CN115323019A - 一种高通量基因合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量基因合成方法,所述高通量基因合成方法,包括以下步骤:对芯片表面进行处理,获得具有网格形状的微结构芯片,将所述微结构芯片清洗干燥后进行镀膜处理,制得亲疏水网格芯片;在所述亲疏水网格芯片的网格内采用喷墨打印方法合成DNA;将合成的DNA进行氨解、转移,然后进行拼接和扩增,获得高通量的合成基因。拼接和扩增产物可进一步组装成重组质粒。本发明中的合成方法简单,成本低、通量高且效率较高。理论上基因合成成本可降到0.35‑0.4元/bp,仅为当前主流合成成本的一半左右,一次性合成的寡聚核苷酸链可满足100‑1000条基因的拼接,可在短时间内合成大量基因。
Description
技术领域
本发明属于合成生物领域,具体涉及一种高通量基因合成方法。
背景技术
在合成生物学中,核心工作是改造或合成新的生命体,生产人类所需要的物质。合成生物学可广泛应用于农业、药物、材料、化妆品等领域。其中,基因元器件、基因线路、底盘细胞是合成生物的基础,这些均依赖于基因合成,而基因合成的成本、效率和质量,将严重影响合成生物在国内的发展速度。
目前国内的基因合成主要是基于传统的一代柱合成技术,其先通过柱合成方法合成60-120nt产品,然后通过扩增,拼接成1KB左右的基因。受柱合成的成本与合成效率的影响,其无法快速满足合成生物学对基因数量的需求。在国外,诸如Twist等公司也有基因合成服务,其在硅基芯片上一次合成通量达9600个基因,尽管价格已经从原来的1.5元/bp下降到了0.7元/p,但其远在美国,其交货效率和中间成本,仍然离合成生物学对大量低成本基因的需求有一定距离。此外,虽然Twist已经推出了全球第一款专用于基因合成的芯片,但因其涉及复杂的半导体制备工艺,芯片结构复杂,制作成本高昂,且需要一系列机械臂、微纳反应器等定制设备辅助完成基因合成工作,其技术壁垒较高,难以在缺乏先进半导体、微纳加工和高精度机械控制的国家和地区推广。因此,开发一款成本低,高通量的基因合成工艺,且合成技术不依赖先进半导体、微纳加工等技术,并能在广大发展中国家和地区推广,以满足合成生物学下游的科研、研发与生产需求,这是行业内亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种高通量基因合成方法,该种合成方法,成本低、通量高且效率较高。
根据本发明,提供一种通量基因合成方法,包括以下步骤:
对芯片表面进行处理,获得具有网格形状的微结构芯片,将所述微结构芯片清洗干燥后进行镀膜处理,制得亲疏水网格芯片;
在所述亲疏水网格芯片的网格内采用喷墨打印方法合成DNA;
将合成的所述DNA进行氨解、转移,然后进行拼接和扩增,获得高通量合成基因产物。
其中,所述拼接和扩增产物,可进一步经质粒组装成重组质粒。
根据本发明实施例的高通量基因合成方法,至少具有如下有益效果:该合成方法简单,成本低、通量高且效率较高。而海外的高通量合成公司,虽然通量高,但其依赖高端仪器设备,且人力、公司运营及中间成本过高,因而终端销售价仍然无法大幅下降。本申请的高通量基因合成方法,合成成本显著降低,理论上基因合成成本可降到0.35-0.4元/bp,只有当前主流合成成本的一半左右,一次性能合成的寡聚核苷酸链可满足100-1000条基因的拼接,可在短时间内合成大量基因。实现了在芯片上高通量DNA合成到高通量基因合成的过渡。
值得注意的是,本发明实施例中的高通量基因合成方法,采用了网格芯片,其解决了相关技术中的很大的问题,正常的芯片只能合成一个DNA池,其是大量DNA的混合物,而本发明的网格芯片中的网格可以达到分区或分离的目的,使得一个混合的DNA池可以用于基因合成,也即,一个网格合成一个基因,正常芯片是无法做到这样的高通量基因合成的。
