CN115317499A

CN115317499A - 知母皂苷aiii在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用

Info

Publication number: CN115317499A
Application number: CN202211153985.2A
Authority: CN
Inventors: 袁芳艳; 李晓月; 高婷; 刘泽文; 刘威; 周丹娜; 杨克礼; 郭锐; 李畅; 田永祥
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: CN115317499B

Abstract

本发明属于中兽药技术领域，具体涉及知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用。申请人发现，知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌具有抑制生长和杀灭作用，其对副猪嗜血杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为512μg/ml、最低杀菌浓度为1024μg/ml，克服了化药、抗生素、疫苗等的毒副作用，在兽药、养殖业领域具有广阔的应用前景和开发价值。

Description

知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用

技术领域

本发明属于中兽药应用领域，具体涉及知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是副猪嗜血杆菌病的主要病原菌。目前见报道副猪嗜血杆菌有15个血清型，我国当前以血清4型和5型最为流行。

疫苗的使用是预防副猪嗜血杆菌造成损失的有效的方法之一。但是由于副猪嗜血杆菌血清型型的多样性和临床上无法分型株所占比例较大，加大了研制具有交叉保护力疫苗的难度。临床上多辅以抗生素对副猪嗜血杆菌病进行治疗，但是，抗生素的大量及不合理使用导致副猪嗜血杆菌的耐药问题变得越来越严峻。ADJLF等(2007)报道称，西班牙和英国分离副猪嗜血杆菌对头孢噻肟和头孢噻呋的敏感率均为90％以上；HEUVELINK A等(2018)发现，荷兰的副猪嗜血杆菌临床分离菌株大约75％的菌株对四环素耐药；张强(2015)报道从中国境内分离的138株副猪嗜血杆菌对恩诺沙星的耐药率为60.1％；Bingzhou Zhang(2019)对来自中国16个猪场的448株副猪嗜血杆菌进行耐药分析，发现超过80％菌株对磺酰胺耐药；孙华润等(2018)报道，在我国各地分离的104株副猪嗜血杆菌中有93.3％的菌株对复方磺胺甲氧嘧啶钠耐药。而且随着副猪嗜血杆菌在全世界范围的流行以及抗菌药的不合理应用，副猪嗜血杆菌的多重耐药性也愈加严重。ADJLF等(2007)发现西班牙分离的副猪嗜血杆菌中，23.3％的菌株可对8种以上的抗菌药产生耐药性。国内的李曦婷等(2015)于2015年－2016年，对辽宁地区9株分离菌株进行药敏试验，发现均具有多重耐药性，对3种以上的抗菌药耐药率高达100％，甚至有1株菌对10种抗菌药耐药；张悦等(2015)发现62株上海分离副猪嗜血杆菌菌株中，最多同时耐5种药物；魏海林等(2016)四川地区分离菌株进行药敏试验发现，对多种药物耐药有70株。

知母皂苷是知母的主要有效成分之一，具有解热、抗炎、降血糖等功能。知母皂苷及其苷元具有防治老年痴呆症、保护脑缺血损伤、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎、降血压、降血糖及降血脂等药理活性；知母中所含的烟酸，有维持皮肤与神经健康及促进消化道功能的作用；异芒果苷有明显的镇咳、祛痰、强心、利尿、明显的镇静作用；芒果苷有显著的抗炎作用。从知母叶中提得的芒果甙有明显的利胆作用；亦能抑制血小板聚集。华素制药与军科院放射与辐射医学研究所(2018)联合研制的中药1类新药知母皂苷BII口服可显著改善多种拟痴呆模型动物的学习记忆功能，其活性在某些方面优于临床一线治疗药物，未来有望成为疗效肯定、安全性好、具有我国自主知识产权的新型抗血管性痴呆药物。

但是知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌方面是否具有抗菌作用，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用，知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌有良好的抗菌作用，在副猪嗜血杆菌病的防治方面具有很好的应用潜力。

为实现上述目的，本采取以下技术方案：

知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用，包括以知母皂苷AIII为唯一有效成分或有效成分之一制备成抑制副猪嗜血杆菌的药物，或是制备成副猪嗜血杆菌的杀菌剂。

