存产物溶液直到进一步加工。

阴离子交换色谱(AEX)I

在UF/DF I步骤之后，第一AEX步骤(AEX I)被用于从澄清的收获物中捕获多肽A。GigaBap Q 650M树脂(Tosoh Biosciences)与20cm填充床和30g/L树脂的动态载量(DBC)一起使用。首先用交替单柱体积的AEX I缓冲液B(AEX B)和AEX I缓冲液A(AEX A)平衡AEX柱，总计4个柱体积，流速为300cm/hr。

将UF/DF I步骤产物以300cm/hr的流速加载到AEX I柱上。加载步骤后，用AEX I缓冲液C(AEX C)洗涤柱，5个柱体积，且流速为300cm/hr。

然后用AEX I缓冲液D(AEX D)以10个柱体积和300cm/hr的流速从AEX I柱洗脱多肽A。收集洗出液，洗脱峰截止值为300mAU。下表1列出了所使用的AEX I缓冲液。下表2显示了AEX I加载与AEX I池洗脱样品的比较。显示了多肽A的量、步骤产率和CHO宿主细胞蛋白(HCP)的量。

表1-AEX I缓冲液

表2-AEX I纯化步骤结果

在5和25℃下储存1、7和10天后，在AEX I步骤后测定多肽A的稳定性和活性。如SDS-PAGE和SE-HPLC所示，多肽A稳定性在5℃下保持了1、7和10天，在25℃下保持了1天，尽管在第7天和第10天发生一些降解(图3A和图3B)。在细胞水平测定中测量多肽A的活性。指示细胞系HH细胞(ATCC：CRL-2105)是缺乏IL-2受体的IL-2Rα亚基的人T淋巴细胞。多肽A已经被工程化为更特异性地结合至导致pSTAT5的刺激和磷酸化的较低亲和力的受体IL-2Rβ/γ。然后通过夹心ELISA测量HH细胞系中响应多肽A的pSTAT5活化水平。活性测定结果显示多肽A在两种温度下均随时间保持活性(图3C)。

蛋白质重折叠/升高的pH保持

然后使AEX I产物经受升高的pH保持。向AEX I池中添加碳酸钠(2M)/氢氧化钠(0.2M)缓冲液以将pH升高至约10.8。在该pH下保持AEX I池约1小时，同时混合并确保pH保持在≥10.7。在升高的pH孵育后，向AEX I池中添加1M柠檬酸溶液以将pH降低至约8.5+/-0.2。调节pH后，通过0.2μm过滤器过滤样品。令人惊讶地发现，在AEX I步骤之后升高的pH保持改善了产物的纯度。在升高的pH保持前通过RP-HPLC分析AEX I加载样品和AEX I池样品，并且在升高的pH保持后通过RP-HPLC分析样品(HIC加载)。如图4所示，在对应于多肽A的主峰右侧观察到代表污染物的次峰。在升高的pH保持步骤后去除该次峰，如HIC加载样品的RP-HPLC描记图所示。

病毒灭活

随后使蛋白质样品进行病毒灭活步骤。在病毒灭活过程中，溶剂/去污剂被用于包膜病毒的灭活。该方法相比于其他方法具有许多优点，因为它不使蛋白质变性，与大多数缓冲体系相容，具有高的工艺回收率，并且需要相对简单的设备。该步骤的主要目的是灭活可能存在于过程流中的任何潜在的包膜病毒。该过程中使用的溶剂和去污剂是TnBP(磷酸三正丁酯)和胆酸钠。用3％TnBP和10％胆酸钠制备溶剂和去污剂的10X溶液。为了灭活病毒，将溶剂/去污剂添加到AEX柱主流池达1X终浓度，混合溶液并在环境温度下孵育4小时。孵育完成后，添加1M硫酸铵以制备用于在HIC柱上进一步下游处理的主流池。

疏水作用色谱(HIC)

HIC是多肽A下游工艺中的第二纯化步骤。在该色谱步骤中使用的树脂基质是Toyopearl PPG 600M(Tosoh Biosciences)并且具有40-90μm的平均珠尺寸。在环境温度下以结合并洗脱模式操作，并使用硫酸铵的多步反向梯度洗脱多肽A。