需要说明的是,上述高通量的合成基因产物,可以是长度为0.5kb-3kb的合成基因,也可是组装后的重组质料。
可以理解的是,芯片的材质,可以是玻璃,硅,氧化硅,石英,金属,金属氧化物或塑料等,优选地,芯片的材质选自硅或玻璃。
可以理解的是,对芯片表面进行的处理,可以是刻蚀处理,包括激光刻蚀、强酸刻蚀、强碱刻蚀、电子束刻蚀或等离子刻蚀中的任意一种。
可以理解的是,上述提到的刻蚀处理中,强酸包括氟化铵、氢氟酸、氢氟酸盐等中的任意一种或多种,强碱包括氢氧化钠、氢氧化钾等中的任意一种或多种。
需要说明的是,对芯片表面进行处理使芯片表面形成具有特殊形貌的微结构,其微结构可以是圆柱体、锥形体、立方体、半圆体、棱台、抛物线、正弦或球形结构中的任意一种或多种。这些坑洼,可有效果提高芯片表面的粗糙度和表面积,在镀膜后,产生“荷叶效应”,显著提高微结构处理部分的疏水性。其中,微结构优选的是圆柱体网格。
根据本发明的一些实施例,所述微结构中,圆柱体、立方体、半圆体、球形结构的直径为(0.01-100)微米,锥形体、棱台、抛物线、正弦结构的最大宽度为(0.01-100)微米。
可以理解的是,上述直径或最大宽度(以下用直径/最大宽度表示)范围,可以选择0.01微米-0.1微米,0.1-1微米,1-10微米或者10-100微米。而其中,结构的深度和间距与直径/最大宽度相匹配,深宽比的范围,包括但不限于以下几种:1:1,3:1,5:1,10:1,20:1。间距与直径的比例,包括但不限于以下几种:2:1,2.5:1,3:1,不同尺寸的结构,会影响疏水性能的高低。
需要说明的是,网格的边缘具有刻蚀的微结构,经过镀膜后高度疏水,可有效抑制液体的流动与扩散。网格内经过镀膜后,可用于DNA的合成,其相对亲水,可用于DNA的成。而网格边缘的宽度与网格大小,与芯片适配。在标准的载玻片上,网格的宽度为0.01-5mm,网格的大小为1-15mm2,而在其他尺寸或更大的芯片上,网格大小可适当增大。
根据本发明的一些实施例,一张标准的2.5x 7.5cm的载波片,可以制作的网格,包括但不限于108个,1080个,10800个。其中,网格最终的数量和大小与芯片尺寸相匹配。
根据本发明的一些实施例,所述网格形状,包括圆形、椭圆、正方形、长方形、菱形、梯形或平行四边形中的任意一种或多种。
可以理解的是,一个网格内的所有DNA合成位点,构成一个簇。簇是由在同一个网格内的多个合成位点组成,数量可以是1,1-15,16-30条,31-60条,61-121条或更多。
可以理解的是,所述镀膜处理,包括溶液镀膜、物理真空镀膜或CVD气相镀膜中的任意一种。
需要说明的是,可选择在硅烷溶液中进行镀膜处理,所述硅烷,可选择3-氨丙基三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺硅烷、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三甲氧基硅烷、γ(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷、辛基氯硅烷、(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷、全氟辛基三甲氧基氯硅烷、正辛基三甲氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、C4-C18烷基硅烷或C4-C18烷基取代硅烷中的一种或多种。
可以理解的是,硅烷可以选择单一硅烷,或者包含两种的混合硅烷。其中,在一些实施例中,若选择混合硅烷,第一种硅烷,可以是氨基硅烷、羟基硅烷或环氧硅烷等,第二种硅烷,可以是C4-C18的烷基硅烷,全氟或部分氟取代的C4-C18的烷基硅烷,也可以是其他基团取代的C4-C18的烷基硅烷等。硅烷中的硅甲氧基(或硅乙氧基等基团)与芯片表面化学键合连接,包括芯片的网格与网格边缘。硅烷可以是三氯硅烷,二氯硅烷,一氯硅烷,三甲氧基硅烷,三乙氧基硅烷等中的一种或多种。氯硅烷与表面的OH发生化学反应,失去一个或多个HCL分子,与表面形成O-Si化学键,从而牢固地连接在表面。
