CN115317604A - 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115317604A
CN115317604A CN202210962514.XA CN202210962514A CN115317604A CN 115317604 A CN115317604 A CN 115317604A CN 202210962514 A CN202210962514 A CN 202210962514A CN 115317604 A CN115317604 A CN 115317604A
Authority
CN
China
Prior art keywords
radiotherapy
glioma
preparation
sensitization
temozolomide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210962514.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN115317604B (zh
Inventor
解彦东
唐祥龙
刘宏毅
肖红
王臻
刘亮
王冉
刘明熙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Brain Hospital
Original Assignee
Nanjing Brain Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Brain Hospital filed Critical Nanjing Brain Hospital
Priority to CN202210962514.XA priority Critical patent/CN115317604B/zh
Publication of CN115317604A publication Critical patent/CN115317604A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115317604B publication Critical patent/CN115317604B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用。本发明针对胶质瘤放化疗联合治疗存在的瓶颈问题，率先构建了共载替莫唑胺和小干扰RNA分子(siMGMT)的放疗增敏阳离子纳米制剂，不仅改变了替莫唑胺在体内非分特异性分布，且通过siRNA干扰提高了胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，实现了同时增敏化疗和放疗的目的。本发明从耐药基因、放疗增敏及靶向用药等多层次发挥增敏胶质瘤放化疗治疗的作用，为构建胶质瘤靶向给药系统开辟了新的治疗策略。实现了抗癌药物分子、小干扰RNA以及放疗增敏剂的同步治疗，具有临床应用性，应用前景广阔。

Description

一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，其致残率和致死率高，患者的中位生存期小于16个月，对其治疗是世界公认的难题。近十多年，胶质瘤最有效且被广泛认可的标准治疗方案是：手术、烷基化试剂替莫唑胺进行化疗以及伽马射线进行联合放疗。但是由于脑胶质瘤易于耐药、易于耐辐射以及血脑屏障的存在，严重影响了放化疗的疗效。因此，提高脑胶质瘤细胞对替莫唑胺和放射线的敏感性，克服药物透过血脑屏障靶向到脑胶质瘤的限制，是目前胶质瘤治疗所面临的瓶颈问题，也是提高胶质瘤整体治疗疗效的关键。
O～6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)是胶质瘤对替莫唑胺耐药的主要原因，其参与替莫唑胺引起的DNA损伤修复，从而引起胶质瘤对替莫唑胺产生耐药性。针对此种现象，一系列小分子抑制剂如O6-苄基鸟嘌呤(O6BG)已被构建并发明出来，但是由于此类小分子抑制剂与替莫唑胺联用会增强血液毒性，从而下调治疗窗。因此，临床上暂时没有适合的解决方法。
缺氧作为胶质瘤细胞耐受辐射的主要原因，针对于此，目前常用的缺氧放疗增敏剂为硝基咪唑类。但是由于硝基咪唑类放疗增敏剂需要大剂量才能产生增敏作用，同时由于其非特异性分布的特点会导致严重的神经毒副作用。因此解决其脑靶向和药物使用剂量的问题，将有望提高其在胶质瘤治疗上的应用价值。
脑部肿瘤由于BBB和血脑肿瘤屏障的存在，以及脑肿瘤血管壁通透性弱等限制，目前临床应用的药物制剂均难以奏效，故发展更为有效的脑部肿瘤治疗药物具有重大医学价值和社会意义。纳米药物由于粒径可控、易于修饰，可有效负载基因药物和化疗药物，在治疗肿瘤方面已经取得很大的进展。当前，部分纳米载体递送化疗药物治疗肿瘤已经市售，如纳米制剂阿霉素、紫杉醇纳米制剂和白蛋白结合紫杉醇纳米粒注射液等。
因此，亟需提供一种能够主动靶向携带药物跨过血脑屏障靶向到脑胶质瘤细胞的药物，能够发挥放化疗协同作用，降低药物非特异性分布的同时，还降低了药物对机体的毒副作用的方案。
发明内容
为解决现有技术中存在的的上述技术问题，本发明提供一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用。所述靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂采用RGD肽修饰纳米载体，构建共载替莫唑胺、siMGMT和硝基咪唑类放疗增敏剂的纳米靶向给药系统，在有效靶向脑胶质瘤的同时，改变药物在体内的非特异性分布，提高胶质瘤化疗和放疗的敏感性。在降低药物毒副作用的同时，实现化疗和放疗同时增敏的目的。其中，RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸序列的一类短肽，能够与细胞表面的整合素受体特异性结合，可以介导药物的靶向运输。相比较正常细胞来说，胶质瘤细胞表面的整合素受体明显高表达，因此本发明RGD肽修饰的纳米载体能够与胶质瘤细胞特异性结合。与MGMT小分子抑制剂相比，RNA干扰具有高效、高特异性和低细胞毒性的特点，本发明将siMGMT(靶向O～6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶的小干扰核糖核酸)有效靶向递送到脑胶质瘤将有望逆转胶质瘤对替莫唑胺的耐药性。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂，所述靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂包括药物载体、抗肿瘤化疗药物和核酸药物；