HIC树脂筛选

进行初始筛选以确定最佳HIC树脂。在初始树脂筛选期间，将1.5M硫酸铵添加至AEX柱洗出液池中，并将pH调节至8.0±0.2。然后将该样品应用于不同的HIC树脂上以测试多肽A的结合。具体地，测试丁基-650M、苯基-650M、己基-650C和PPG-600M树脂。洗涤柱，并应用降低盐浓度的反向线性梯度洗脱结合的多肽A。在8.0±0.2在1.5M硫酸铵存在下，多肽A与Toyopearl PPG 600M树脂结合，并用降低盐浓度的反向线性盐梯度洗脱。基于洗脱曲线和SDS-PAGE分析，选择Toyopearl PPG 600M作为树脂以用于进一步评估(图5)。

使用Toyopearl PPG 600M树脂产生DBC为5g/L的20cm填充树脂床。首先用交替单柱体积的HIC缓冲液B(HIC B)和HIC缓冲液A(HIC A)平衡HIC柱，总计4个柱体积，流速为179cm/hr。

将AEX I步骤产物以179cm/hr的流速加载到HIC柱上。加载步骤后，用HIC缓冲液A洗涤柱，5个柱体积，且流速为179cm/hr。

然后用HIC缓冲液D(HIC D)以10柱体积和179cm/hr流速从HIC柱洗脱多肽A。收集洗出液，洗脱峰截止值为25mAU。下表3列出了所使用的HIC缓冲液。下表4显示了HIC加载与HIC池洗脱样品的比较。显示了多肽A的量、步骤产率和CHO宿主细胞蛋白(HCP)的量。在洗脱步骤期间收集的所有级分分别通过SE-HPLC和RP-HPLC分析纯度和浓度。将通过SE-HPLC测定纯度为≥95％的级分被合并至HIC池以用于进一步处理。

表3-HIC缓冲液

表4-HIC纯化步骤结果

在5和25℃下储存1、7和10天后，在HIC步骤后测定多肽A的稳定性和活性。如SDS-PAGE和SE-HPLC所示，多肽A稳定性在5℃和25℃下保持了1、7和10天(图6A和图6B)。在前述细胞水平测定中测量多肽A的活性。活性测定结果显示多肽A在两种温度下均随时间保持活性(图6C)。

UF/DF II

使用膜表面积为1.8m²(3×0.6m²)的Sartorius Hydrosart 10kDa MWCO过滤器进行第二UF步骤。第二UF步骤用于将产物浓缩约10倍或更高。浓缩后，使用冰醋酸将HIC池调节至pH 5.5，通过0.2μm过滤器过滤，并渗滤至5DV具有3.0-4.0mS电导率的50mM乙酸钠，pH5.5±0.2缓冲液中。分别通过SE-HPLC和RP-HPLC测试最终回收产物溶液的纯度和浓度。该步骤的总产率通常>90％并且在2-8℃下储存产物溶液直到进一步加工。

混合模式色谱(MMC)

MMC是多肽A下游工艺中的第三步。选择用于该色谱步骤的树脂为Capto MMCImpRes(G.EHealthcare)，其为具有36-44μm平均粒径的弱阳离子交换多峰树脂。在环境温度下以结合并洗脱模式操作以纯化多肽A。该步骤使用多步氯化钠洗脱梯度，旨在提高分辨率和再现性。

使用Capto MMC ImpRes树脂产生DBC为20g/L的20cm填充树脂床。首先用交替单柱体积的MMC缓冲液B(MMC B)和MMC缓冲液A(MMC A)平衡MMC柱，总计4个柱体积，流速为238cm/hr。

将HIC步骤产物以238cm/hr的流速加载到MMC柱上。加载步骤后，用MMC缓冲液A洗涤柱，5个柱体积，且流速为238cm/hr，然后用MMC缓冲液C(MMC C)洗涤柱，5个柱体积，且流速为238cm/hr。

然后用MMC缓冲液D(MMC D)以15个柱体积和238cm/hr的流速在一步洗脱方法中从MMC柱洗脱多肽A。收集洗出液，洗脱峰截止值为50mAU。用MMC缓冲液E(MMC E)以5个柱体积和238cm/hr的流速进行另外的洗涤步骤。下表5列出了使用的MMC缓冲液。下表6显示了MMC加载与MMC池洗脱样品的比较。显示了多肽A的量、步骤产率和CHO宿主细胞蛋白(HCP)的量。