第一种硅烷,是功能硅烷(例:N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)),主要为后续DNA合成提供合成点位,链接第一个碱基。
第二种硅烷,是辅助硅烷(例:全氟辛基三乙氧基硅烷),主要是用于提高芯片表面的疏水性。
根据本发明的一些实施例,合成DNA的方法,包括以下步骤:
先将所述亲疏水网格芯片的表面进行脱保护处理,清洗干燥后,通过喷墨打印方法打印第一碱基和催化剂;
然后将芯片表面先后在流体中流通加帽试剂、氧化试剂,并分别进行清洗干燥处理,再在芯片表面流通脱保护试剂;
重复打印第一碱基及后续的过程,以合成第二碱基至第N碱基。
需要说明的是,喷墨打印所使用的的喷头,包括但不限于压电陶瓷喷头,其中,满足单次喷液量在1-1000pl、频率在100-3000HZ之间的其他喷头均可使用。一个喷头处理一种试剂,喷头可以有单个或多个喷嘴,喷嘴数量可以是1,8,32,64,128,256,512,1024,2048个不等。本方法合成的DNA一般指的是单链DNA或寡聚核苷酸,长度一般为300bp以内。
根据本发明的一些实施例,所述氨解,包括以下步骤:将合成有DNA的芯片用溶剂清洗后,干燥处理,然后将芯片正面朝上放入氨解仪中,在(0.1-0.75)Mpa、(60-90)℃下氨解(1-4)小时或过夜氨解。
需要说明的是,氨解可以为气相氨解或液相氨解,若为气相氨解,所使用的气体包括氨气、甲基胺等,若为液相氨解,所使用的液体包括浓氨水,甲胺溶液,浓氨水与甲胺的1:1混合物,KOH溶液,Na2CO3溶液,乙醇胺等。
可以理解的是,吸取后的混合液体包含拼接一个基因所需的所有DNA单链,可直接用于PCR扩增或基因拼接。基因拼接一般是通过混合酶介导(Gibson Assemble)或连接酶介导(Golden Gate)的方式进行。
根据本发明的一些实施例,所述转移,包括以下步骤:首先在芯片的每一个网格内添加5-30ul纯水或常用生物缓冲液等水溶液,静止或轻微震荡5分钟,合成的一簇DNA从可表面通过分子扩散到上述溶液中,然后通过移液装置将网格内的水吸取到转移到标准的96,394或1536孔板内。可完美匹配下游单个基因单独拼接的需求。
需要说明的是,一个网格内有合成一个基因所需的DNA,此方法使得一个网格内的所有DNA在同一液滴内通过扩散混合在一起,并通过移液装置转移到了标准孔板内。解决了大量混合DNA合成后的分离或区分问题,同时可无缝适配标准孔板,方便整个流程的自动化实现,提高生产效率。而传统芯片法合成的DNA,通过得到的是一个DNA池的混合物,无法有效分区。要实现分区,需要用到复杂的芯片设计或微流体器件来实现,同时与下游设备使用的标准孔板不匹配,处理流程复杂,成本高且自动化程度低,导致最终的生产效率不高。
根据本发明的一些实施例,所述拼接和扩增,包括以下步骤:
(1)首先去除DNA三级结构;
(2)然后解除DNA的双链及单链空间位阻,再在(50-55)℃下进行同源片段或引物配对,并进行DNA段延伸补齐双链;
(3)重复步骤(2)5-10次;
(4)解除DNA双链及单链空间位阻,再在(56-60)℃下进行同源片段或引物配对,并进行DNA片段延伸补齐双链;
(5)重复步骤(4)20-30次;
(6)修复补齐DNA双链错配碱基。
根据本发明的一些实施例,将获得的所述高通量合成基因,进行质粒组装,所述质粒组装,包括5’方向的片段延伸和质粒重组两个步骤,
其中,所述5’方向的延伸,是通过PCR反应将质粒插入位点两侧的序列,添加至目标基因两侧,其中,扩增双端引物分别为:primer F:GACTGACTGACGATCTGCCT+基因片段5’至3’方向20bp长度片段、primer R:ATCCGATTTTGGAGGATGGT+基因片段3’至5’方向20bp长度片段。
