CN115322176B - 一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1h-吲唑类化合物及其制备和应用 - Google Patents

一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1h-吲唑类化合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种2,3‑二氢苯并呋喃基取代的1H‑吲唑类化合物及其制备和应用，该类化合物可以选择性的抑制FGFR激酶的磷酸化，从而治疗与此激酶密切相关的恶性肿瘤，同时能减少不良反应；能够用于治疗FGFR酶相关的肿瘤或疾病。本发明中所公开的化合物如通式(1)表示。其中R1可以多种取代基选择。本发明所述的以FGFR为靶点的N‑取代苯甲酰胺类化合物对FGFR1激酶具有良好的抑制作用；可用于抗肿瘤药物，且抗肿瘤效果较好。

Description

一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物及其制备 和应用
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，尤其涉及一种N-取代(3-((6-(2,3-二氢苯并呋喃-5-基)-1H-吲唑-3-基)氨基)苯甲酰胺类结靶向FGFR 1小分子抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用。
背景技术
近十几年来，靶向治疗成为癌症治疗的研究热点之一，在靶向治疗中，酪氨酸激酶家族与肿瘤的发病有着密切的关系，蛋白激酶参与调节对细胞生长、增殖和生存至关重要的信号网络。在酪氨酸激酶家族中，表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)备受关注。第一代EGFR抑制剂如吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)治疗NSCLC患者一段时间后，不少患者都产生了对EGFR-TKI的耐药。
EGFR-TKI的耐药过程，触发了其他促增殖的受体酪氨酸激酶信号通路的激活。如FGFR和ALK通路。
成纤维生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor，FGFRs)介导的信号通路，不仅对于正常细胞的增殖、分化发挥作用，对于肿瘤细胞的生长和转移更是发挥重要的调节作用。FGFRs作为重要的抗肿瘤药物作用靶点，其小分子抑制剂的研发受到越来越多的重视。
在FGFR的四种类型中，FGFR1与肺癌关系最密切。大量体外研究和独立实验表明在非小细胞肺癌中存在FGFR1的基因扩增和FGFR1的过表达。在一项对59个非小细胞肺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织的定量RT-PCR实验中发现，肿瘤组织FGFR1的转录活性是癌旁组织的两倍多。吉非替尼耐药会激活FGFR通路(FGF2-FGFR1)。揭示FGF/FGFR的自分泌环的活化是促进阿法替尼耐药细胞存活和生长的补偿机制。
发明内容
本发明提供了一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物及其制备和抗肿瘤活性的应用，该N-取代(4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)-6-苯基-1H-吲唑-3-胺类靶向FGFR1抑制剂对FGFR 1具有较高的抑制活性，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物。
本发明采用如下技术方案：
一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物靶向FGFR1小分子抑制剂，化学结构如下：
其中：R1基团可以选自下列任一取代基团
R2可以选自H或Boc中的任意一种；以上R1、R2的取代基可以任意组合。
进一步地，所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物靶向DDR1小分子抑制剂为化合物DC1-DC13中的一种，DC1-DC13中的R2如表1-1所示：
表1-1化合物DC1-DC13结构与产率
化合物 R2
DC1 N-(2-(diethylamino)ethyl)
DC2 N-(3-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl
DC3 Furan-2-carboxamide
DC4 4-(4-ethylpiperazin-1-yl)benzamide
DC5 N-(4-(4-ethylpiperazin-1-yl)benzyl)
DC6 4-methylpiperidine
DC7 4-ethylpiperazine
DC8 2-formyl-1H-pyrrole-1-carboxamide
DC9 (4-fluorobenzyl)urea
DC10 1-phenylpiperidine
DC11 4-methoxybenzenesulfonamide
DC12 4-methylpiperazine-1-sulfonamide
DC13 3-phenylpropanamide
进一步的，所述的化合物为化合物DC4，化学结构如下：
本发明还提供了一种所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物的制备方法，包括以下步骤：
DC1,2,4合成步骤
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(10.15mmol)6-溴吲唑溶于20mL的无水THF，在冰浴下多次少量加入2.28g(20.30mmol)KOtBu，活化10分钟后再加入3.9g(15.37mmol)碘单质。在冰浴下继续反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)化合物D1、D2、D4的合成通法：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物D1、D2、D4。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
DC5合成步骤