表5-MMC缓冲液

表6-MMC纯化步骤结果

在5和25℃下储存1、6和11天后，在MMC步骤后测定多肽A的稳定性和活性。如SDS-PAGE所示，多肽A稳定性在5和25℃下保持了1、6和11天(图7A)。多肽A稳定性在2-8℃下还保持了4个月，如SE-HPLC所示(图7B)。在前述细胞水平测定中测量多肽A的活性。活性测定结果显示多肽A在两种温度下均随时间保持活性(图7C)。

UF/DF III

第三UF步骤用于将产物浓缩约10倍或更高。浓缩后，将MMC池渗滤到5DV具有2.0-3.0mS电导率的20mM Tris，pH 8.0缓冲液中。

阴离子交换色谱(AEX)II

在UF/DF III步骤之后，第二AEX步骤(AEX II)被用作多肽A的额外精制。GigaBapQ 650M树脂(Tosoh Biosciences)与20cm填充床和20g/L树脂的动态载量(DBC)一起使用。首先用交替单柱体积的AEX II缓冲液F(AEX F)和AEX II缓冲液E(AEX E)平衡AEX柱，总计4个柱体积，流速为300cm/hr。

将UF/DF III步骤产物以300cm/hr的流速加载到AEX II柱上。加载步骤后，用AEXII缓冲液E洗涤柱，5个柱体积，且流速300cm/hr。

然后用两个不同梯度洗脱步骤中的一个从AEX II柱洗脱多肽A。从AEX II缓冲液E到AEX II缓冲液F进行一个梯度洗脱。梯度以300cm/hr的流速运行，并在15个柱体积内从0-20％缓冲液E到缓冲液F。收集洗出液，洗脱峰截止值为200mAU。下表7列出了所用的AEX II缓冲液。下表8显示了AEX II加载与AEX II池洗脱样品的比较。显示了多肽A的量、步骤产率和CHO宿主细胞蛋白(HCP)的量。进行从AEX II缓冲液E到AEX II缓冲液G的第二备选洗脱步骤。梯度以300cm/hr的流速运行，并在15个柱体积内从0-100％缓冲液E到缓冲液G。

表7-AEX II缓冲液

表8-AEX II纯化步骤结果

在2-8、25和-80℃下储存14天后，在AEX II步骤后测定多肽A的稳定性。如SDS-PAGE所示，多肽A稳定性在2-8、25和-80℃下保持了14天(图8)。

宿主细胞蛋白(HCP)含量的降低

当施用于患者时，药物组合物中的HCP含量可增加免疫原性的风险。HCP含量的降低与特异性炎性细胞因子的减少有关(Wang等，Biotechnology&Bioengineering.103(3):446-58.2009)。因此，尽可能低地降低药物组合物中的HCP含量是有利的。尽管有三个色谱步骤(AEX I、HIC和MMC)和几个过滤步骤，多肽A纯化中残留的HCP含量仍高于150ppm。令人惊讶地发现，上述AEX II步骤对于将HCP含量降低至较低水平是重要的，例如，降低至≤约100pm或≤约50ppm的HCP含量。特别地，梯度洗脱步骤而不是AEX I步骤的单缓冲液洗脱的使用在将HCP含量降低至≤约100ppm中是有用的。最后的AEX II步骤允许HCP含量降低到可接受的水平，而不需要亲和纯化步骤。

病毒过滤

然后使用EMD Viresolve Pro Modus 1.3Shield预过滤器(1.3英寸)和装置(0.22m²)对AEX II池样品进行病毒过滤步骤。过滤步骤以2600mL/min(990-2750mL/min范围)的流速进行。

UF/DF IV和原料药灌装

第四UF步骤用于将产物浓缩约10倍或更高。浓缩后，将AEX II池液渗滤至10DV制剂缓冲液(50mg/ml蔗糖，2.03mg/ml柠檬酸钠三碱二水合物和0.97mg/ml柠檬酸，pH 6.1)中。然后将聚山梨酯20添加至渗滤样品中至终浓度为0.1mg/ml。使多肽A的最终浓度为1.05mg/mL(1.0-1.09mg/mL范围)。最后，通过0.1μm Millipore Durapore过滤器过滤样品。

纯化总结

下表9总结了上述纯化方案的多肽A滴定量和HCP污染物结果。表9-反相(RP)-HPLC测定的纯化方案不同阶段样品中多肽A滴定量和CHO宿主细胞蛋白(HCP)