根据本发明的一些实施例,所述质粒组装,第二步质粒重组,还包括将基因片段与质粒进行重组形成重组质粒过程,该过程包括以下步骤:
分别将载体片段和基因片段末端5’至3’方向DNA单链水解切除,基因片段末端与载体片段末端形成同源互补末端,然后将未形成DNA双链的末端区域补齐,最后将末端重组区域3’5’磷酸二脂键连接上形成完整的重组质粒。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,其中:
图1为本发明一实施例中具有108个网格的芯片;
图2为本发明一实施例中芯片微处理与液滴及簇的示意图(圆形网格);
图3为本发明一实施例中网格对液滴的限制效果实物展示图(圆形网格);
图4为本发明一实施例中具有1080个网格的芯片;
图5为本发明一实施例中具有10800个网格的芯片;
图6为本发明一实施例中拼接及扩增流程示意图;
图7为本发明一实施例中基于网格芯片的高通量基因合成及质粒组装和测序的全流程示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下面详细描述本发明的具体实施例。
实施例1
芯片刻蚀处理
选择长x宽的尺寸为75x25mm的芯片,用CAD画好直线阵列的108个网格,网格结构如附图1所示,放大其中一个网格,如附图1中的I所示,视图I中有24个合成位点,这24个位点构成一簇。单链DNA的合成是在合成位点上进行,完成后的基因拼接是以簇为单位进行,一个簇是一个基因。本芯片单次可合成1-2592个DNA,拼接成1-108个1Kbp左右的基因。按照上述108个网格的阵列工程图,采用皮秒激光对芯片特定区域进行表面蚀刻处理,得到网格状芯片,微处理的芯片表面(网格边缘)有10微米级的微结构。以圆形网格为例,芯片表面主要分刻蚀处理过的微结构区域和无微结构区域,如附图2所示。未刻蚀的圆形区域就是DNA合成的簇或合成位点所在的位置,附图3中使出了网格对液滴的限制效果实物图(以方形网格为例),图中的簇和液滴均为虚拟,用于解释说明,并非处理结果。
此外,还可用CAD画好直线阵列的1080个网格,网格结构如附图4所示,芯片上面均匀直线阵列1080个网格,两次放大其中一个网格,视图Ⅱ中有24个合成位点,这24个位点构成一簇。单链DNA的合成是在合成位点上进行,完成后的基因拼接是以簇为单位进行,一个簇是一个基因。本芯片单次可合成1-24480个DNA,拼接成1-1020个1Kbp左右的基因。并采用相同的方法对芯片表面进行刻蚀处理,得到网格状芯片。
此外,还可用CAD画好直线阵列的10800个网格,网格结构如附图5所示,芯片上面均匀直线阵列10800个网格,两次放大其中一个网格,视图Ⅱ中有24个合成位点,这24个位点构成一簇。单链DNA的合成是在合成位点上进行,完成后的基因拼接是以簇为单位进行,一个簇是一个基因。本芯片单次可合成1-241920个DNA,拼接成1-10080个1Kbp左右的基因。并采用相同的方法对芯片表面进行刻蚀处理,得到网格状芯片。
实施例2
液相单羟基硅烷镀膜的亲疏水网格芯片制作
取实施例1中制备的在(75x25)mm的芯片上布局有108个网格的芯片备用,放置在特制的清洗治具中,先分别用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液和体积配比为1%的Liquid清洗剂溶液超声清洗30min,再用纯水超声清洗3次,每次5min,清洗结束后,用氮气吹干,立刻打plasma等离子体清洗2min,功率为200W。
将打完等离子体的芯片立即放置于体积比为1‰的单羟基硅烷(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺)和无水乙醇的混合溶液中,将反应釜用保鲜膜封口,并放置在摇床上匀速振荡,室温条件下反应16小时,取出后先后用无水乙醇、水各超声清洗1min,然后氮气吹干,再100℃固化1小时,制得单羟基硅烷镀膜的亲疏水网格芯片。