1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(10.15mmol)6-溴吲唑溶于20mL的无水THF，在冰浴下多次少量加入2.28g(20.30mmol)KOtBu，活化10分钟后再加入3.9g(15.37mmol)碘单质。在冰浴下继续反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)中间体4的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体4。
(5)DC5的合成：取一个50mL两口烧瓶，取60.8mg(1.2mmol)的LAH，氮气保护，加入15mL的无水THF，在-78℃缓慢加入(0.4mmol)溶于无水THF的中间体4，加完后移至室温后过夜，用TLC监测反应进程判断反应终点。减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC5。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
DC3,11-13合成步骤
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，将2.02g(10.15mmol)4-溴-2-氟苯甲腈溶于20mL的无水正丁醇，再加入1.015g(20.30mmol)水合肼，于120℃下冷凝回流。用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为5h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)中间体4的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC3,DC11-DC13。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
DC10合成步骤
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，将2.02g(10.15mmol)4-溴-2-氟苯甲腈溶于20mL的无水正丁醇，再加入1.015g(20.30mmol)水合肼，于120℃下冷凝回流。用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为5h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，并加入25mL的无水CH2Cl2。将0.5g(2.44mmol)的1-苯基哌啶-4-羧酸加入反应瓶中，再加入1.113g(2.928mmol)的HATU和0.436(2.928mmol)TEA，30min后加入0.974g(2.44mmol)的中间体2，用TLC监测反应进程判断反应终点。
(4)DC10的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。
步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC10。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
DC6-9合成步骤
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。加入1mmol(311mg)的3-氨基-6-溴-1H-吲唑-1-羧酸叔丁酯，同时溶于无水THF15mL，再加入100mg的DIEPA，加入搅拌子，冰浴搅拌15min，后逐滴加入1.2mmol的酰氯，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不变或消失。反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。再加入15mL的无水DMF于双颈瓶中，冰浴冷却至0℃，再加入1mmol的中间体1和2mmol的K2CO3，反应30min，同时每隔5min点板监测，直至原料点不变或消失。反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2，直接用于下一步。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC3,DC11-DC13。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
本发明还提供了一种所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物抑制剂表现出一定的抗肿瘤活性。
作为进一步的优选，所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物为化合物D5。
作为进一步的优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗结肠癌或非小细胞肺癌。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提供了一类新的靶向FGFR1小分子抑制剂，该小分子抑制剂能有效抑制DDR1，可以作为一种有潜力的抗癌药物进行开发和研究。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1化合物的合成
1.1化合物的具体合成路线(路线中所列的碱、溶剂和缚酸剂仅仅为示例性的，不是对本发明的限制)如下所示:
反应式1.化合物DC1,2,4,5的一般合成方法
反应试剂和反应条件:(a)iodine,KOtBu,THF,0℃,2h；(b)(Boc)2O,DMAP,THF,rt,2h；(c)Pd2(dba)3,Xantphos,Cs2CO3,N2,toluene,6h.(d)Pd(pph3)4,NaOH,dioxane:H2O(4:1),N2,90℃,overnight.(e)THF,DIPEA,0℃to rt,3h.(f)Pd/C,H2,MeOH,4h.(g)DMSO,K2CO3,120℃,8h.(h)35％H2O2,DMSO,K2CO3.(i)LAH,THF,-78℃.
反应式2.化合物DC3,10-13的一般合成方法
反应试剂和反应条件:(a)Hydrazine hydrate,n-butanol，120℃,5 h；(b)(Boc)2O,DMAP,THF,0℃to rt,1 h；(c)THF,Py，0℃to rt,3 h.(d)Pd(pph3)4,NaOH,dioxane:(d)H2O(4:1),N2,90℃,反应过夜.(e)Cu(OAc)2,TEA,A molecular sieve,MeCN,80℃,12 h.(f)THF:H2O(2:1),NaOH,60℃,4 h.