实施例3-pH保持步骤的优化以提高纯度

为了在纯化工艺中提高多肽A的纯度，优化蛋白质重折叠/升高的pH保持步骤。本实施例的结果导致如实施例2所述的蛋白质重折叠/升高的pH保持步骤。在AEX I步骤之前或AEX I步骤之后在10.8的pH下保持1小时，并比较结果。图9描述了所进行的两个实验的示意图。

AEX I前的pH处理

在UF/DF I和AEX I步骤之前的收获材料在pH 10.8下混合孵育1小时。然后如实施例2所述用UF/DF I步骤、AEX I步骤、病毒灭活步骤和HIC步骤加工经pH处理的样品。AEX I步骤的结果示于下表10和图10中。随后的HIC步骤的结果示于下表11和图11中。

表10-来自经pH处理的收获样品的AEX I步骤的结果

表11-来自经pH处理的收获样品的HIC步骤的结果

AEX I后的pH处理

将UF/DF I和AEX I步骤之后获得的材料在pH 10.8下混合孵育1小时。然后如实施例2所述用病毒灭活步骤和HIC步骤加工经pH处理的样品。AEX I步骤的结果示于下表12和图12中。随后的HIC步骤的结果示于下表13和图13中。

表12-pH处理前AEX I步骤的结果

表13-来自经pH处理的AEX I样品的HIC步骤的结果

从上述数据可以看出，AEX I柱不能解决次峰污染物。然而，如图13所示，当AEX I池样品经受升高的pH处理时，没有观察到次峰。

实施例4-纯化后多肽A的位点特异性多糖谱

按照实施例2中描述的下游纯化工艺测定多肽A的位点特异性多糖谱。纯化的组合物包含在选定氨基酸上具有不同多糖结构的多肽A多肽的混合物。为了测定多糖谱，进行肽作图。简言之，用蛋白酶胰蛋白酶不完全消化还原和烷基化的多肽A蛋白，并使用反相高效液相色谱质谱(RP-HPLC/MS)分离消化混合物。这产生了大量重叠肽，分析证实了理论序列。三个不同批次的纯化多肽A的胰蛋白酶产生的肽图的总离子色谱图证实这些批次是具有可比性的。N-连接的多糖被鉴定为存在于Asn187(N187)和Asn206(N206)。这些多糖主要是唾液酸化的复合岩藻糖基化类型。核心1型O-多糖也存在于Thr212(T212)。

根据离子强度计算每个糖基化位点的多糖同种型的相对百分比，结果总结在下表14中。三个批次之间的多糖谱高度相似，这表明每个批次的主要多糖种类相同。

表14-多肽A的位点特异性多糖谱

Hex：己糖；HexNAc：N-乙酰己糖胺；NeuAc：N-乙酰神经氨酸；Fuc：岩藻糖

为了证实多糖结构对纯化的多肽A的重要性，在小鼠体内的药代动力试验中使用三个不同批次的纯化的多肽A来测定血清半衰期。用唾液酸酶处理三批中的一批以去除唾液酸化标记物，而另外两批未处理。如图14所示，唾液酸化标记物的去除大大降低了多肽A的血清半衰期。实施例2中描述的下游纯化工艺产生含有在选定氨基酸上具有不同多糖结构的多肽A多肽的混合物的纯化组合物。在此显示多糖结构对于维持血清半衰期是重要的。

实施例5-纯化后多肽A的电荷分布

按照实施例2中所述的下游纯化工艺测定电荷分布曲线。纯化的组合物包含具有不同电荷的多肽A多肽的混合物。为了测定电荷分布曲线，用毛细管等电聚焦(cIEF)分析三个不同批次的纯化的多肽A以产生cIEF曲线。然后测量pI峰面积百分比以测定纯化的多肽A组合物中每种电荷变体的相对量。结果示于下表15中。三个批次的cIEF曲线描绘于图15中。