所述的副猪嗜血杆菌为血清5型副猪嗜血杆菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

本发明首次发现知母皂苷AIII具有抑制副猪嗜血杆菌生长和杀灭副猪嗜血杆菌作用。本发明首次证实了知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌有良好的抗菌效果，为开发高效预防和治疗副猪嗜血杆菌病的药物及饲料添加剂提供了实验依据，也为中药单体化合物在临床上对副猪嗜血杆菌病防治提供了新的思路和方法。

附图说明

图1为知母皂苷AIII抗副猪嗜血杆菌生长的生长曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市场购买。本发明实施例以副猪嗜血杆菌血清5型为例进行说明，本发明所述物质对其他的副猪嗜血杆菌也具有抑制和杀灭作用。

实施例1：知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

1、材料

TSB培养基、TSA培养基、Mueller-Hinton(MH)肉汤等均购自BD公司，小牛血清购自四季青公司，用于细菌培养、药敏试验等。

2、试验方法

参考肉汤倍量稀释法。

MIC板制备：无菌条件下，将2倍倍比稀释后不同浓度的知母皂苷AIII溶液分别加到3块无菌的96孔聚苯乙烯板的第1至第11孔，每孔50μl；第12孔不加药作为生长对照。

接种物制备：分别将副猪嗜血杆菌划线接种于含5％小牛血清的TSA平板上，37℃培养12h。随后分别挑取单菌落置于含5％小牛血清的TSB培养基，37℃震荡培养过夜；将培养好的菌液以1:1000转接到新的含5％小牛血清的TSB培养基中，37℃培养至吸光度A600为0.6时，5000r/min离心5min收集菌体，用相应的液体培养基重悬菌体，分别调整浓度至1×10⁸CFU/mL。用TSB液体培养基分别将上述菌悬液进行1:100稀释后，分别向3块无菌的96孔聚苯乙烯板第1孔至第11孔中加入50μl菌悬液，使每孔最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/mL，37℃培养箱中培养12-16h。

结果判定：在阴性对照孔无污染、阳性对照孔的细菌生长情况良好的情况下，以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度，即为待检菌的MIC值；吸取每孔菌液至TSA固体平板上，将平板至于37℃培养箱中培养24h，观察有无细菌生长，以平板计数少于5个菌落的药物浓度作为待检菌的MBC值。

3、结果

由表1可知，知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度为512μg/ml，最小杀菌浓度为1024μg/ml；知母皂苷AIII对猪胸膜肺炎放线杆菌(1型)和猪链球菌2型的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为1024μg/ml和2048μg/ml，但是对粪肠球菌却不敏感。说明知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌具有抗菌作用，但是对粪肠球菌却没有抗菌作用。

表1知母皂苷AIII对细菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

实施例2：知母皂苷AIII对副猪嗜血杆菌生长曲线的影响

MIC板制备：无菌条件下，将2倍倍比稀释后不同浓度的知母皂苷AIII溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板的第1至第11孔，每孔50μl；第12孔不加药作为生长对照。

接种物制备：将副猪嗜血杆菌划线接种于含5％小牛血清的TSA平板上，37℃培养12h。随后挑取单菌落置于含5％小牛血清的TSB培养基，37℃震荡培养过夜；将培养好的菌液以1:1000转接到新的含5％小牛血清的TSB培养基中，37℃培养至吸光度A₆₀₀为0.6时，5000r/min离心5min收集菌体，用相应的液体培养基重悬菌体，调整浓度至1×10⁸CFU/mL。用TSB液体培养基将上述菌悬液进行1：5稀释后，向第1孔至第11孔中加入50μl菌悬液，使每孔最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/mL，37℃培养箱中培养。

生长曲线绘制：接种菌液后的孔板置于37℃培养箱孵育，每隔2h取100ul菌液进行涂布含5％小牛血清的TSA平板活菌计数，每次涂布3个平板重复，取最终平均值。以时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制曲线。结果如图1所示，当知母皂苷AIII的浓度为2M时，完全抑制副猪嗜血杆菌的生长，当知母皂苷AIII的浓度为1M时，其能显著抑制副猪嗜血杆菌的生长。

Claims

1.知母皂苷AIII在制备抑制副猪嗜血杆菌的药物中的应用。

2.知母皂苷AIII在制备副猪嗜血杆菌杀菌剂中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的副猪嗜血杆菌为5型。

4.根据权利要求1或2所述的应用，所述药物或杀菌剂中的唯一有效成分为知母皂苷AIII。