反应式3.化合物DC6-9的一般合成路线
反应试剂和反应条件:(a)Phenyl chloroformate,THF,DIPEA,0℃to reflux,8h；(b)DMF,K2CO3,0℃,30 min；(c)i)Pd(pph3)4,K2CO3,dioxane:H2O(4:1),N2,90℃,反应过夜。
1.2.1DC1,2,4合成步骤示例
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(10.15mmol)6-溴吲唑溶于20mL的无水THF，在冰浴下多次少量加入2.28g(20.30mmol)KOtBu，活化10分钟后再加入3.9g(15.37mmol)碘单质。在冰浴下继续反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)化合物D1、D2、D4的合成通法：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物D1、D2、D4。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
1.2.2DC5合成步骤示例
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(10.15mmol)6-溴吲唑溶于20mL的无水THF，在冰浴下多次少量加入2.28g(20.30mmol)KOtBu，活化10分钟后再加入3.9g(15.37mmol)碘单质。在冰浴下继续反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)中间体4的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体4。
(5)DC5的合成：取一个50mL两口烧瓶，取60.8mg(1.2mmol)的LAH，氮气保护，加入15mL的无水THF，在-78℃缓慢加入(0.4mmol)溶于无水THF的中间体4，加完后移至室温后过夜，用TLC监测反应进程判断反应终点。减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC5。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
1.2.3DC3,11-13合成步骤示例
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，将2.02g(10.15mmol)4-溴-2-氟苯甲腈溶于20mL的无水正丁醇，再加入1.015g(20.30mmol)水合肼，于120℃下冷凝回流。用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为5h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL双颈瓶，放入搅拌子。称取1.4g(3.32mmol)中间体2，680mg N-乙基哌嗪苯胺，30.4mg(0.00332mmol)Pd2(dba)3,38.4mg(0.00664mmol)Xantphos，2.16g(6.64mmol)碳酸铯。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入20mL的甲苯，在70℃下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为6h。反应结束后，用EtOAc萃取(3×30mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体3。
(4)中间体4的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC3,DC11-DC13。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
1.2.4DC10合成步骤示例
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，将2.02g(10.15mmol)4-溴-2-氟苯甲腈溶于20mL的无水正丁醇，再加入1.015g(20.30mmol)水合肼，于120℃下冷凝回流。用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为5h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子。将2g(6.21mmol)中间体1溶于20mL的无水THF，加入1.7mL(7.45mmol)二碳酸二叔丁酯和76mg(0.621mmol)DMAP。在室温下搅拌反应。步骤二：用TLC监测反应进程判断反应终点，反应时间一般为2h。反应结束后，用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的50mL圆底烧瓶，放入搅拌子，并加入25mL的无水CH2Cl2。将0.5g(2.44mmol)的1-苯基哌啶-4-羧酸加入反应瓶中，再加入1.113g(2.928mmol)的HATU和0.436(2.928mmol)TEA，30min后加入0.974g(2.44mmol)的中间体2，用TLC监测反应进程判断反应终点。
(4)DC10的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应，过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC10。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
1.2.3DC6-9合成步骤示例
(1)中间体1的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。加入1mmol(311mg)的3-氨基-6-溴-1H-吲唑-1-羧酸叔丁酯，同时溶于无水THF15mL，再加入100mg的DIEPA，加入搅拌子，冰浴搅拌15min，后逐滴加入1.2mmol的酰氯，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不变或消失。反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体1。直接用于下一步。
(2)中间体2的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。再加入15mL的无水DMF于双颈瓶中，冰浴冷却至0℃，再加入1mmol的中间体1和2mmol的K2CO3，反应30min，同时每隔5min点板监测，直至原料点不变或消失。反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，EtOAc萃取(3×40mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得中间体2，直接用于下一步。
(3)中间体3的合成：步骤一：取一干净且干燥的25mL双颈瓶，放入搅拌子。称取200mg(0.4mmol)中间体3，0.8mmol各种取代基的苯硼酸，9.2mg(0.008mmol)Pd(pph3)4,32mg(0.8mmol)氢氧化钠。用三通阀抽真空，氮气置换三次，用注射器加入10mL的二氧六环和水(4:1)的混合溶剂。在90℃下搅拌反应,过夜。步骤二：反应结束后，用EtOAc萃取(3×20mL)，萃取液用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，减压浓缩，硅胶柱层析进一步纯化得产物DC3,DC11-DC13。浓缩后置于烘箱干燥，待产物干燥后，测量产率，将样品送质谱、核磁验证。待结构确认后，测量熔点与纯度。