表15-多肽A的电荷变体的cIEF峰面积百分比

pI	批次1(％)	批次2(％)	批次3(％)
				5.73	1.7	2.2	2.3
5.93	8.9	11.6	11.5
				6.09	20.9	24.7	24.9
6.28	3.8	4.0	4.1
				6.38	23.2	25.0	25.0
6.48	3.6	3.6	3.8
				6.53	4.6	4.8	4.7
6.66	26.4	20.7	20.6
				6.82	4.8	3.4	3.1
7.02	2.2	未检测到	未检测到
				5.73a	1.7	2.2	2.3
5.93b	8.9	11.6	11.5

pI 5.73是在pI 5.70和pI 5.76处的峰的组合。

pI 5.93是在pI 5.89和pI 5.97处的峰的组合。

Claims

1.一种纯化包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2的多肽的方法，所述方法包括：

a)在使多肽与第一色谱基质结合的条件下，使包含所述多肽和宿主细胞蛋白(HCP)的澄清的细胞上清液与所述基质接触，并从所述基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；

b)将来自步骤(a)的第一洗出液的pH调节至至少10.5且至多11.5以产生经pH调节的洗出液；以及

c)使来自步骤(b)的所述经pH调节的洗出液与第二色谱基质接触，使得所述多肽与所述基质结合，并从所述基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中，从而纯化所述多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一色谱基质包含阴离子交换色谱(AEX)基质。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在与所述AEX基质接触之前，所述澄清的细胞上清液被缓冲液交换到具有约1-2mS/cm的电导率且pH为约8.0-8.5的溶液中。

5.根据权利要求3和4中任一项所述的方法，其中所述AEX基质包含季胺基团。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述AEX基质包含季胺基团官能化的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述珠的平均直径为约75μm。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述珠的平均孔径为约100nm。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中使用盐浓度相当于电导率约15至约25mS/cm的溶液从所述AEX基质洗脱所述多肽。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中在约pH 8.4-8.6下使用约0.20-0.25M氯化钠水溶液从所述AEX基质洗脱所述多肽。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用碳酸钠和/或氢氧化钠调节所述第一洗出液的pH。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用碳酸钠或氢氧化钠以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg所述第一洗出液的比例调节所述第一洗出液的pH。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经pH调节的洗出液的pH保持在10.7或高于10.7但低于11.0至少1小时。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经pH调节的洗出液的pH保持在10.7或高于10.7但低于11.0至少1小时，其中在10.7或高于10.7但低于11.0的所述pH是通过以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg所述第一洗出液的比例添加碳酸钠或氢氧化钠来实现。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括通过添加柠檬酸降低所述经pH调节的洗出液的pH。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将所述经pH调节的洗出液的pH降低至约pH 8.3-8.7。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在与HIC基质接触之前，所述经pH调节的洗出液的电导率被改变为约130至约160mS/cm，并且所述pH被改变为约8.5±0.2。

18.根据权利要求16所述的方法，其中使用硫酸铵改变所述经pH调节的洗出液的电导率。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二色谱基质包含疏水作用色谱(HIC)基质。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，所述经pH调节的洗出液被改变为包含约1-1.2M硫酸铵。

21.根据权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述HIC基质包含聚丙二醇基团。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述HIC基质包含与聚丙二醇基团连接的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述珠的平均直径为约40至约90μm。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述珠的平均孔径为约75nm。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中使用盐浓度相当于电导率约100至约140mS/cm的溶液从所述HIC基质洗脱所述多肽。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中使用降低盐浓度的连续多步梯度从所述HIC基质洗脱所述多肽。

27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，其中在pH 8.5±0.2下使用包含约0.85至约0.95M硫酸铵的缓冲液从所述HIC基质洗脱所述多肽。

28.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，通过0.2μm过滤器过滤所述经pH调节的洗出液。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在与所述第二色谱基质接触之前，对所述经pH调节的洗出液进行病毒灭活。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述病毒灭活通过所述经pH调节的洗出液与磷酸三正丁酯和聚山梨酯20的混合实现。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用混合模式色谱(MMC)从所述第二洗出液中进一步纯化所述多肽。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用MMC然后使用AEX从所述第二洗出液中进一步纯化所述多肽。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述澄清的细胞上清液来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二洗出液中所述多肽的纯度至少是90％。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多肽的纯度通过反相(RP)HPLC测定。

36.一种用于降低含有多肽的澄清的细胞上清液中宿主细胞蛋白(HCP)含量的方法，所述多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，所述方法包括在使得所述多肽与AEX基质结合的条件下，使部分纯化的多肽与所述AEX基质接触，并在梯度洗脱条件下从所述AEX基质选择性洗脱所述多肽，从而降低所述多肽中HCP含量。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