所述药物载体包括溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、RGD-聚乙二醇-磷脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和式I所示放疗增敏脂质分子；
所述溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵和RGD-聚乙二醇-磷脂中的磷脂形成微囊，所述RGD-聚乙二醇-磷脂中的RGD修饰在微囊表面，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和式I所示放疗增敏脂质分子中疏水性硝基咪唑基团部份包裹在微囊内部；
式I所示放疗增敏脂质分子的亲水端在纳米制剂的外部。
所述药物载体为亲疏水自动组装的载体。
Figure BDA0003793201650000021
其中，n和m分别为聚合度；20≤n≤50，20≤m≤40。
所述药物载体装载抗肿瘤化疗药物和核酸药物。
进一步的，所述抗肿瘤化疗药物选自替莫唑胺、亚硝脲类、丙卡巴肼、长春碱类化疗药物中的一种或多种；优选的，所述抗肿瘤化疗药物为替莫唑胺。
进一步的，所述核酸药物选自RNA，DNA，反义核酸，质粒，干扰核酸，miRNA，核酶、siRNA等中的一种或多种；优选的，所述核酸药物为siMGMT。
进一步的，所述抗肿瘤化疗药物装载在微囊内部，所述核酸药物吸附在微囊表面。
本发明的第二个目的是提供一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的制备方法，所述制备方法为：
(1)合成式I所示放疗增敏脂质分子；
(2)将式I所示放疗增敏脂质分子与溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂、抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂自组装，透析纯化，得到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂；
(3)向负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中加入核酸药物，得到靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂。
进一步的，所述步骤(1)具体操作为：
(1)将L-谷氨酸-N-羧酸酐(Glu-NCA)和单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)以摩尔比率30～50:1溶解在氯仿中，室温下搅拌，开环聚合反应得到mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物；将mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物溶解在CF3COOH中，并加在HBr/AcOH混合物反应体系中反应，反应结束后，通过乙醚沉淀得到mPEG-P(Glu-COOH)；将mPEG-P(Glu-COOH)、EDCI、DMAP和Met以摩尔比1:50:10:42溶于DMF中，在室温下搅拌24h，粗产物在去离子水中以截留分子量7000Da透析除去杂质，冻干，得到式I所示放疗增敏脂质分子；优选的，所述HBr/AcOH混合物反应体系中，HBr占AcOH的33wt％；
进一步的，所述步骤(2)具体操作为：
将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂、式I所示放疗增敏脂质分子和抗肿瘤化疗药物完全溶解于DMSO中，得到混合物，所述溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂和式I所示放疗增敏脂质分子的质量比为4:1:1:8；将上述混合物缓慢滴入到超纯水中，磁力搅拌后以截留分子量7000Da透析纯化，得到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系；
进一步的，步骤(3)具体操作为：
60℃温度中，以氮/磷摩尔比不低于2.5的比例，将核酸药物加入到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中，得到靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂。
本发明所述氮磷比为摩尔比，其中的氮来自阳离子纳米制剂，磷来自核酸药物。
进一步的，所述步骤(2)所述抗肿瘤化疗药物为替莫唑胺，步骤(3)所述核酸药物为SiMGMT。
在某一个特殊的实施例中，步骤(3)具体操作为：
60℃温度中，以氮/磷为2.5的比例，将siMGMT加入到靶向胶质瘤负载替莫唑胺的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中30min，得到靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂。
在某一个特殊的实施例中，siMGMT和替莫唑胺的质量比为1：10～20。
本发明的第三个目的是提供前述靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
采用了上述技术方案，相比较现有临床用药，本发明的有益效果为：