1.3实验结果
合成的所有目标化合物结构如下表所示；
合成的包括活性化合物在内的目标化合物的MS、1H NMR和13C NMR等理化数据如下：
N-(2-(diethylamino)ethyl)-3-((6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)amino)benzamide(DC-1)
黄色固体，22.34％yield,m.p:76.5-77.9℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.07(s,1H),9.08(s,1H),8.24(t,J＝5.6Hz,1H),8.10(s,1H),7.99(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝9.8Hz,1H),7.60(s,1H),7.49(s,1H),7.46(d,J＝8.3Hz,1H),7.36–7.27(m,2H),7.22(d,J＝7.7Hz,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(t,J＝8.7Hz,2H),3.26(t,J＝8.7Hz,2H),3.17(s,2H),2.59–2.55(m,2H),2.53(s,4H),1.00–0.97(m,7H).ESI-MSm/z:470.3(M+H)+
6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-N-(3-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-1H-indazol-3-amine(DC-2)
黄色固体,25.29％yield,m.p:167.0-168.7℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.01(s,1H),8.94–8.58(m,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.58(d,J＝6.9Hz,1H),7.41(dd,J＝22.3,8.1Hz,3H),7.32–7.20(m,1H),7.10(d,J＝9.7Hz,2H),6.93(s,1H),6.84(d,J＝7.6Hz,1H),6.40(d,J＝6.8Hz,1H),4.55(d,J＝7.9Hz,2H),3.23(d,J＝7.5Hz,2H),3.11(s,4H),2.46(s,4H),2.21(s,3H).ESI-MSm/z:426.2(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)furan-2-carboxamide(DC-3)
黄色固体,19.39％yield,m.p:196.3-198.1℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.83(s,1H),10.76(s,1H),7.97(d,J＝1.0Hz,1H),7.77(d,J＝8.5Hz,1H),7.65–7.63(m,1H),7.61(s,1H),7.56(dd,J＝6.9,2.4Hz,1H),7.49–7.47(m,1H),7.34(dd,J＝8.6,1.3Hz,1H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),6.73(dd,J＝3.5,1.7Hz,1H),4.58(t,J＝8.7Hz,2H),3.26(t,J＝8.7Hz,2H).ESI-MSm/z:346.1(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-4-(4-ethylpiperazin-1-yl)benzamide(DC-4)
白色固体,25.21％yield,m.p:190.2-191.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.75(s,1H),10.53(s,1H),8.01(d,J＝8.8Hz,2H),7.76(d,J＝8.5Hz,1H),7.62(s,1H),7.58(s,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H),7.33(d,J＝9.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.9Hz,2H),6.88(d,J＝8.3Hz,1H),4.60(t,J＝8.7Hz,2H),3.34–3.29(m,4H),3.26(d,J＝8.7Hz,2H),2.52(s,4H),2.39(q,J＝7.1Hz,2H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):165.03,159.48,153.14,141.89,138.82,133.03,129.32,128.19,126.87,123.91,122.51,119.76,119.15,115.90,113.38,109.17,106.77,71.17,52.12,51.59,46.97,29.08,11.94.ESI-MSm/z:468.2(M+H)+
6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-N-(4-(4-ethylpiperazin-1-yl)benzyl)-1H-indazol-3-amine(DC-5)
黄色固体,28.39％yield,m.p:130.7-132.3℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.27(s,1H),10.26(s,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(s,1H),7.46(s,2H),7.35(d,J＝8.6Hz,2H),7.30(d,J＝8.6Hz,1H),7.00(d,J＝8.6Hz,2H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(t,J＝8.7Hz,2H),4.49(s,2H),3.81(d,J＝11.8Hz,2H),3.57(d,J＝10.9Hz,3H),3.26(d,J＝8.7Hz,2H),3.21–3.17(m,2H),3.11(s,2H),2.99(t,J＝11.4Hz,2H),1.26(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.74,158.74,158.47,155.81,148.74,148.70,143.00,132.64,130.73,128.60,128.24,126.95,123.93,121.50,118.66,117.52,115.95,115.18,111.30,109.18,106.85,71.21,50.60,50.10,46.17,45.80,29.01,8.79.ESI-MSm/z:476.2(M+Na)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-4-methylpiperidine-1-carboxamide(DC-6)