进行质控分析:按照数量为1%的比例(至少2张)随机抽取镀膜后的芯片做水滴法接触角测试,多次测试不同粗糙度的两个区域的接触角,取平均值,合格的芯片中,两者之间的CA值相差10°以上。
实施例3
气相混合硅烷镀膜的亲疏水网格芯片制作
取实施例1中制备的在(75x25)mm的芯片上布局有108个网格的芯片备用,放置在特制的清洗治具中,先分别用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液和体积配比为1%的Liquid清洗剂溶液超声清洗30min,再用纯水超声清洗3次,每次5min,清洗结束后,用氮气吹干,立刻打plasma等离子体清洗2min,功率为200W。
然后采用CVD化学气相沉积法进行镀膜。将打完等离子体的芯片立即放置于含有200ul的单羟基硅烷(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺)和40ul的全氟烷基硅烷(全氟辛基三乙氧基硅烷)中,然后将硅烷溶液分别放置于腔体体积为30L的真空干燥箱中,进行抽真空处理,使腔体内的压力小于10mbar,然后保持该体系在60℃条件下反应15小时,再110℃条件下固化1小时,完成后取出芯片,先后用乙醇、水各超声清洗1min,然后用氮气吹干,制得混合硅烷镀膜的亲疏水网格芯片。
进行质控分析:按照数量为1%的比例(至少2张)随机抽取镀膜后的芯片做水滴法接触角测试,多次测试不同粗糙度的两个区域的接触角,取平均值,合格的芯片中,两者之间的CA值相差10°以上。
需要说明的是,实施例2和实施例3中的质控分析结果如下表所示:
从结果可以看出,两种方法镀膜处理后,芯片网格边缘与网格内接触角(CA)差异均达到40度以上,均形成了明显的亲水差异,且为网格内亲水,网格外疏水,可将亲水性或极性液体有效限制在网格内。
从网格边缘和网格内接触角差异大小来看,气相混合硅烷镀膜产生的接触角差异明显大于液相单羟基硅烷镀膜,可以更有效地起到限制液滴的作用,是优选的方案。
实施例4
基于喷墨带打印的高通量DNA合成
取实施例3中优选方案制作的亲疏水网格芯片备用,需要说明的是,在PL级喷墨设备上完成,采用改进的亚磷酸酰胺化学合成法,4种碱基和催化剂是通过独立喷头加液,其他辅助或清洗试剂通过流体加液。碱基,催化剂及其他试剂均可从商业途径获得。
合成的具体流程如下:
(1)偶联:先将表面用脱保护试剂脱去芯片表面的保护基团,裸露出表面的羟基活性基团,然后用乙腈清洗并氮气干燥,再通过喷墨设备打印上第一个碱基和催化剂。
(2)加帽:打印完第一碱基后,直接在芯片表面流通加帽试剂,封闭表面未反应的羟基活性基团,然后用乙腈清洗并氮气干燥。
(3)氧化:在芯片表面流通氧化试剂,将合成的DNA结构中的三价磷氧化成五价磷,然后用乙腈清洗并氮气干燥。
(4)脱保护:在芯片表面流通脱保护试剂,将DNA骨架上5位保护的的DMT基团脱去,让5位羟基裸露出来,以便进行第二个碱基的偶联。
(5)合成第二个碱基:其通过重复第一碱基的合成过程进行。
(6)第三个到第N个碱基的合成可通过重复上述第二碱基的合成流程从而得到。
值得注意的是,上述喷墨打印的碱基,在不同合成位点,可以是任意的A,G,C,T四碱基中的一种,其中第一,第二,到第N是相对同一个位点碱基数量的简单计数,与碱基种类无关。如此,可完成在芯片上不同网格区域内合成指定长度和指定数量的不同DNA序列。合成流程如下表所示:
实施例5
高通量合成基因产物的制备