本发明的纳米载体能够通过主动靶向携带药物跨过血脑屏障靶向到脑胶质瘤细胞。可同时包载化疗药物、基因治疗药物和放疗增敏药物，提高了药物的稳定性。在降低药物非特异性分布的同时，还降低了药物对机体的毒副作用，克服现有临床用药缺陷，实现化疗和放疗同时增敏的目的。
附图说明
图1为靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的制备及作用机制原理图；
图2为靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的电镜形貌表征；
图3为靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的粒径表征；
图4为靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的表面电位表征；
图5为靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂包载小干扰RNAsiMGMT的琼脂糖凝胶电泳结果；
图6为包载小干扰RNA siMGMT的靶向胶质瘤放疗增敏阳离子纳米制剂的WB结果；
图7为靶向胶质瘤放疗增敏阳离子纳米制剂的细胞集落实验结果；
图8为靶向胶质瘤放疗增敏阳离子纳米制剂的脑靶向实验结果；
图9为靶向胶质瘤放疗增敏阳离子纳米制剂联合放疗抑制胶质瘤生长的荧光素酶检测的附图；
图10为靶向胶质瘤放疗增敏阳离子纳米制剂联合放疗治疗后荷瘤裸鼠的生存期。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中：
所述Glu-NCA是指：L-谷氨酸-N-羧酸酐；
所述mPEG-NH2是指：单甲氧基聚乙二醇胺；
所述mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物是指：mPEG-聚(Glu-NCA)聚合物；
所述CF3COOH是指：三氟乙酸；
所述HBr/AcOH溶液是指：溴化氢醋酸溶液；
所述DMSO是指：二甲亚砜；
所述DMF是指：N,N-二甲基酰胺；
所述EDCI是指：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；
所述DMAP是指：4-二甲氨基吡啶；
所述Met是指：甲硝唑；
所述替莫唑胺结构式为，来源
Figure BDA0003793201650000051
阿拉丁。
实施例1靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的制备
以RGD修饰放疗增敏阳离子纳米制剂，构建共载替莫唑胺和siMGMT的纳米靶向给药系统，具体制备方法如下：
所选用的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：
Figure BDA0003793201650000061
n＝45，m＝22。
(1)L-谷氨酸-N-羧酸酐(Glu-NCA，1g)和单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2，200mg)溶解在氯仿(100mL)中，室温下搅拌72h。加入过量的乙醚，沉降并真空干燥所得产物mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物。
随后将2g mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物溶解到250ml CF3COOH中，加入HBr/AcOH(HBr占AcOH的42wt％)反应体系(50mL)中反应2h，并用乙醚沉淀得到mPEG-P(Glu-COOH)粉末。
将mPEG-P(Glu-COOH)(1.6g)，EDCI(2.4g)，DMAP(0.3g)和Met(1.8g)溶于150mLDMF中，mPEG-P(Glu-COOH)、EDCI、DMAP和Met的摩尔比为1:50:10:42。在室温下搅拌反应24h。粗产物在去离子水(7000Da)中透析除去杂质，最后冻干，得到mPEG-P(glun-mn)，即为所需的放疗增敏脂质分子，具体化学合成结构式如下：
Figure BDA0003793201650000062
本实施例中，n＝45，m＝22。
(2)
(2-1)制备靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂：将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂(1mg)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(0.25mg，厂家：西安瑞禧，规格：Mw＝7000-17000)、RGD-聚乙二醇-磷脂(0.25mg，厂家：西安瑞禧，规格：Mw＝2000)和(1)中制备的放疗增敏脂质分子(2mg)完全溶解于DMSO中，将上述混合物缓慢滴入到超纯水中，并磁力搅拌40min，后将载体7000Da透析纯化，得到具靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂；
(2-2)制备靶向胶质瘤的负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂：将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂(1mg)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(0.25mg，厂家：西安瑞禧，规格：Mw＝7000-17000)、RGD-聚乙二醇-磷脂(0.25mg，厂家：西安瑞禧，规格：Mw＝2000)和(1)中制备的放疗增敏脂质分子(2mg)和替莫唑胺(0.75mg)完全溶解于DMSO(2mL)中，将上述混合物缓慢滴入到超纯水中，并磁力搅拌40min，后将载体7000Da透析纯化，得到靶向胶质瘤负载替莫唑胺的放疗增敏阳离子纳米制剂，替莫唑胺的包封率为90.67％；