白色固体,26.49％yield,m.p:211.7-213.4℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.44(s,1H),8.95(s,1H),7.60(d,J＝25.9Hz,2H),7.46(d,J＝34.1Hz,2H),7.25(s,1H),6.85(s,1H),4.57(s,2H),4.15(s,2H),3.25(s,2H),2.80(s,2H),1.62(s,3H),1.08(s,2H),0.94(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.41,155.20,141.88,138.60,133.15,128.16,126.81,123.86,122.34,118.74,116.07,109.14,106.62,71.15,44.13,33.78,30.46,29.07,21.80.ESI-MSm/z:377.2(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-4-ethylpiperazine-1-carboxamide(DC-7)
白色固体,32.59％yield,m.p:187.1-188.6℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.54(s,1H),9.07(s,1H),7.66(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(s,1H),7.52(s,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),7.28(d,J＝8.5Hz,1H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),4.59(t,J＝8.6Hz,2H),3.53(s,4H),3.26(t,J＝8.6Hz,2H),2.41(d,J＝5.1Hz,4H),2.37(d,J＝6.9Hz,2H),1.05(t,J＝7.1Hz,3H).ESI-MSm/z:392.2(M+H)+
tert-butyl6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-3-(2-formyl-1H-pyrrole-1-carboxamido)-1H-indazole-1-carboxylate(DC-8)
白色固体,35.28％yield,m.p:185.2-187.0℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.15(s,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.64(d,J＝6.9Hz,1H),7.62–7.59(m,1H),7.57(d,J＝3.5Hz,1H),7.54(dd,J＝7.7,2.4Hz,1H),7.50(dd,J＝8.3,1.3Hz,1H),7.43(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),6.37(s,2H),4.57(t,J＝8.7Hz,2H),3.24(t,J＝8.7Hz,2H),1.60(s,9H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.78,152.31,141.59,140.73,133.07,132.61,132.26,132.00,131.48,131.41,128.75,128.66,128.36,126.97,123.91,121.49,120.98,117.83,111.39,109.27,82.28,71.23,28.99,27.86.ESI-MSm/z:374.2(掉Boc)
1-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-3-(4-fluorobenzyl)urea(DC-9)
白色固体,28.45％yield,m.p:183.5-185.2℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.35(s,1H),9.63(s,1H),8.36(s,1H),8.06(d,J＝8.6Hz,1H),7.61(d,J＝7.3Hz,1H),7.50(s,1H),7.46(d,J＝8.3Hz,1H),7.41(dd,J＝8.4,5.7Hz,2H),7.29(d,J＝8.6Hz,1H),7.19(t,J＝8.9Hz,2H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),4.59(t,J＝8.7Hz,2H),4.47(d,J＝5.8Hz,2H),3.26(t,J＝8.6Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):162.12,160.20,159.54,155.00,142.27,141.44,139.78,136.31,132.92,131.49,131.41,129.12,129.06,128.90,128.84,128.77,128.67,128.17,126.90,123.94,121.21,118.85,115.15,114.98,114.93,114.76,112.58,109.15,106.47,71.17,42.24,29.06.ESI-MSm/z:403.1(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-6-yl)-1H-indazol-3-yl)-1-phenylpiperidine-4-carboxamide(DC-10)
灰色固体,13.49％yield,m.p:90.2-91.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.46(s,1H),7.94(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(s,2H),7.45(d,J＝8.3Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,2H),6.98(d,J＝8.1Hz,2H),6.89(d,J＝8.2Hz,1H),6.78(t,J＝7.2Hz,1H),6.58(s,2H),4.60(t,J＝8.6Hz,2H),3.80(d,J＝12.2Hz,2H),3.27(t,J＝8.6Hz,2H),2.78(t,J＝11.8Hz,2H),2.03(d,J＝17.0Hz,2H),1.86(t,J＝10.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.36,159.84,152.78,151.08,142.24,140.14,132.41,128.92,128.42,127.04,123.97,122.56,121.00,118.64,115.90,112.40,109.28,71.26,48.30,28.96,27.50.ESI-MSm/z:439.2(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-4-methoxybenzenesulfonamide(DC-11)
白色固体,21.39％yield,m.p:212.2-214.0℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.63(s,1H),10.50(s,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,3H),7.57(s,1H),7.50(s,1H),7.42(d,J＝8.3Hz,1H),7.32(d,J＝8.6Hz,1H),7.05(d,J＝8.9Hz,2H),6.85(d,J＝8.3Hz,1H),4.57(t,J＝8.7Hz,2H),3.80(s,3H),3.24(t,J＝8.7Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):162.30,159.54,141.59,139.18,138.48,132.84,131.94,129.07,128.19,126.92,123.94,120.43,119.92,115.87,114.08,109.17,106.89,71.17,55.58,29.06.ESI-MS m/z:422.1(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-4-methylpiperazine-1-sulfonamide(DC-12)