38.根据权利要求36或37任一项所述的方法，其还包括使包含所述多肽和HCP的所述澄清的细胞上清液与一种或多种色谱树脂接触以获得所述部分纯化的多肽。

39.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中在使所述部分纯化的多肽与所述AEX基质接触之前，所述HCP含量为≥约300ppm。

40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中在使所述部分纯化的多肽与所述AEX基质接触之前，所述HCP含量为≥约150ppm。

41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中在梯度洗脱条件下，在从所述AEX基质洗脱所述多肽后，所述HCP含量为≤约100ppm。

42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中在梯度洗脱条件下，在从所述AEX基质洗脱所述多肽后，所述HCP含量为≤约50ppm。

43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述梯度洗脱条件包括以下的一个或多个：

随时间增加洗脱缓冲液的电导率；

随时间增加洗脱缓冲液的盐浓度；或

随时间降低洗脱缓冲液的pH。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率从约≤5mS/cm增加至约≥15mS/cm。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥15mS/cm。

46.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率从约≤2mS/cm增加至约≥20mS/cm。

47.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率增加至约15mS/cm至约100mS/cm。

48.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率增加至约20mS/cm至约50mS/cm。

49.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有约20mS/cm至约50mS/cm的最终电导率。

50.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液最初具有约≤5mS/cm的电导率。

51.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液最初具有约≤2mS/cm的电导率。

52.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约1.5M盐。

53.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约1.0M盐。

54.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的盐浓度从约0M盐增加至约0.5M盐。

55.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约0.2M盐至约1.0M盐的最终盐浓度。

56.根据权利要求43所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约0.2M盐的最终盐浓度。

57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其中所述盐包括氯化钠。

58.根据权利要求43-57中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液还具有约7.0至约9.0的pH。

59.根据权利要求43-58中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液还具有约8.0的pH。

60.根据权利要求43-59中任一项所述的方法，其中获得所述部分纯化的多肽的所述一种或多种色谱树脂选自由AEX、HIC和MMC组成的组。

61.根据权利要求60所述的方法，其中获得所述部分纯化的多肽包括以下步骤：

a1)在使得所述多肽与第一AEX基质结合的条件下，使包含所述多肽和HCP的所述澄清的细胞上清液与所述AEX基质接触，并从所述AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；

a2)使来自步骤(a1)的第一洗出液与HIC基质接触，使得所述多肽与所述HIC基质结合，并从所述HIC基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中；以及

a3)使来自步骤(a2)的第二洗出液与MMC基质接触，使得所述多肽与所述MMC基质结合，并从所述MMC基质选择性洗脱所述多肽到第三洗出液中，从而获得所述部分纯化的多肽。

62.根据权利要求61所述的方法，其中在与所述第一AEX基质接触之前，所述澄清的细胞上清液被缓冲液交换到具有约1-2mS/cm的电导率且pH为约8.0-8.5的溶液中。

63.根据权利要求61或62中任一项所述的方法，其中所述第一AEX基质包含季胺基团。

64.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述第一AEX基质包含用季胺基团官能化的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述珠的平均直径为约75μm。

66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述珠的平均孔径为约100nm。

67.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中使用盐浓度相当于电导率约15至约25mS/cm的溶液从所述第一AEX基质洗脱所述多肽。

68.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中在约pH8.4-8.6下使用约0.20-0.25M氯化钠水溶液从所述第一AEX基质洗脱所述多肽。

69.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其中使用碳酸钠和/或氢氧化钠调节所述第一洗出液的pH以产生经pH调节的第一洗出液。

70.根据权利要求61-69中任一项所述的方法，其中使用碳酸钠或氢氧化钠以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg所述第一洗出液的比例调节所述第一洗出液的pH。

71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述经pH调节的第一洗出液的pH保持在10.7或高于10.7但低于11.0至少1小时。

72.根据权利要求61-71中任一项所述的方法，其中所述经pH调节的洗出液的pH保持在10.7或高于10.7但低于11.0至少1小时，其中在10.7或高于10.7但低于11.0的所述pH通过以约0.1kg碳酸钠或氢氧化钠比约1kg所述第一洗出液的比例添加碳酸钠或氢氧化钠来实现。