(3)在60℃温度中，以氮/磷为2.5的比例，将siMGMT(用量：0.068mg)加入到步骤(2-2)制备的负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中30min，得到靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂。本实施例的siMGMT双链序列：正义链GAUGGAUGUUUGAGCGACAdTdT，反义链UGUCGCUCAAACAUCCAUCdTdT(文献来源：Dualbioluminescence and near-infrared fluorescence monitoring to evaluatespherical nucleic acid nanoconjugate activity in vivo.Timothy L Sita,Fotini MKouri,Lisa A Hurley,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2017,114(16):4129-4134)。
实施例2：靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂形貌的表征
用透射电子显微镜观察实施例1步骤(2-1)制备的靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂的形貌，结果显示，实施例1制备得到的靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂构建成功，见图2。
实施例3靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂水力学直径的表征
利用马尔文粒度检测仪检测实施例1(2-1)制备的靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂水力学直径为85nm左右(样本1)；实施例1(2-2)制备的靶向胶质瘤的负载替莫唑胺的放疗增敏阳离子纳米制剂水力学直径为90nm左右(样本2)；实施例1(3)制备的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂的水力学直径为97nm左右(样本3)，见图3。
实施例4靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂表面电位的表征
利用马尔文检测仪检测实施例1(2-1)制备的靶向胶质瘤的放疗增敏阳离子纳米制剂表面电位约为20.5mv左右(样本1)；实施例1(2-2)制备的靶向胶质瘤的负载替莫唑胺的放疗增敏阳离子纳米制剂表面电位约为20.3mv左右(样本2)；实施例1(3)制备的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂的表面电位约为8.8mv左右(样本3)，见图4。
实施例5基因复合能力检测
具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例采用凝胶渗透电泳实验考察本发明所述的靶向胶质瘤的载siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂的基因复合能力。
实验方法为：称取0.8g的琼脂糖溶于40mL 1×TAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却，加入5μL的核酸染料溴化乙锭于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自然凝固。本实验设置6组实验组样品，分别采用实施例1所述方法制备，各组样品仅为实施例1步骤(3)中氮/磷分别为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0。以siMGMT(siRNA)为对照，将不同N/P的载siMGMT放疗增敏阳离子纳米制剂/siRNA复合物与2μL的Loading Buffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为110V进行电泳实验，常温下电泳10min。
实验结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂，在N/P为2.5时，已经可以完全负载siMGMT(见图5)。
实施例6蛋白下调能力检测。
为了考察本发明放疗增敏阳离子纳米制剂包载核酸后直接的蛋白下调作用，本实验以脑胶质瘤耐替莫唑胺U87细胞株为模型，考察实施例1制备的靶向胶质瘤的载siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂的蛋白下调效率。以PBS、Free siMGMT(纯siMGMT)为对照，培养耐替莫唑胺U87细胞密度为70～80％时，将靶向胶质瘤的载siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂以1μg/mL siMGMT的量加入到培养基中，37℃下培养8h，之后更换带有胎牛血清的新鲜培养基继续培养48h，提取蛋白，进行Western Blot实验。本发明所述的靶向胶质瘤的载siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂(实验组)，可以有效下调MGMT蛋白的表达(见图6)。
实施例7纳米制剂联合放射治疗对胶质瘤细胞增殖的抑制作用
为了考察空载放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗对胶质瘤增殖的抑制作用，本实验以脑胶质瘤U87细胞为模型，进行细胞集落实验。