将上述合成的芯片,用水,乙醇清洗后,氮气干燥,正面朝上放入气相氨解仪中,设定压力0.5Mpa,80度氨解2小时或过夜氨解。然后从氨解仪中取出芯片,平放在桌面,手动(或使用移液工作站)用移液器在每一个簇的中心位置加10ul水,静置5分钟后,让芯片上合成的DNA充分溶解在水中,再通过移液枪或自动化移液设备将含有DNA的水从芯片表面,移到相应的384孔板内,一个簇对应一个孔,并做好位置信息的记录。重复上述动作1次,尽量让表面的DNA充分溶解并转移到384孔板内。最后将384孔板放入冷冻干燥机,3000转,浓缩2小时,将产品进一步浓缩。由此,完成了108个簇的合成与后处理,然后通过108个簇的独立扩增,拼接与组装,可完成108个基因的合成。
将上述溶解后的DNA池利用同源重组原则将一个簇中的DNA依次配对形成聚合长链。通过DNA聚合酶链式反应(pcr)将聚合长链补齐至完整双链结构,再利用基因双端引物将拼接产物进行扩增,以增加产物总量。本发明可将基因片段的拼接和扩增在一个反应中完成,可以实现将拼接及扩增在同一反应中完成,并实现了将低浓度基因合成产物通过拼接及扩增一体式反应,将浓度从fmol级别提升至nmol级别,使得产物提升了两个数量级。其中所述DNA聚合酶为FusionDNA聚合酶,该酶具有5’至3’聚合酶活性,且具备3’至5’外切酶活性,酶的浓度0.2U至约3.5U的范围内,其中所述引物为基因全长序列双端5’至3’方向16至25碱基对。下表示出了本发明一个实施例所用到的反应体系及条件。
拼接及扩增流程如附图6所示。
扩增完成的基因通过pcr反应将质粒插入位点两侧的序列添加至基因两侧。扩增双端引物设计为,primer F:GACTGACTGACGATCTGCCT+基因片段5’至3’方向20bp长度片段,primer R:ATCCGATTTTGGAGGATGGT+基因片段3’至5’方向20bp长度片段。下表示出了本发明一个实施例所用到的pcr反应体系。
试剂 | 终浓度(50μL体系) |
DNA模板 | 1ng |
Primer F(10μM) | 2μL |
Primer R(10μM) | 2μL |
Phusion DNA聚合酶 | 0.5U |
dNTP | 4μM |
5×NEB Phusion buffer | 10μL |
ddH<sub>2</sub>O | 补充到50μL |
下表示出了本发明一个实施例所用到的反应条件及程序。
随后将基因片段与质粒进行重组形成重组质粒,过程基本如下:利用瓣状内切核酸酶分别将载体片段和基因片段末端5’至3’方向DNA单链水解切除,基因片段末端与载体片段末端形成同源互补末端,随后利用DNA聚合酶将未形成DNA双链的末端区域补齐,最后利用Taq连接酶将末端重组区域3’5’磷酸二脂键连接上形成完整的重组质粒。
该反应按照下表所示反应试剂及浓度进行装配,装配时应在冰上操作。
试剂 | 终浓度(50μL体系) |
基因片段 | 5nM |
载体片段 | 1nM |
5×NEB ligase buffer | 10μL |
T5瓣状核酸外切酶 | 5U |
Taq DNA连接酶 | 7.5U |
Phusion DNA聚合酶 | 0.5U |
dNTP | 4nM |
ddH2O | 补充到50μL |
完成装配后,将反应管置于混匀仪上充分混匀15s,结束后瞬时离心,将反应置于PCR仪上50℃加热,105℃热盖反应40min,反应结束后将连接产物置于冰上孵育10min,利用基因双端外侧16-25bp区域序列所设计引物进行pcr扩增,具体反应体系及反应程序如下表所示,反应结束后对pcr产物进行琼脂糖电泳检测,结果为单一大小符合条带且无弥散带即可。
该反应按照下表所示反应试剂及浓度进行装配,装配时应在冰上操作。
该反应按照下表所示程序进行操作。
将上一步琼脂糖检测完成的DNA产物,进行测序,以检测基因合成的准确性。其利用毛细管电泳的原理,将不同长度的DNA片段分离,根据不同长度的片段末端带染料碱基的特异性吸收峰,依次读出碱基排列结果。将检测结果与预设的基因序列进行比对,分析合成及拼接准确性。本发明一实施例示出的测序试剂配方如下表所示:
试剂 | 终浓度(50μL体系) |
DNA模板 | 1ng |
引物F或引物R(10μM) | 2μL |
Phusion DNA聚合酶 | 0.5U |
dNTP | 4μM |
ddNTP | 2μM |
5×NEB Phusion buffer | 10μL |
ddH<sub>2</sub>O | 补充到50μL |
本发明一实施例示出的测序流程如下表所示:
此外,为便于理解,附图7示出了基于网格芯片的高通量基因合成及质粒组装和测序的全流程。
上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (9)
1.一种高通量基因合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
对芯片表面进行处理,获得具有网格形状的微结构芯片,将所述微结构芯片清洗干燥后进行镀膜处理,制得亲疏水网格芯片;
在所述亲疏水网格芯片的网格内采用喷墨打印方法合成DNA;
将合成的所述DNA进行氨解、转移,然后进行拼接和扩增,获得高通量合成基因。
2.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述微结构,包括圆柱体、锥形体、立方体、半圆体、棱台、抛物线、正弦或球形结构中的任意一种或多种。
3.根据权利要求2所述的合成方法,其特征在于,所述微结构中,圆柱体、立方体、半圆体、球形结构的直径为(0.01-100)微米,锥形体、棱台、抛物线、正弦结构的最大宽度为(0.01-100)微米。
4.权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述镀膜处理,包括溶液镀膜、物理真空镀膜或CVD气相镀膜中的任意一种。
5.根据权利要求1至4任一项所述的合成方法,其特征在于,合成DNA的方法,包括以下步骤:
先将所述亲疏水网格芯片的表面进行脱保护处理,清洗干燥后,通过喷墨打印方法打印第一碱基和催化剂;
然后将芯片表面先后在流体中流通加帽试剂、氧化试剂,并分别进行清洗干燥处理,再在芯片表面流通脱保护试剂;
重复打印第一碱基及后续的过程,以合成第二碱基至第N碱基。
6.根据权利要求1至4任一项所述的合成方法,其特征在于,所述氨解,包括以下步骤:将合成有DNA的芯片用溶剂清洗后,干燥处理,然后将芯片正面朝上放入氨解仪中,在(0.1-0.75)Mpa、(60-90)℃下氨解(1-4)小时。
7.根据权利要求1至4任一项所述的合成方法,其特征在于,所述转移,包括以下步骤:首先在芯片的每一个网格内添加5-30ul纯水,静止或轻微震荡5分钟,然后通过移液装置将网格内的水吸取到转移到标准的96,394或1536孔板内。
8.根据权利要求1至4任一项所述的合成方法,其特征在于,所述拼接和扩增,包括以下步骤:
(1)首先去除DNA三级结构;
(2)然后解除DNA的双链及单链空间位阻,再在(50-55)℃下进行同源片段或引物配对,并进行DNA段延伸补齐双链;
(3)重复步骤(2)5-10次;
(4)解除DNA双链及单链空间位阻,再在(56-60)℃下进行同源片段或引物配对,并进行DNA片段延伸补齐双链;
(5)重复步骤(4)20-30次;
(6)修复补齐DNA双链错配碱基。
9.根据权利要求1至4任一项所述的合成方法,其特征在于,将获得的所述高通量合成基因,进行质粒组装,所述质粒组装,还包括将5’方向延伸后片段与质粒进行重组形成重组质粒过程,该过程包括以下步骤:
分别将载体片段和基因片段末端5’至3’方向DNA单链水解切除,基因片段末端与载体片段末端形成同源互补末端,然后将未形成DNA双链的末端区域补齐,最后将末端重组区域3’5’磷酸二脂键连接上形成完整的重组质粒。
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