73.根据权利要求71或72所述的方法，其还包括通过添加柠檬酸降低所述经pH调节的第一洗出液的pH。

74.根据权利要求69-73中任一项所述的方法，其还包括将所述经pH调节的第一洗出液的pH降低至约pH 8.3-8.7。

75.根据权利要求61-74中任一项所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，所述经pH调节的第一洗出液的电导率被改变为约130mS/cm至约160mS/cm，并且所述pH被改变为约8.5±0.2。

76.根据权利要求75所述的方法，其中使用硫酸铵改变所述经pH调节的第一洗出液的电导率。

77.根据权利要求76所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，所述经pH调节的第一洗出液被改变为包含约1-1.2M硫酸铵。

78.根据权利要求61-77中任一项所述的方法，其中所述HIC基质包含聚丙二醇基团。

79.根据权利要求61至78中任一项所述的方法，其中所述HIC基质包含与聚丙二醇基团连接的羟基化甲基丙烯酸聚合物珠。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述珠的平均直径为约40至约90μm。

81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述珠的平均孔径为约75nm。

82.根据权利要求61-81中任一项所述的方法，其中使用具有盐浓度相当于电导率约100至约140mS/cm的溶液从所述HIC基质洗脱所述多肽。

83.根据权利要求61-82中任一项所述的方法，其中使用降低盐浓度的连续多步梯度从所述HIC基质洗脱所述多肽。

84.根据权利要求61-83中任一项所述的方法，其中在pH 8.5±0.2下使用包含约0.85至约0.95M硫酸铵的缓冲液从所述HIC基质洗脱所述多肽。

85.根据权利要求61-84中任一项所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，通过0.2μm过滤器过滤所述经pH调节的洗出液。

86.根据权利要求61-85中任一项所述的方法，其中在与所述HIC基质接触之前，对所述经pH调节的第一洗出液进行病毒灭活。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述病毒灭活通过所述经pH调节的洗出液与磷酸三正丁酯和聚山梨酯20的混合实现。

88.根据权利要求61-87中任一项所述的方法，其中所述澄清的细胞上清液来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。

89.一种用于降低含有多肽的澄清的细胞上清液中宿主细胞蛋白(HCP)含量的方法，所述多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，所述方法包括以下步骤：

a.在使得所述多肽与第一AEX基质结合的条件下，使包含所述多肽和HCP的所述澄清的细胞上清液与所述第一AEX基质接触，并从所述第一AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；

b.使所述第一洗出液与HIC基质接触，使得所述多肽与所述HIC基质结合，并从所述HIC基质选择性洗脱所述多肽到第二洗出液中；

c.使所述第二洗出液与MMC基质接触，使得所述多肽与所述MMC基质结合，并从所述MMC基质选择性洗脱所述多肽到第三洗出液中；以及

d.在使得所述多肽与第二AEX基质结合的条件下，使所述第三洗出液与所述第二AEX基质接触，并在梯度洗脱条件下从所述第二AEX基质选择性洗脱所述多肽，从而降低所述多肽中HCP含量，其中在步骤(d)之后所述HCP含量为≤约50ppm。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

91.根据权利要求36-90所述的方法，其中不使用亲和纯化步骤。

92.一种包含多肽的组合物，所述多肽含有与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，其中所述组合物的HCP含量包括≤约100ppm。

93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述组合物的HCP含量包括≤约50ppm。

94.根据权利要求92所述的组合物，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

95.根据权利要求92所述的组合物，其通过权利要求30-83中任一项所述的方法制备。

96.一种提高包含多种多肽的组合物的血清半衰期的方法，所述多种多肽中的每种多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，所述方法包括以下步骤：

a.在使得所述多肽与第一AEX基质结合的条件下，使包含所述多肽的澄清的细胞上清液与所述第一AEX基质接触，并从所述第一AEX基质选择性洗脱所述多肽到第一洗出液中；

d.在使得所述多肽与第二AEX基质结合的条件下，使所述第三洗出液与所述第二AEX基质接触，并从所述第二AEX选择性洗脱所述多肽，从而改善所述组合物的血清半衰期。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

98.根据权利要求96所述的方法，其还包括在步骤(b)的使所述第一洗出液与HIC基质接触之前，将来自步骤(a)的所述第一洗出液的pH调节至至少10.5且至多11.5。

99.一种包含多种多肽的组合物，所述多种多肽中的每种多肽包含与一种或多种多糖种类连接的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述一种或多种多糖种类在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187、N206和T212中的一个或多个处连接至所述多肽。