设置空白对照组(PBS组)和加空载放疗增敏阳离子纳米制剂组(实验组)，所述加空载放疗增敏阳离子纳米制剂的制备方法为：将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂(1mg)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(0.25mg)、RGD-聚乙二醇-磷脂(0.25mg)和(1)中制备的放疗增敏脂质分子(2mg)完全溶解于DMSO(2mL)中，将上述混合物缓慢滴入到超纯水中，并磁力搅拌，后将载体透析纯化，得到靶向胶质瘤的空载放疗增敏阳离子纳米制剂；
实验方法为：向脑胶质瘤U87细胞中加入0.102mg/ml的空载放疗增敏阳离子纳米制剂，培养6h后给予放疗，放疗剂量为2Gy。更换培养基后继续培养13天，后细胞用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色。结果显示该放疗增敏纳米制剂可有效增敏放疗，抑制脑胶质瘤的增殖(见图7)。
实施例8靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂对脑胶质瘤的靶向作用
为了考察本发明实施例1制得的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂的脑胶质瘤靶向作用，本实验构建颅内原位胶质瘤裸鼠模型，进行靶向性检测。
实验方法为：雄性裸鼠5-6周龄，购买于北京华阜康。人胶质瘤原位移植模型(U87-Luci)，作为评估药物载体脑靶向性的有用模型而建立。允许动物在移植肿瘤细胞前1周适应新环境。肿瘤接种10天后，通过小动物活体成像仪确定肿瘤的大小。实验设置PBS组、FreeCy5-siRNA组以及共载替莫唑胺和Cy5-siRNA的放疗增敏阳离子纳米制剂(实验组)。FreeCy5-siRNA组制备方法为：采用Cy5荧光染料标记siRNA，将其以200ug/ml溶解于PBS中。实验组制备方法同实施例1，区别仅在于用Cy5荧光染料标记的siRNA替换实施例1中的siMGMT。以1mg/Kg当量的Cy5-siRNA尾静脉注射PBS、Free Cy5-siRNA以及共载替莫唑胺和Cy5-siRNA的放疗增敏阳离子纳米制剂(实验组)，给药4h后，取出脑组织进行荧光检测。结果显示，相比于Free Cy5-siRNA，本发明所构建的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和Cy5-siRNA的放疗增敏阳离子纳米制剂(实验组)可以更有效的靶向脑胶质瘤组织(见图8)。
实施例9靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗对在体胶质瘤增殖的抑制作用。
为了考察本发明实施例1制得的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗对在体胶质瘤增殖的抑制作用。本实验构建颅内原位胶质瘤裸鼠模型进行实验检测。
实验方法为：雄性裸鼠5-6周龄，购买于北京华阜康。人胶质瘤原位移植模型(U87-Luci)，作为评估共载放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗的有用模型而建立。允许动物在移植肿瘤细胞前1周适应新环境。肿瘤接种10天后，通过小动物活体成像仪确定肿瘤的大小，将裸鼠进行分组，实验设置替莫唑胺联合放疗组(对照组)以及实施例1制得的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗组(实验组)。接种肿瘤后第12、14、16天给药，给药方式为：通过尾静脉注射注射替莫唑胺(TMZ 10mg/kg)联合放疗组以及注射实施例1制得的靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂(51.4mg/kg)联合放射治疗。尾静脉给药后4h，进行2Gy放疗。3次给药后均进行放射治疗，放疗的总剂量为6Gy。后于接种肿瘤后第20天、第30天再次进行荧光素酶活体成像。肿瘤大小通过荧光素酶成像进行对比(见图9)。结果显示，相比于替莫唑胺+放疗组(对照组)，共载替莫唑胺和siMGMT放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗组(实验组)能够显著抑制胶质瘤的增殖。
实施例10靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗后颅内原位胶质瘤模型鼠生存期变化检测
上述实施例9靶向胶质瘤的共载替莫唑胺和siMGMT的放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗(实验组)后，上述实施例9的实验组生存期明显长于替莫唑胺联合放射治疗(对照组)(见图10)，证明实施例1所构建的靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂联合放射治疗相比较传统的替莫唑胺联合放射治疗更有效。
综上可以看出，本发明的纳米载体能够通过主动靶向携带药物跨过血脑屏障到达脑胶质瘤细胞。可同时包载化疗药物、基因治疗药物和放疗增敏药物。在降低药物非特异性分布的同时，克服现有临床用药缺陷，实现化疗和放疗同时增敏的目的。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂，其特征在于，所述靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂包括药物载体、抗肿瘤化疗药物和核酸药物；
所述药物载体包括溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、RGD-聚乙二醇-磷脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和式I所示放疗增敏脂质分子；
所述溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵和RGD-聚乙二醇-磷脂中的磷脂形成微囊，所述RGD-聚乙二醇-磷脂中的RGD修饰在微囊表面，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和式I所示放疗增敏脂质分子中疏水性硝基咪唑基团部份包裹在微囊内部；