白色固体,27.31％yield,m.p:194.5-196.3℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.75(s,1H),10.15(s,1H),7.83(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(s,1H),7.56(s,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),7.37(d,J＝9.7Hz,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(t,J＝8.7Hz,2H),3.25(t,J＝8.7Hz,2H),3.21–3.10(m,4H),2.31(s,4H),2.14(s,3H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.54,141.76,139.23,138.94,132.90,128.20,126.94,123.96,120.55,119.97,115.93,109.18,106.97,71.18,53.76,45.82,45.33,29.07.ESI-MSm/z:414.2(M+H)+
N-(6-(2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)-1H-indazol-3-yl)-3-phenylpropanamide(DC-13)
白色固体,31.37％yield,m.p:214.5-216.4℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.63(s,1H),10.39(s,1H),7.77(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(s,1H),7.52(s,1H),7.44(d,J＝8.3Hz,1H),7.30(t,J＝4.8Hz,5H),7.20(dd,J＝5.8,3.0Hz,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(t,J＝8.7Hz,2H),3.25(t,J＝8.7Hz,2H),2.98(t,J＝7.7Hz,3H),2.73(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.38,159.49,141.83,141.19,140.23,138.87,132.96,131.42,128.68,128.32,128.29,128.19,126.86,125.94,123.91,122.81,118.99,114.98,109.16,106.64,71.17,38.98,36.92,30.91,29.07.ESI-MSm/z:384.1(M+H)
本发明所合成目标化合物的性状及其溶解性如下：
目标化合物产率普遍较高。化合物DC1-13均为白色絮状固体；化合物易溶于乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、DMSO、DMF、DMAC；微溶于石油醚、甲醇、乙醇；不溶于甲苯。本发明合成的目标化合物，在MS谱图中均显示了[M+1]+峰，且信号较强，部分化合物存在着同位素峰。1H-NMR谱图结果显示，所有目标化合物的氢信号，以及其化学位移，在图谱上都能清晰的看出。以DMSO-d6为溶剂时，核磁氢谱数据显示完全，即化合物氢的理论个数，与核磁氢谱图上氢的个数相吻合；而以CDCl3为溶剂时，大多数的目标化合物的核磁氢谱数据显示不完全，核磁氢谱图上通常没有脲基胺上的两个氢。13C-NMR谱图结果显示，目标化合物碳峰位移及数目基本上与理论数据相符。
实施例2化合物抗肿瘤细胞活性(激酶实验)
2.1实验操作步骤
(1)配制1×Kinase buffer。
(2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为10μM，复孔检测，在384孔板中配置成100倍终浓度的溶液。然后用Echo550转移250nl到384反应板中备用。阴性对照孔和阳性对照孔中分别加250nl的100％DMSO。
(3)用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液。
(4)在化合物孔和阳性对照孔分别加入10μL的2.5倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加10μL的1×Kinase buffer。
(5)1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育10分钟。
(6)用1×Kinase buffer配制25/15倍终浓度的ATP和Kinase substrate的混合溶液。
(7)加入15μL的25/15倍终浓度的ATP和底物的混合溶液，起始反应。
(8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育25分钟。
(9)加入30μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。
(10)用Caliper EZ Reader读取转化率。
(11)加入30μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。用CaliperEZ ReaderⅡ读取转化率。计算公式：Inhibition＝(Conversion％_max-Conversion％_sample)/(Conversion％_max-Conversion％_min)*100。其中：Conversion％_sample是样品的转化率读数；Conversion％_min：阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；Conversion％_max：阳性对照孔比值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
2.2实验结果
表2：激酶实验结果
2.3实验结果分析
上述激酶实验筛选出了对FGFR 1效果好的化合物，其中DC4的在1μM下对FGFR 1的活性达到了55％。

Claims (4)

1.一种2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物，其特征在于，所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物为化合物DC4；
结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于治疗癌症。
3.根据权利要求2所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述癌症为肺癌。
4.根据权利要求3所述的2,3-二氢苯并呋喃基取代的1H-吲唑类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
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