100.根据权利要求99所述的组合物，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的所述多糖种类选自由以下组成的组：

Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

Hex5HexNAc4FucNeuAc；

Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

Hex4HexNAc4FucNeuAc；

Hex5HexNAc5NeuAc2；

Hex5HexNAc4Fuc；

Hex3HexNAc4Fuc；

Hex4HexNAc4Fuc；

Hex6HexNAc5Fuc；以及

Hex5HexNAc5Fuc；

101.根据权利要求99所述的组合物，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的所述多糖种类选自由以下组成的组：

Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

Hex7HexNAc6FucNeuAc3；

Hex6HexNAc5FucNeuAc；

Hex5HexNAc4FucNeuAc；

Hex5HexNAc4Fuc；以及

Hex4HexNAc4Fuc；

102.根据权利要求99所述的组合物，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的所述多糖种类选自由以下组成的组：

HexHexNAc；

HexHexNAcNeuAc；以及

HexHexNAcNeuAc2；

103.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类的总百分比包括：

约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；以及

约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2；

104.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N187处的多糖种类的总百分比包括：

约60％至约70％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

约4％至约6％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

约7％至约10％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

约15％至约17％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

约0.5％至约1.5％的Hex4HexNAc4FucNeuAc；

约3％至约4％的Hex5HexNAc5NeuAc2；

约0％至约0.5％的Hex5HexNAc4Fuc；

约0％至约0.5％的Hex3HexNAc4Fuc；

约0％至约0.5％的Hex4HexNAc4Fuc；

约0％至约0.5％的Hex6HexNAc5Fuc；以及

约0％至约0.5％的Hex5HexNAc5Fuc；

105.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类的总百分比包括：

约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc；以及

106.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置N206处的多糖种类的总百分比包括：

约3％至约5％的Hex6HexNAc5FucNeuAc3；

约75％至约85％的Hex5HexNAc4FucNeuAc2；

约2％至约4％的Hex6HexNAc5FucNeuAc2；

约0.5％至约1.5％的Hex7HexNAc6FucNeuAc3；

约0％至约1％的Hex6HexNAc5FucNeuAc；

约5％至约12％的Hex5HexNAc4FucNeuAc；

约1％至约3％的Hex5HexNAc4Fuc；以及

约0.5％至约2％的Hex4HexNAc4Fuc；

107.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类的总百分比包括：

约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc；以及

约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2；

108.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物中所述多种多肽的在SEQ ID NO:1的氨基酸位置T212处的多糖种类的总百分比包括：

约0％至约1％的HexHexNAc；

约14％至约18％的HexHexNAcNeuAc；以及

约8％至约13％的HexHexNAcNeuAc2；

109.一种包含多种多肽的组合物，所述多种多肽中的每种多肽包含与IL-2Rα链的胞外部分融合的环状排列的IL-2，其中所述组合物具有如图15所示的毛细管等电聚焦(cIEF)曲线。

110.根据权利要求109所述的组合物，其在约pI 5.73、约pI 5.93、约pI 6.09、约pI6.28、约pI 6.38、约pI 6.48、约pI 6.53、约pI 6.66、约pI 6.82和约pI 7.02中的一个或多个处包含cIEF曲线峰。

111.根据权利要求110所述的组合物，其包含以下的峰面积百分比：

在pI 5.93处约8％至约12％；

在pI 6.09处约18％至约26％；

在pI 6.38处约22％至约26％；以及

在pI 6.66处约18％至约28％。

112.根据权利要求110所述的组合物，其包含以下的峰面积百分比：

在pI 5.73处约1.5％至约2.5％；

在pI 5.93处约8％至约12％；

在pI 6.09处约18％至约26％；

在pI 6.28处约3.5％至约4.5％；

在pI 6.38处约22％至约26％；

在pI 6.48处约3％至约5％；

在pI 6.53处约4％至约6％；

在pI 6.66处约18％至约28％；

在pI 6.82处约2％至约6％；以及

在pI 7.02处约0％至约3％。

113.根据权利要求110所述的组合物，其中在约pI 5.73处的峰包括在约pI 5.70和约pI 5.76处的峰的组合。

114.根据权利要求110所述的组合物，其中在约pI 5.93处的峰包括在约pI 5.89和约pI 5.97处的峰的组合。

115.根据权利要求99-114中任一项所述的组合物，其通过权利要求1-98中任一项所述的方法制备。