Figure FDA0003793201640000011
其中，n和m分别为聚合度；20≤n≤50，20≤m≤40。
所述药物载体装载抗肿瘤化疗药物和核酸药物。
2.根据权利要求1所述的靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂，其特征在于，所述抗肿瘤化疗药物选自替莫唑胺、亚硝脲类、丙卡巴肼、长春碱类化疗药物中的一种或多种；优选的，所述抗肿瘤化疗药物为替莫唑胺。
3.根据权利要求1所述的靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂，其特征在于，所述核酸药物选自RNA，DNA，反义核酸，质粒，干扰核酸，miRNA，核酶、siRNA等中的一种或多种；优选的，所述核酸药物为siMGMT。
4.根据权利要求1所述的靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂，其特征在于，所述抗肿瘤化疗药物装载在微囊内部，所述核酸药物吸附在微囊表面。
5.一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
(1)合成式I所示放疗增敏脂质分子；
(2)将式I所示放疗增敏脂质分子与溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂、抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂自组装，透析纯化，得到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂；
(3)向负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中加入核酸药物，得到靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作为：
将L-谷氨酸-N-羧酸酐(Glu-NCA)和单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)以摩尔比率30～50:1溶解在氯仿中，室温下搅拌，开环聚合反应得到mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物；将mPEG-poly(Glu-NCA)聚合物溶解在CF3COOH中，并加在HBr/AcOH混合物反应体系中反应，反应结束后，通过乙醚沉淀得到mPEG-P(Glu-COOH)；将mPEG-P(Glu-COOH)、EDCI、DMAP和Met以摩尔比1:50:10:42溶于DMF中，在室温下搅拌24h，粗产物在去离子水中以截留分子量7000Da透析除去杂质，最后冻干，得到式I所示放疗增敏脂质分子；优选的，所述HBr/AcOH混合物反应体系中，HBr占AcOH的33wt％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体操作为：将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂、式I所示放疗增敏脂质分子和抗肿瘤化疗药物完全溶解于DMSO中，得到混合物，所述溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、RGD-聚乙二醇-磷脂和式I所示放疗增敏脂质分子的质量比为4:1:1:8；将上述混合物缓慢滴入到超纯水中，搅拌后以截留分子量7000Da透析纯化，得到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体操作为：60℃温度中，以氮/磷摩尔比不低于2.5的比例，将核酸药物加入到负载抗肿瘤化疗药物的放疗增敏阳离子纳米制剂体系中，得到靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)所述抗肿瘤化疗药物为替莫唑胺，步骤(3)所述核酸药物为，siMGMT；优选的，步骤(3)中加入的siMGMT和替莫唑胺的质量比为1：10～20。
10.权利要求1所述靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
CN202210962514.XA 2022-08-11 2022-08-11 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用 Active CN115317604B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210962514.XA CN115317604B (zh) 2022-08-11 2022-08-11 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210962514.XA CN115317604B (zh) 2022-08-11 2022-08-11 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115317604A true CN115317604A (zh) 2022-11-11
CN115317604B CN115317604B (zh) 2023-09-22

Family

ID=83924409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210962514.XA Active CN115317604B (zh) 2022-08-11 2022-08-11 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115317604B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115645532A (zh) * 2022-12-07 2023-01-31 中山大学附属第五医院 一种异噁唑衍生物在制备脑胶质瘤放疗增敏药物中的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009151539A1 (en) * 2008-05-24 2009-12-17 Sirnaomics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS
WO2012104822A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-09 Actelion Pharmaceuticals Ltd Combinations comprising macitentan for the treatment of glioblastoma multiforme
CN102782573A (zh) * 2009-11-22 2012-11-14 圣诺制药公司 在治疗和诊断中应用的稀土掺杂上转换纳米颗粒
US20140120157A1 (en) * 2012-09-19 2014-05-01 Georgetown University Targeted liposomes
CN105534908A (zh) * 2016-01-15 2016-05-04 徐州医学院 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体
CN107970447A (zh) * 2017-11-29 2018-05-01 徐州医科大学 具靶向和放疗增敏双重功能的脂质-聚缺氧放疗增敏剂
CN107982217A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 徐州医科大学 一种包载疏水性药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物、其制备方法及其应用
WO2022076545A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 University Of Washington Iron oxide nanoparticle for suppressing drug-resistant gene for the treatment of glioblastoma

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009151539A1 (en) * 2008-05-24 2009-12-17 Sirnaomics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS
CN102782573A (zh) * 2009-11-22 2012-11-14 圣诺制药公司 在治疗和诊断中应用的稀土掺杂上转换纳米颗粒
WO2012104822A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-09 Actelion Pharmaceuticals Ltd Combinations comprising macitentan for the treatment of glioblastoma multiforme
US20140120157A1 (en) * 2012-09-19 2014-05-01 Georgetown University Targeted liposomes
CN105534908A (zh) * 2016-01-15 2016-05-04 徐州医学院 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体
CN107982217A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 徐州医科大学 一种包载疏水性药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物、其制备方法及其应用
CN107970447A (zh) * 2017-11-29 2018-05-01 徐州医科大学 具靶向和放疗增敏双重功能的脂质-聚缺氧放疗增敏剂
WO2022076545A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 University Of Washington Iron oxide nanoparticle for suppressing drug-resistant gene for the treatment of glioblastoma

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BREANNE HOURIGAN等: "Multifuntional Nanotherapeutics for the Combinatorial Drug and Gene Terapy in the Treatment of Glioblastoma Multiforme", A THESIS PRESENTED TO THE GRADUATE SCHOOL OF CLEMSON UNIVERSITY *
LIN WEI等: "Brain tumor-targeted therapy by systemic delivery of siRNA with Transferrin receptor-mediated core-shell nanoparticles", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS (AMSTERDAM, NETHERLANDS), vol. 510, no. 1, XP029659376, DOI: 10.1016/j.ijpharm.2016.06.127 *
YANDONG XIE等: "A hypoxia-dissociable siRNA nanoplatform for synergistically enhanced chemo-radiotherapy of glioblastoma", BIOMATERIALS SCIENCE, vol. 10, no. 23 *
杨宇飞;肖红;赵亮;沈鸿;陈建芳;朱东亚;: "siRNA多位点逆转人神经胶质瘤细胞的多药耐药性", 中国癌症杂志, no. 04 *
王陈汉;孙文博;刘宇驰;阎华;钱春发;肖红;刘宏毅;: "人脑胶质瘤细胞的原代培养及基本生长特性", 临床神经外科杂志, vol. 14, no. 02 *
蔡文治;王卓;谢炜;潘建忠;居颂光;葛彦;: "CD40基因特异性沉默对脑胶质瘤细胞株U87增殖和迁移的影响", 苏州大学学报(医学版), vol. 32, no. 1 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115645532A (zh) * 2022-12-07 2023-01-31 中山大学附属第五医院 一种异噁唑衍生物在制备脑胶质瘤放疗增敏药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115317604B (zh) 2023-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peng et al. Codelivery of temozolomide and siRNA with polymeric nanocarrier for effective glioma treatment
Yu et al. Targeted iron nanoparticles with platinum-(IV) prodrugs and anti-EZH2 siRNA show great synergy in combating drug resistance in vitro and in vivo
Liu et al. Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy
Yin et al. Hypoxia-responsive block copolymer radiosensitizers as anticancer drug nanocarriers for enhanced chemoradiotherapy of bulky solid tumors
CN106177975B (zh) 具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在核酸药物中的应用
CN105055375B (zh) 具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统
CN105859990B (zh) 侧链含硫辛酰基的聚合物、其制备方法及由其制备的聚合物囊泡及其应用
CN107362370B (zh) 一种基于金纳米簇联合NGF siRNA治疗胰腺癌的方法
CN111632153A (zh) 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN115317604B (zh) 一种靶向胶质瘤的共载放疗增敏阳离子纳米制剂及其制备方法和应用
CN108126210A (zh) 一种单靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
Zhou et al. Stimuli‐Responsive Nanotechnology for RNA Delivery
Chen et al. Polyethylenimine modified graphene oxide for effective chemo-gene-photothermal triples therapy of triple-negative breast cancer and inhibits metastasis
Xie et al. A hypoxia-dissociable siRNA nanoplatform for synergistically enhanced chemo-radiotherapy of glioblastoma
Lu et al. Construction of carboxymethyl chitosan-based nanoparticles of hypoxia response for co-loading doxorubicin and tanshinone IIA
CN110204664B (zh) 一种共载药物和基因用阳离子聚合物及其应用
CN107823652B (zh) 一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途
CN107007550A (zh) 一种氧化还原响应性两亲性共聚物及其制备方法和应用
CN112336702B (zh) 一种药物载体及核酸类药物制剂
Huang et al. One-pot preparation of pH-and redox-responsive polymeric microgel as an efficient carrier for improved breast cancer therapy
Cui et al. Chemotherapeutic potency stimulated by SNAI1-knockdown based on multifaceted nanomedicine
CN107261156B (zh) 一种基于SANH的共载siRNA和阿霉素的MSR-1磁小体复合物及其制备方法
CN115025240B (zh) 一种蛋白聚糖修饰的纳米粒及其制备和应用
CN117025592B (zh) 一种靶向jfk的小干扰rna及其用途
CN101269223B (zh) 蒽环类药物纳米剂型及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant